Đặ t v ấn đề
Bệnh dịch tả lợn là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây lan nhanh và chỉ xảy ra ở lợn, với tỷ lệ mắc bệnh cao và gây xuất huyết ở nhiều cơ quan Trong trường hợp cấp tính, bệnh có thể dẫn đến chết hàng loạt lợn, gây thiệt hại lớn về kinh tế cho ngành chăn nuôi Xuất hiện hơn một thế kỷ trước, bệnh đã tồn tại ở nhiều quốc gia châu Á, châu Âu và châu Mỹ, và mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu và biện pháp phòng chống, bệnh dịch tả lợn vẫn tiếp tục gây thiệt hại nghiêm trọng Tại Việt Nam, bệnh được phát hiện từ năm 1923 và đã gây ra nhiều đợt dịch lớn Hiện nay, các biện pháp kỹ thuật phòng bệnh đã được áp dụng, nhưng vẫn gặp khó khăn do điều kiện thời tiết, chất lượng vắc xin và kỹ thuật tiêm phòng, dẫn đến bệnh xảy ra lẻ tẻ và ít thành ổ dịch lớn.
Do diễn biến phức tạp của bệnh nên yêu cầu sản xuất vắc xin phòng và trị bệnh là rất cấp thiết
Thị trường hiện nay có nhiều loại vắc xin DTL nhập khẩu và sản xuất trong nước, nhưng giá thành cao và chất lượng vắc xin giá rẻ không ổn định Tại Hanvet, vắc xin DTL nhược độc tế bào được sản xuất trên tế bào PK 15 với quy mô nhỏ, dẫn đến độ ổn định và đồng đều giữa các lô mẻ thấp, cùng với số lượng vi rút thu hoạch hạn chế Để mở rộng quy mô sản xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm, Hanvet đang nghiên cứu áp dụng công nghệ nuôi cấy tế bào trên chất mang Microcarrier cho vắc xin nhược độc Dịch tả lợn.
M ục đích nghiên cứ u
Đề tài được thực hiện nhằm mục đích:
Xây dựng được quy trình chuẩn nuôi cấy và sản xuất vi rút Dịch tả lợn nhược độc trên Microcarrier
Từ đó, đáp ứng được yêu cầu sản xuất vắc xin DTL trên quy mô công nghiệp
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Tình hình d ị ch b ệ nh trên th ế gi ới và trong nướ c
Tình hình d ị ch b ệ nh trên th ế gi ớ i
Bệnh dịch tả lợn là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm với tỷ lệ tử vong cao, từ 60-90%, và thường đi kèm với các bệnh như phó thương hàn và tụ huyết trùng Lợn mắc bệnh thường biểu hiện triệu chứng bại huyết, xuất huyết ở nhiều cơ quan, hoại tử và loét niêm mạc đường tiêu hóa Bệnh có thể tiến triển theo nhiều thể loại, bao gồm quá cấp, cấp tính, mạn tính và tiềm ẩn Đến nay, nguồn gốc của bệnh dịch tả lợn vẫn chưa được xác định rõ ràng, với hai quan điểm khác nhau đang tồn tại.
Bệnh xuất hiện lần đầu tiên ở Anh vào năm 1862 và sau đó lây lan sang các nước châu Âu như Đan Mạch và Thụy Điển vào năm 1887 Các nhà khoa học Mỹ cho rằng bệnh này có nguồn gốc từ châu Âu và đã lan rộng ra khắp thế giới, bao gồm cả khu vực Nam.
Mỹ năm 1899, Nam Phi năm 1900 (Fuchs, 1968)
Bệnh dịch tả lợn (DTL) vẫn đang là vấn đề nghiêm trọng tại nhiều quốc gia, gây thiệt hại kinh tế lớn Năm 1997, các nước như Đức, Hà Lan, Italia, Tây Ban Nha và Bỉ đã phải tiêu hủy hơn 10 triệu con lợn do dịch bệnh Tại Hà Lan, tình hình này vẫn tiếp tục ảnh hưởng đến ngành chăn nuôi lợn cho đến ngày 31 tháng
Năm 1997, Việt Nam ghi nhận 424 ổ dịch trong một năm Từ tháng 11 năm 1982 đến tháng 9 năm 1984, Cộng hòa Liên bang Đức đã xảy ra 1457 ổ dịch ở 248 đàn lợn giống, 777 đàn lợn thịt và 412 đàn hỗn hợp, với tổng cộng 395.000 lợn bị xử lý (Oleksiewicz & cs., 2003).
Theo OIE (1998), năm 1984 ở Mexico có 179 ổ dịch, Malaysia có 5 ổ dịch, Hàn Quốc có 45 ổ dịch
Từ năm 1999 đến 2009, chỉ có một số ổ dịch lẻ tẻ được ghi nhận tại khu vực phía Đông của EU Tuy nhiên, vào năm 2011, tình hình đã có sự thay đổi đáng kể.
2012 đến năm 2015 vẫn phát hiện ra một số ổ dịch Dịch tả lợn tại một số nước như: Lithuania, Latvia… (Postel & cs., 2018)
Từ năm 2014, dịch tả lợn vẫn tiếp tục bùng phát ở một số khu vực thuộc Caribê như Cuba, Cộng hòa Dominican và Haiti, cũng như ở Bolivia, Colombia, Ecuador và Peru Đặc biệt, lục địa châu Phi không ghi nhận bất kỳ ổ dịch nào (Oie, 2016).
Báo cáo mới nhất của OIE (tính đến tháng 1 năm 2017) cho thấy: tại châu
Mỹ chưa ghi nhận bất kỳ ổ dịch dịch tả lợn nào, trong khi các quốc gia như Canada, Chile, Guiana thuộc Pháp, Mexico và một số tỉnh miền Trung và miền Nam của Brazil đã có tình hình dịch bệnh này (Oie, 2017).
Bệnh dịch tả lợn là một bệnh lý phân bố toàn cầu, ảnh hưởng đến tất cả các quốc gia có hoạt động chăn nuôi lợn Theo nghiên cứu của Edwards (1998), chỉ có một số quốc gia như Australia, Canada, New Zealand, Ireland, Thụy Sĩ và các nước thuộc bán đảo Scandinavia được xem là không có sự xuất hiện của bệnh này.
Tình hình d ị ch b ệ nh ở Vi ệ t Nam
Ở Việt Nam, bệnh DTL được phát hiện vào các năm 1923 - 1924 bởi Houdenner (Đào Trọng Đạt & cs., 1985) và đến nay bệnh DTL vẫn là một trong
“4 bệnh đỏ” gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn ở nước ta
Bệnh DTL đã xuất hiện tại Việt Nam từ năm 1960, bắt đầu từ các tỉnh Nghệ An và Phú Thọ do việc vận chuyển lợn bệnh Đến năm 1973, dịch lan rộng ở 11 trại lợn quanh thành phố Hồ Chí Minh và năm 1974, 17 tỉnh phía Bắc ghi nhận thiệt hại nặng nề với hơn 40.000 con lợn chết, trong khi 15 tỉnh Nam Bộ cũng bị ảnh hưởng, dẫn đến cái chết của 145.078 con lợn (Trần Thị Tố Liên & Đào Trọng Đạt, 1985) Năm 1983, dịch tiếp tục bùng phát ở Hải Hưng Trong giai đoạn 1972 - 1973, dịch kéo dài ở Nghệ An và Hà Tĩnh do người dân mua lợn bệnh trong dịp Tết cổ truyền Tại các tỉnh Trung Bộ, dịch diễn ra mạnh mẽ từ năm 1976 đến 1978, với 17 ổ dịch vào năm 1976, 36 ổ dịch vào năm 1977, và 18 ổ dịch vào năm 1978 (Đào Trọng Đạt & cs., 1985).
Kể từ những năm 1980, việc triển khai tiêm phòng đồng bộ đã ngăn chặn sự bùng phát của các ổ dịch lớn, tuy nhiên bệnh vẫn tiếp tục tồn tại và có diễn biến phức tạp hơn Điều này dẫn đến nhiều thay đổi về triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và độ tuổi dễ bị nhiễm bệnh.
Nghiên cứu về bệnh DTL ở lợn cho thấy triệu chứng và bệnh tích có sự biến đổi phức tạp giữa các lứa tuổi khác nhau Bệnh thường diễn ra ở thể mạn tính và không điển hình, đặc biệt là do các chủng vi rút giảm độc lực Lợn nái chưa tiêm phòng và lợn con theo mẹ là những đối tượng dễ bị ảnh hưởng, trong đó lợn con là nhóm có tỷ lệ chết cao nhất.
Bệnh dịch tả lợn (DTL) ở Việt Nam diễn ra quanh năm, nhưng mức độ dịch bệnh thay đổi theo thời tiết và biến động đàn lợn Tỷ lệ tiêm phòng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự bùng phát của bệnh, khi lợn lớn có miễn dịch bị giết mổ và lợn con chưa kịp tiêm phòng làm tăng tỷ lệ lợn mẫn cảm Việc tiêm phòng theo mùa vụ và bổ sung thường xuyên giúp ổn định tình hình dịch bệnh, nhưng thực tế sản xuất gặp nhiều khó khăn khiến việc tiêm phòng chưa được thực hiện đầy đủ, dẫn đến sự xuất hiện của dịch tả lợn trong suốt năm.
Nghiên cứu của Nguyễn Phục Hưng (2019) về dịch tễ học bệnh dịch tả lợn cổ điển tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2014-2017 cho thấy hầu hết các tỉnh đều ghi nhận hai năm có hệ số dịch >1 Tỉnh Thái Bình có ba năm xuất hiện dịch, trong khi Sơn La và Nam Định chỉ có một năm có hệ số mùa dịch >1.
B ệ nh d ị ch t ả l ợ n
Vi rút d ị ch t ả l ợ n
2.1.1.1 Ngu ồn gốc vi rút Dịch Tả Lợn
Theo Salmon & Smith (1885), bệnh gây ra bởi một loại vi khuẩn, hai ông đặt tên là Bacillus cholera suis (tức Salmonella suis) Nhưng đến năm 1903,
Schweinitz và Dorset đã xác định tác nhân gây bệnh DTL là một loài vi rút, trong khi vi khuẩn Bacillus cholerae suis chỉ đóng vai trò phụ Năm 1947, Holmes đã đặt tên cho vi rút gây bệnh DTL là Tortor vi rút Trước đây, vi rút này được coi là thành viên của họ Togavirideae, thuộc giống Pestivirus, cùng với vi rút gây bệnh tiêu chảy ở bò (Bovine Viral Diarrhea Virus – BVDV) và vi rút gây bệnh Border ở cừu (Border Disease Virus – BDV) Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây về cấu trúc phân tử của Pestivirus cho thấy bộ gen của chúng thuộc họ Flaviviridae, dẫn đến việc xếp loại lại giống Pestivirus vào họ Flaviviridae.
2.1.1.2 Hình thái c ấu trúc của vi rút
Vi rút DTL là một loại ARN vi rút có vỏ bọc lipoprotein, có hình dạng cầu khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử Virion có đường kính từ 40-50 nm, với nucleocapside có kích thước 29 nm bao bọc sợi ARN dài 12KB Bề mặt virion được trang trí bằng các gai lồi 6-8 nm, đóng vai trò bảo vệ cho virus Ngoài ra, vi rút còn có hai glycoprotein E155 và E146 KD trên bề mặt, cùng với một nucleocapside protein 36KD Hệ số sa lắng của vi rút dao động từ 140s đến 180s (Nguyễn Bá Hiên & Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2012).
Hình 2.1 Cấu trúc vi rút DTL
2.1.1.3 Phân lo ại vi rút
Năm 1939, Geiger kết luận rằng không có sự khác biệt cơ bản về tính kháng nguyên giữa các chủng vi rút DTL, do đó không thể phân loại chúng thành nhiều loại khác nhau Tuy nhiên, từ những năm 1950, một số nghiên cứu đã phát hiện hiện tượng biến chủng của vi rút DTL, cho thấy rằng độc lực của các vi rút biến chủng thường thấp hơn so với vi rút ban đầu (Trần Đình Từ, 1990).
Theo Van (1998), các chủng vi rút DTL được phân chia làm 2 nhóm:
Nhóm 1: gồm các chủng vi rút cường độc Alfort, chủng C, chủng Thiverval
Nhóm 2: gồm các chủng 331 và nhiều chủng khác phân lập được từ những lợn bị bệnh thể mạn tính
Trong tự nhiên, có nhiều chủng vi rút với mức độ độc lực khác nhau Các chủng vi rút có độc lực cao thường gây ra bệnh cấp tính và có tỷ lệ tử vong cao, trong khi các chủng có độc lực trung bình thường gây bệnh ở thể á cấp tính hoặc mạn tính Đối với các chủng vi rút có độc lực thấp, chúng thường chỉ gây tỷ lệ tử vong cao ở bào thai và lợn sơ sinh.
Theo Dunn (2000), độc lực của vi rút thường không ổn định và có thể được tăng cường sau một hoặc nhiều lần tiêm truyền qua lợn.
Hiện nay, nhiều phương pháp đã được áp dụng để giảm độc lực của virus, dẫn đến việc phát triển các chủng nhược độc có thể sử dụng làm vắc xin, bao gồm virus DTL chủng C, chủng GPE (-) và chủng Thiverval.
Bảng 2.1 Kiểm tra độc lực của vi rút DTL
Loại vi rút TN Vi rút độc lực cao
Vi rút độc lực trung bình
Vi rút có độc lực thấp
Thể bệnh Cấp tính, tỉ lệ chết cao Á cấp tính, mạn tính
Mạn tính hoặc không biểu hiện, gây chết thai và lợn con mới sinh Nhiệt độ nuôi cấy 39 - 40 o C 35 - 38 o C 33 - 34 o C
Nuôi trong môi trường tế bào
Nhân lên nhanh, điểm huỳnh quang lớn, rõ
Nhân lên chậm, huỳnh quang yếu ớt Có thể xuất hiện trong máu hoặc không
Trong cơ thể động vật
Nồng độ vi rút trong máu cao, thời gian tồn tại khá dài Thường nhiễm vào tế bào biểu mô, tếbào lưới, đại thực bào trong hạch Amidan
Thường giới hạn ở các tế bào biểu mô mạch quản
2.1.1.4 Đặc tính nuôi cấy phân lập
Khi tiêm truyền vào cơ thể lợn, các chủng vi rút DTL vẫn giữ nguyên đặc tính gây bệnh và miễn dịch Theo Moenning (1988), sự thích nghi của vi rút với các loài động vật khác nhau có thể làm thay đổi tính gây bệnh của vi rút đối với lợn Trong số các loài động vật, thỏ được chú ý đặc biệt trong việc chế tạo các chủng vi rút vắc xin nhược độc.
Vi rút DTL có khả năng nhân lên không chỉ trong tế bào lợn mà còn trong các tế bào động vật khác, với dòng tế bào thận lợn PK - 15 và SK - 6 là lựa chọn lý tưởng cho việc nuôi cấy Những chủng vi rút DTL cường độc thường không gây bệnh tích tế bào (CPE) trong môi trường nuôi cấy, và các chủng được cho là gây bệnh lý tế bào thường bị tạp nhiễm bởi vi rút khác Terpstra (1991) đã chỉ ra rằng tác động gây CPE chỉ xuất hiện khi có sự hiện diện của Adenovirus.
2.1.1.5 S ự nhân lên và phương phức lây lan của vi rút
Vi rút DTL nhân lên trong nguyên sinh chất của tế bào mà không gây bệnh tích tế bào Sau khoảng 5-6 giờ từ khi nhiễm, thế hệ đầu tiên của vi rút được giải phóng Theo nghiên cứu của Satkamp (1998), vi rút lây lan sang các tế bào lân cận và từ tế bào mẹ sang tế bào con thông qua cầu nối nguyên sinh chất, dẫn đến việc không thể phát hiện kháng nguyên vi rút trên bề mặt tế bào nhiễm.
Lợn là loài vật chủ duy nhất mang mầm bệnh vi rút DTL, và sự tiếp xúc giữa lợn bệnh với lợn mẫn cảm là phương thức lây truyền chính Vi rút có thể lây lan từ đàn này sang đàn khác qua nhiều đường khác nhau, trong đó việc nhập đàn lợn mang mầm bệnh là phổ biến nhất Bệnh có thể lan truyền từ các trại chăn nuôi hoặc qua các phương tiện vận chuyển bị nhiễm vi rút Ngoài ra, vi rút cũng có thể được truyền qua thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt, cũng như từ người chăn nuôi, nhân viên thú y và các dụng cụ, trang thiết bị thú y Tuy nhiên, vi rút ít có khả năng lây lan qua không khí giữa các đàn lợn.
M ộ t s ố đặc điể m d ị ch t ễ h ọ c b ệ nh DTL
Trong tự nhiên, lợn (bao gồm cả lợn rừng và lợn nhà) là loài duy nhất mắc bệnh DTL ở mọi lứa tuổi Nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy lợn con theo mẹ và lợn cai sữa có tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất Đặc biệt, lợn nái thường nhiễm những chủng virus có độc lực thấp, gây ảnh hưởng đến thai và sơ sinh.
Trong phòng thí nghiệm, việc tiêm truyền virus cho lợn mẫn cảm dẫn đến triệu chứng và bệnh tích tương tự như trong tự nhiên Khi tiêm virus vào thỏ và chuột lang, bệnh thường ở thể ẩn tính và có khả năng tái phân lập virus sau vài ngày Nếu tiêm truyền cho thỏ qua nhiều thế hệ (khoảng 150 đời), sẽ tạo ra một chủng virus nhược độc, không gây hại cho lợn nhưng vẫn giữ được đặc tính kháng nguyên, từ đó được sử dụng để chế tạo vắc xin nhược độc DTL.
Lợn khỏe mạnh mang trùng đóng vai trò quan trọng trong dịch tễ học bệnh DTL cổ điển, đặc biệt ở vùng có virus độc lực thấp, nơi thường xuất hiện các thể bệnh không điển hình Điều này tạo ra nguồn tàng trữ mầm bệnh nguy hiểm Khi lợn nái mang thai bị nhiễm, bào thai có thể chết lưu, hoặc lợn con sinh ra yếu ớt và dễ chết sau khi sinh Những lợn con này có khả năng lây nhiễm cho các lứa đẻ sau và có thể mang virus suốt đời, gây khó khăn trong công tác phòng chống bệnh.
Nghiên cứu dịch tễ học cho thấy bệnh DTL xảy ra ở lợn mọi lứa tuổi, nhưng chủ yếu tập trung ở lợn con theo mẹ và lợn mới cai sữa Theo Đào Trọng Đạt & Trần Thị Tố Liên (1989), do đàn lợn đã được tiêm phòng vắc xin nhiều năm, nên tuổi mắc bệnh phụ thuộc vào sức đề kháng và tình trạng miễn dịch của đàn lợn Điều này khác với tình trạng lây lan mạnh mẽ trong quá khứ, khi lợn ở mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh, với tỷ lệ chết lên tới 100% trong các ổ dịch.
Tố Liên & Đào Trọng Đạt, 1985)
Bệnh DTL, theo Đào Trọng Đạt và Trần Thị Tố Liên (1989), xuất hiện quanh năm nhưng có sự biến động theo đàn lợn, dẫn đến sự gia tăng và giảm sút của bệnh Thống kê của Độ (1980) cho thấy, tại các tỉnh miền Bắc, 80% số ổ dịch xảy ra từ tháng 11 năm trước đến tháng 2 năm sau, trong khi các tháng còn lại chỉ chiếm khoảng 20%.
Theo Cục Thú y (2013), dịch bệnh xảy ra quanh năm nhưng có sự biến động rõ rệt giữa các tháng Tình hình dịch bệnh bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm tỷ lệ tiêm phòng, số lượng lợn đã bị giết thịt và số lợn con chưa được tiêm phòng, dẫn đến sự gia tăng số lượng cá thể mẫn cảm với bệnh DTL trong khu vực.
Vi rút có thể xâm nhập vào cơ thể lợn qua nhiều con đường khác nhau, bao gồm đường tiêu hóa, niêm mạc mắt, mũi, sinh dục, hô hấp và qua các vết thương trên da; một số nghiên cứu còn cho rằng vi rút có khả năng đi qua nhau thai Theo Nguyễn Lương (1997), các phương pháp tiêm truyền trong phòng thí nghiệm như tiêm dưới da, tiêm bắp, tiêm phúc mạc, cho ăn và hít thở đều cho kết quả khả quan trong việc nghiên cứu vi rút.
Các trường hợp lây nhiễm bệnh tự nhiên với các chủng vi rút có độc lực cao thường trải qua nhiều pha, bao gồm nhiễm vi rút ở hạch, máu và các cơ quan nội tạng Vi rút xâm nhập từ tế bào thượng bì trong các hạch lâm ba và hạch amidan vào mô lympho, sau đó được vận chuyển qua đường bạch huyết đến các hạch lympho vùng, nơi chúng nhân lên nhanh chóng Lượng vi rút lớn được sản sinh tại các mô bào đích như lách, hạch lâm ba nội tạng, tủy xương và đường tiêu hóa, dẫn đến nồng độ vi rút cao trong máu Vi rút cũng xâm nhập vào các cơ quan khác như hệ hô hấp và hệ thần kinh trung ương, gây ra hiện tượng thực bào do đại thực bào Sự nhân lên của vi rút trong bạch cầu và các tế bào hệ thống lưới nội bì làm giảm bạch cầu, khiến lợn dễ bị nhiễm khuẩn thứ phát Theo Trần Đình Từ (1990), các chủng vi rút có độc lực cao có khả năng lây nhiễm từ khi xâm nhập vào cơ thể và lan tỏa ra các cơ quan khác trong vòng 5 - 6 ngày.
Xuất huyết trong bệnh DTL cấp tính xảy ra do thoái hóa tế bào nội bì và biểu bì mạch máu do virus, dẫn đến giảm tiểu cầu và rối loạn tổng hợp sợi fibrin Quá trình này hình thành các cục máu đông nhỏ, gây tắc nghẽn tuần hoàn và xuất huyết lấm tấm Virus cũng gây ra mụn loét ở niêm mạc ruột già, với những mụn loét dày lên, hình cúc áo do sợi huyết đông đặc lại, tạo thành các hình tròn đồng tâm.
Cách lây nhiễm của các chủng vi rút có độc lực trung bình tương tự như các chủng có độc lực cao, nhưng quá trình diễn biến chậm hơn Trong giai đoạn lâm sàng của bệnh, nồng độ vi rút trong huyết thanh thường thấp hoặc không có, và kháng nguyên vi rút thường chỉ xuất hiện ở các mô biểu mô, hạch amidan, tuyến nước bọt, hồi tràng và thận.
Sự xuất hiện của kháng thể đặc hiệu được xác định qua sự giảm thiểu vi rút DTL trong huyết thanh Các chủng vi rút có độc lực thấp thường chỉ gây ra những biến đổi tại hạch bạch huyết và trong tuần hoàn cục bộ.
Lợn nái mang thai mắc bệnh có khả năng truyền vi rút cho bào thai ở mọi giai đoạn phát triển Vi rút thường lây lan qua đường máu, phát triển dọc theo nhau thai và lây truyền giữa các bào thai Ở bào thai, vi rút phân bố trong các cơ quan nội tạng và đường máu giống như ở lợn nhiễm bệnh sau sinh Hậu quả của sự lây nhiễm từ bào thai có thể khác nhau, phụ thuộc vào tuổi thai và độc lực của vi rút.
Trong 45 ngày đầu sau khi thụ thai, bào thai có nguy cơ cao gặp phải hiện tượng chết trước khi sinh hoặc bị lây nhiễm dai dẳng với đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ hơn so với những bào thai bị nhiễm ở 65 ngày hoặc muộn hơn Những bào thai nhiễm virus có độc tính trung bình thường biểu hiện triệu chứng bệnh khi sinh hoặc ngay sau đó, trong khi bào thai nhiễm virus có độc lực thấp có thể thải virus mà không có triệu chứng rõ ràng.
Sau khi vi rút xâm nhập, hệ thống nội bì của thành mạch quản trải qua nhiều biến đổi, bao gồm sự sưng to của các tế bào do thủy thũng và giãn rộng các mạch quản ngoại biên Một số mạch có thể bị tắc, dẫn đến các bệnh tích đặc trưng của bệnh DTL như xung huyết, xuất huyết, nhồi huyết, hoại tử, viêm não - màng não và thoái hóa tế bào nội bì Tình trạng nghẽn mạch và thâm nhiễm lymphocyte cũng thường thấy ở 70 - 90% các trường hợp lợn bị chết.
Tri ệ u ch ứ ng và b ệ nh tích b ệ nh DTL
2.2.3.1 Tri ệu chứng lâm sàng
Thể này thường gặp ở đầu ổ dịch, lợn con mẫn cảm với thể bệnh này hơn lợn trưởng thành
Con vật ủ rũ sốt cao độ, sốt kịch liệt, chết nhanh khi chưa xuất hiện triệu chứng đặc trưng (Nguyễn Bá Hiên & Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2012)
Thường gặp, thời gian nung bệnh từ 2 đến 4 ngày;
Con vật có các triệu chứng chung: ủ rũ, mệt mỏi, kém ăn hoặc không ăn, kém vận động, sốt cao 41 - 42 0 C, kéo dài từ 3 - 5 ngày
Lợn con thường nằm chồng chất ở góc chuồng, và trong những đàn lợn nhạy cảm, bệnh có thể khởi phát ở một số con nhưng sau 10 ngày sẽ lây lan toàn đàn Vi rút tấn công bộ máy tiêu hóa khiến lợn có triệu chứng nôn mửa Trong thời gian sốt, lợn có thể đi táo, nhưng khi thân nhiệt hạ, chúng sẽ bị tiêu chảy với phân loãng, nhiều nước, có mùi hôi thối, thậm chí có thể có máu và các mảng thượng bì bong tróc.
Virus ảnh hưởng đến hệ hô hấp của động vật, dẫn đến các triệu chứng như viêm niêm mạc mũi và chảy nước mũi Ban đầu, nước mũi trong và loãng, sau đó chuyển sang đục và đặc, có thể gây tắc nghẽn ở khóe mũi, làm cho vành mũi nứt nẻ Động vật cũng có biểu hiện ho, bắt đầu bằng ho khan ít, sau đó tăng lên thành ho ướt và nhiều hơn.
Vi rút ảnh hưởng đến hệ thần kinh, đặc biệt là não, dẫn đến các triệu chứng như đi đứng không vững, loạng choạng, và có thể gây liệt hai chân sau hoặc liệt nửa thân dưới ở động vật.
Lợn có biểu hiện viêm kết mạc và giác mạc mắt, chảy nước mắt, lúc đầu trong loãng về sau đục và đặc dần
Vi rút gây tổn thương thành mạch, dẫn đến sự xuất hiện các điểm xuất huyết không đều trên da, có kích thước từ nhỏ như đầu mũi kim đến lớn như hạt ngô Các điểm xuất huyết nhỏ thường tập trung thành từng mảng, tạo thành những đám giống như vùng bị cháy Trong một số trường hợp, nốt xuất huyết có thể lớn và nằm sâu trong tổ chức liên kết dưới da, với màu tím bầm rõ rệt.
Lợn chết trong vòng 1 tuần sau khi biểu hiện triệu chứng bệnh, tỷ lệ chết có thể 100% (Nguyễn Bá Hiên & Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2012)
Khi lợn mắc bệnh kéo dài trên 30 ngày, chúng được xác định là thể mạn tính, với các triệu chứng như ăn ít hoặc bỏ ăn, sốt, và tiêu chảy kéo dài hoặc ngắt quãng, kèm theo sự giảm bạch cầu Thể bệnh này thường kéo dài vài tháng và cuối cùng dẫn đến cái chết của lợn (Trần Đình Từ, 1990) Các giai đoạn của thể mạn tính bao gồm nhiều biến chuyển phức tạp.
Giai đoạn đầu kéo dài 10 - 15 ngày, các triệu chứng giống như thể cấp tính nhưng nhẹ hơn;
Giai đoạn thứ hai là giai đoạn thuyên giảm;
Giai đoạn ba: sẽ bị bội nhiễm các loại mầm bệnh khác; con vật gầy yếu, tử vong trong vòng 1 đến 3 tháng;
Bệnh tích không đặc trưng nhưng thường là xuất huyết đường tiêu hóa, loét hình cúc áo ở niêm mạc ruột già, hạch lâm ba xuất huyết
Theo nghiên cứu của Bùi Trần Anh Đào và Nguyễn Hữu Nam (2009), bệnh dịch tả ở lợn gây ra các tổn thương nghiêm trọng, bao gồm xuất huyết ở hạch màng treo ruột và hạch lympho Ngoài ra, hiện tượng tích nước trong xoang ngực và xoang bao tim cũng được ghi nhận ở 100% các trường hợp mổ khám.
Tỷ lệ sung huyết ở niêm mạc dạ dày-ruột đạt 93,33%, trong khi xuất huyết điểm ở thận là 80% và nhồi huyết ở lách cùng viêm phế quản phổi chiếm 75% Xuất huyết điểm ở bốn chân ghi nhận 71,67%, trong khi viêm phổi thùy có tỷ lệ thấp chỉ 8,3% và xuất huyết ở van hồi manh tràng là 48,33% Ngoài ra, các tổn thương khác cũng được phát hiện như xuất huyết ở da (28,33%), loét ở miệng (16,77%), loét ở hạch amygdale (16,17%) và loét ở ruột già (38,33%) Tổn thương xuất huyết xuất hiện ở hầu hết các cơ quan như hạch lâm ba, thận, dạ dày, ruột non, ruột già và da (Bùi Trần Anh Đào, 2009).
Theo Đào Trọng Đạt và Trần Thị Tố Liên, bệnh DTL là bệnh dịch tễ đàn, do đó cần quan sát từ 3 - 5 con trở lên để có kết quả chính xác Tuy nhiên, việc phát hiện đầy đủ các bệnh tích điển hình của bệnh DTL trong thời gian gần đây gặp nhiều khó khăn.
Bệnh DTL có thể gây ra các triệu chứng xuất huyết lấm tấm trên da, với kích thước khác nhau do hoại tử tế bào nội bì và máu khó đông Xuất huyết chủ yếu xảy ra ở hạch lâm ba, thận, và ít hơn ở các cơ quan như tim, màng thanh dịch, bóng đái, niêm mạc ruột, thanh quản, da và dưới da Hạch lâm ba thường sưng to và xuất huyết, khiến hạch giống đá hóa vân Xuất huyết ở thận thường là lấm chấm và nằm dưới vỏ, trong khi lách có kích thước bình thường nhưng có nhồi huyết dọc theo rìa Vi rút gây mụn loét ở niêm mạc ruột già, tạo ra những mụn loét dày, tròn và có khối sợi huyết Ngoài ra, hiện tượng nước nhầy, lắng đọng sợi fibrin và xuất huyết cục bộ cũng có thể quan sát thấy ở đường tiêu hóa và hô hấp, dẫn đến nhiễm bệnh kế phát Tình trạng bệnh tích và triệu chứng ở từng con vật có thể khác nhau tùy thuộc vào ổ dịch, độc lực của vi rút và sức đề kháng của con vật Việc tìm thấy đầy đủ các bệnh tích và triệu chứng của bệnh DTL trong thời gian gần đây là rất khó khăn.
Bệnh tích của lợn có triệu chứng lâm sàng DTL tại các lò giết mổ ở Bà Rịa - Vũng Tàu chủ yếu bao gồm thận sưng xuất huyết, bàng quang xuất huyết, lách nhồi huyết, phổi viêm xuất huyết và hạch ruột sưng xuất huyết.
Bệnh DTL ở lợn con thường đi kèm với các bệnh như phó thương hàn và E.Coli, dẫn đến tình trạng nốt loét lan rộng trong ruột và viêm phổi, làm cho triệu chứng của bệnh DTL trở nên khó nhận biết (Trần Thị Tố Liên & Đào Trọng Đạt, 1985).
2.2.3.3 B ệnh tích vi thể Đặc trưng nhất là ở hệ lưới nội bì của thành mạch quản, các tế bào nội bì sưng to, thoái hóa, thủy thũng; các mạch quản ngoại biên bị giãn rộng, một số bị tắc mạch dẫn tới bệnh tích đặc trưng của bệnh DTL là xung huyết, xuất huyết, nhồi huyết (thường thấy ở lách, hạch lympho, thận và đường tiêu hóa), hoại tử, viêm não, viêm màng não đặc trưng bởi sưng và thoái hóa các tế bào nội bì, nghẽn mạch, thấm nhiễm lymphocyte quanh mạch Theo Van (1998), sự gia tăng về số lượng các đại thực bào và sự suy yếu của hệ đơn bào ở giữa hạch bạch huyết, lách, hạch amidan và những đám hạch ruột xảy ra trong trường hợp bệnh mạn tính
2.2.3.4 B ệnh DTL thể không điển hình Đây là thể bệnh rất khó phân biệt vì bệnh kéo dài và không có triệu chứng đặc trưng Thể không điển hình biểu hiện dưới các dạng khác nhau như rối loạn sinh sản hoặc bệnh lý sinh sản như sảy thai, thai gỗ, chết thai, thai dị hình, chết sau khi sinh… Theo Nguyễn Lương (1997) đây là thể bệnh DTL khó phân biệt vì bệnh kéo dài và không có các thời kỳ rõ rệt; vi rút lưu hành một cách không rõ ràng, nhất là lợn sinh sản với các trường hợp ổ dịch nhỏ lẻ nổ ra khi có điều kiện thuận lợi Nguyên nhân của thể không điển hình có rất nhiều như: do độc tố của vi rút, các nhiễm trùng thứ phát, sức đề kháng bẩm sinh, loại thức ăn, phương thức chăn nuôi.
T ổ ng quan v ề s ả n xu ấ t v ắ c xin
L ị ch s ử hình thành và phát tri ể n v ắ c xin
Lịch sử nghiên cứu và phát triển vắc xin kéo dài hơn 200 năm, bắt đầu từ khi Edward Jenner thực hiện thí nghiệm vắc xin chống bệnh đậu mùa cho cậu bé James Phipps, chỉ mới tám tuổi, tại một làng quê ở Anh.
Lịch sử sự phát triển vắc xin cho đến nay chia ra 3 giai đoạn với các sự kiện nổi bật:
Giai đoạn Jenner (từ 1976): Sử dụng các vi rút cường độc của động vật gây miễn dịch cho người
Giai đoạn Pasteur (từ 1800): Sử dụng các mầm bệnh nhược độc
Giai đoạn vắc xin ADN (từ 1996): Giai đoạn này còn được gọi là cuộc cách mạng vắc xin lần thứ 3
Cho đến nay, sử dụng vắc xin vẫn tiếp tục được coi là biện pháp chủ yếu để phòng bệnh cho động vật chống lại các bệnh truyền nhiễm.
Sơ lược về các loại vắc xin hiện nay trên thế giới
Vắc xin là chế phẩm kháng nguyên giúp tạo miễn dịch chủ động chống lại bệnh, ngăn ngừa khả năng nhiễm trùng từ mầm bệnh tự nhiên, hay còn gọi là vi sinh vật "hoang dã" Thuật ngữ "vắc xin" lần đầu được Jenner sử dụng, xuất phát từ "vacca", ám chỉ việc tiêm vẩy đậu bò cho người để phòng bệnh đậu mùa Hơn 80 năm sau, Pasteur và các nhà khoa học khác đã tiếp tục sử dụng thuật ngữ này trong nghiên cứu, và nó vẫn được áp dụng cho đến ngày nay như một quy ước.
Vắc xin có thể là các chủng vi rút hoặc vi khuẩn sống đã bị làm suy yếu, được sử dụng để tạo ra phản ứng miễn dịch mà không gây nhiễm trùng nghiêm trọng Ngoài ra, vắc xin cũng có thể bao gồm các vi sinh vật đã được tiêu diệt hoặc vô hoạt, cùng với các thành phần tinh chế từ chúng Hiện nay, vắc xin ADN cũng đang được nghiên cứu và đã bắt đầu được áp dụng trong thực tiễn.
Một số loại vắc xin truyền thống như:
Vắc xin vô hoạt là loại vắc xin được chế tạo từ vi sinh vật đã bị giết chết bằng hóa chất hoặc nhiệt, thường bao gồm toàn bộ virus hoặc vi khuẩn.
Một số vắc xin vô hoạt phổ biến trong thú y bao gồm vắc xin tụ huyết trùng gia cầm, tụ huyết trùng lợn, tụ huyết trùng trâu bỏ, vắc xin phòng bệnh lở mồm long móng và cúm gia cầm Những vắc xin này đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe động vật và ngăn chặn sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm.
Vắc xin vô hoạt trước đây được xem là kém hiệu quả hơn và có thời gian bảo vệ ngắn hơn so với vắc xin nhược độc Tuy nhiên, với sự phát triển của các chất bổ trợ và công nghệ pha chế mới, vắc xin vô hoạt đang dần thay thế vắc xin nhược độc, đặc biệt ở các nước có trình độ khoa học kỹ thuật cao Những quốc gia này lo ngại về nguy cơ tái chủng vi sinh vật gây bệnh cho gia súc, gia cầm từ vắc xin, mặc dù xác suất xảy ra là rất thấp Vắc xin vô hoạt có nhiều ưu điểm như khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể tốt khi được sử dụng nhắc lại, tính an toàn cao cho vật chủ có hệ miễn dịch suy giảm, và dễ bảo quản, phù hợp với nhiều kiểu khí hậu.
Vắc xin vô hoạt có nhược điểm là cần phải tiêm nhắc lại để đạt hiệu quả cao và không kích thích được đáp ứng miễn dịch cục bộ ở đường ruột và niêm mạc Việc sử dụng vắc xin này gặp nhiều khó khăn trong các trang trại chăn nuôi có quy mô lớn Hơn nữa, nhiều vật chủ trong quần thể tiêm vắc xin nhưng không hình thành đáp ứng miễn dịch, trong khi giá thành của vắc xin vô hoạt cao hơn so với vắc xin nhược độc Một mối nguy tiềm ẩn là nếu quá trình vô hoạt không triệt để, có thể vô tình đưa mầm bệnh cường độc vào cơ thể vật chủ qua vắc xin.
Vắc xin nhược độc, hay còn gọi là vắc xin sống, được sản xuất từ các vi sinh vật sống đã được làm suy yếu hoặc mất đặc tính độc hại, giúp tạo ra phản ứng miễn dịch hiệu quả Ưu điểm của loại vắc xin này bao gồm khả năng đáp ứng miễn dịch kéo dài, kích thích hình thành các kháng thể IgG và IgA, cũng như hoạt hóa toàn bộ hệ thống miễn dịch Vắc xin nhược độc có thể dễ dàng sử dụng qua đường uống hoặc phun khí dung, thuận tiện cho việc vận chuyển và có khả năng loại bỏ mầm bệnh cường độc trong quần thể vật chủ Đặc biệt, giá thành của vắc xin nhược độc thấp hơn nhiều so với vắc xin vô hoạt, làm cho nó trở thành lựa chọn kinh tế hơn trong phòng chống bệnh.
Vắc xin nhược độc có nhược điểm là vi sinh vật có thể đột biến trở lại cường độc trong điều kiện thuận lợi, gây khó khăn trong việc kiểm soát sự lưu hành của chúng Nếu đặc tính nhược độc không ổn định, chúng dễ biến chủng và quay lại độc lực cao Ngoài ra, điều kiện bảo quản vắc xin cũng gặp nhiều hạn chế và phụ thuộc vào chất bổ trợ Mặc dù vi sinh vật nhược độc, nhưng chúng vẫn có thể gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến cơ thể vật chủ, đặc biệt là ở những người có sức đề kháng kém hoặc suy giảm miễn dịch.
Vắc xin giải độc tố là loại vắc xin được phát triển dựa trên độc tố của các vi khuẩn đã được vô hoạt, như độc tố uốn ván và độc tố bạch hầu, nhằm bảo vệ sức khỏe con người.
Vắc xin dưới đơn vị là loại vắc xin sử dụng các mảnh protein của mầm bệnh để kích thích hệ thống miễn dịch Có ba dạng chính của vắc xin này: protein tinh chế từ mầm bệnh hoặc mô bào tự nhiên, kháng nguyên protein tái tổ hợp, và vắc xin peptide được tổng hợp.
Một số loại vắc xin DTL
Vắc xin vô hoạt được chia thành hai loại chính: vắc xin vô hoạt từ mô động vật, sử dụng Crystal Violet hoặc formalin để làm bất hoạt virus DTL cường độc từ mô bào hoặc máu lợn, và vắc xin vô hoạt trên tế bào, được sản xuất bằng cách nuôi cấy virus trên tế bào và bổ sung nhũ dầu Tuy nhiên, cả hai loại vắc xin này đều có hiệu quả rất kém, dẫn đến việc chúng không được áp dụng rộng rãi.
Vắc xin nhược độc cổ điển, được sản xuất trước năm 1950, bao gồm hai loại chính: vắc xin sống đồng type, sử dụng vi rút DTL truyền qua thỏ hoặc tế bào mà chưa được tách dòng, có tính an toàn kém, và vắc xin sống dị type.
Hiện nay, cả hai loại vắc xin hiện có chưa đạt được hiệu quả như mong đợi Do đó, cần thiết phải khám phá các hướng đi mới nhằm phát triển vắc xin an toàn và hiệu quả hơn.
*) Vắc xin nhược độc chủng GPE:
Vắc xin được sản xuất từ chủng cường độc ALD, trải qua quá trình cấy truyền 142 đời trên tế bào tinh hoàn lợn ở nhiệt độ 30°C và được làm đơn dòng trên tế bào thận chuột lang, đảm bảo an toàn cho lợn và tạo ra miễn dịch hiệu quả (Tamura & cs., 2014) Hiện nay, vắc xin này chủ yếu được sử dụng tại Nhật Bản và một số quốc gia lân cận.
*) Vắc xin nhược độc chủng Thiverval:
Vắc xin được phát triển tại Pháp từ chủng Alfort, đã được cấy truyền 172 đời trên tế bào thận lợn ở nhiệt độ thấp Mặc dù vắc xin này tạo ra phản ứng miễn dịch tốt, nhưng tính an toàn của nó vẫn bị nghi ngờ do có dấu hiệu truyền ngang virus vắc xin trên đàn lợn với tỷ lệ rất nhỏ (Fan & cs., 2008).
*) Vắc xin nhược độc chủng LOM
Vắc xin được phát triển vào năm 1956 bởi Miyagi, khi ông phân lập thành công chủng độc lực thấp tại Nhật Bản Hiện nay, vắc xin này đang được sử dụng rộng rãi tại Nhật Bản, Hàn Quốc và một số quốc gia khác.
Vắc xin dùng liên tục tại Jeju Hàn quốc từ 1974 đến 2001, nhưng 2003 -
2017 bệnh DTL lại nổ ra, 2014-2018 xác nhận có sự cường độc trở lại của chủng vi rút này tại Jeju, Hàn Quốc (Sang & cs., 2018)
Vắc xin thể hệ mới được phát triển thông qua công nghệ chuyển gen, trong đó protein E2 được sản sinh từ Baculovirus Vắc xin này có độ tinh khiết cao và an toàn, nhưng hiệu lực bảo hộ hoàn toàn chỉ đạt được sau 14 ngày miễn dịch (Dewulf & cs., 2004) Hiện tại, vắc xin này vẫn chưa được sử dụng rộng rãi.
*) Vắc xin nhược độc chủng C (C- chinese)
Nguồn gốc của vắc xin này vẫn đang gây tranh cãi và chưa có sự thống nhất Vắc xin được sản xuất bằng cách làm nhược độc thông qua quá trình cấy truyền hơn 800 lần trên thỏ, và đã được thích nghi trên một số loại tế bào.
Vắc xin này cho thấy khả năng đáp ứng miễn dịch tốt và an toàn cho lợn nái mang thai cũng như lợn con Đặc biệt, vắc xin có độ ổn định cao, không trở lại cường độc ngay cả sau 30 lần tiếp truyền trên lợn từ 6 đến 8 tuần tuổi (Luo & cs., 2014).
Vắc xin này hiện đang được sử dụng phổ biến trên thế giới.
Tổng quan nuôi cấy tế bào
Một số đặc điểm của tế bào động vật
Tế bào động vật có tính cơ học yếu do không có vách và kích thước lớn (khoảng 10 micromet), dẫn đến độ bền cơ học thấp Vì vậy, trong quá trình nuôi cấy, tế bào động vật dễ bị vỡ khi chịu tác động từ các lực như khuấy trộn để tách tế bào hoặc di chuyển mẫu tế bào.
Tế bào động vật có thời gian tăng trưởng gấp đôi trung bình lên tới 30 giờ, trong khi vi khuẩn chỉ mất khoảng 30 phút Hầu hết tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để sống và phân chia, thường phát triển tốt trên bề mặt rắn Khi tế bào hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt nuôi, chúng sẽ ngừng phân chia Tuy nhiên, một số tế bào như tế bào ung thư có thể sinh trưởng và phân chia mà không cần giá đỡ.
Tế bào động vật có thể được bảo quản trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -196˚C, giúp duy trì khả năng sống không giới hạn Khi được phục hồi trong môi trường nuôi cấy, tế bào sẽ phát triển trở lại bình thường.
Các tế bào có những đặc điểm quan trọng như khả năng thích nghi kém với môi trường, nhạy cảm với các ion kim loại, và hầu hết tế bào động vật cần huyết thanh cùng hormone tăng trưởng để thực hiện quá trình phân chia.
Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào
Môi trường nuôi cấy tế bào cần phải phức tạp và giàu dinh dưỡng để hỗ trợ sự phát triển tối ưu của tế bào Có thể cung cấp môi trường dưới dạng dung dịch sẵn sàng sử dụng, dung dịch đậm đặc hoặc bột Dung dịch đậm đặc có thể được pha loãng với nước cất tiệt trùng, trong khi bột cần được hòa tan trong nước và tiệt trùng bằng cách lọc qua lưới lọc 0,22µm.
Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy:
Carbohydrate, đặc biệt là glucose (5-10mM), được sử dụng phổ biến trong các công thức dinh dưỡng để cung cấp năng lượng và làm tiền chất cho tổng hợp sinh học, như ribose cho tổng hợp acid nucleic Fructose có thể được sử dụng thay thế cho glucose Glucose có mặt trong hầu hết các môi trường, đóng vai trò là nguồn ly giải để tạo pyruvate, tham gia vào chu trình acid citric và sinh ra CO2 (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006).
Amino acid (0,1-0,2mM) được sử dụng như tiền chất cho tổng hợp protein, trong đó glutamine là loại phổ biến nhất Tuy nhiên, ammoniac sinh ra từ quá trình chuyển hóa glutamine có thể ức chế sự sinh trưởng trong một số quá trình nuôi cấy (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006).
Muối cũng được dùng để làm cho môi trường có tính đẳng trương, duy trì sự cân bằng với phần bên trong tế bào
Bicarbonate (NaHCO3) được sử dụng như một hệ thống đệm kết hợp với 5-10% CO2 từ tủ ấm, giúp duy trì pH môi trường trong khoảng 7,2-7,4.
Vitamin và hormone có mặt ở nồng độ thấp và được sử dụng để kích thích sự sinh trưởng Mức độ vitamin và hormone có sự biến đổi đáng kể giữa các công thức môi trường khác nhau, cho thấy nhu cầu vitamin của các dòng tế bào là không giống nhau.
Huyết thanh được thêm vào môi trường nuôi cấy tế bào nhằm cải thiện sự sinh trưởng và khả năng bám dính của tế bào trên bề mặt thủy tinh Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum - FBS) là loại huyết thanh thường được sử dụng để bổ sung cho môi trường này Các protein có trong huyết thanh, như albumin, fibronectin và globulin, đóng vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ tế bào bám dính và phát triển hiệu quả.
Kháng sinh được sử dụng trong môi trường nuôi cấy trong thời gian ngắn để giảm nguy cơ tạp nhiễm Nồng độ tối ưu của kháng sinh được xác định dựa trên nghiên cứu của người nuôi cấy Thường, kháng sinh được áp dụng dưới dạng kết hợp, như Penicilin G, Streptomycin và Amphotericin B, nhằm ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương, Gram âm và chống nấm.
Điều kiện nuôi cấy tế bào
Hầu hết các tế bào trong môi trường nuôi cấy phát triển tối ưu ở nhiệt độ 37°C và pH 7,4 Nhiệt độ thấp hơn một chút sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng của tế bào mà không gây hại cho chúng Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng lên từ 39°C trở đi, tế bào có thể bị tổn thương.
40 0 C sẽ phá hủy tế bào Do vậy, việc đảm bảo rằng nhiệt độ không tăng trong tủ cấy là rất quan trọng (Butler, 2004).
Sự tạp nhiễm và cách hạn chế
Sự thất bại trong nuôi cấy tế bào chủ yếu do tạp nhiễm, thường xuất phát từ việc tiệt trùng dụng cụ không đạt yêu cầu và sự tiếp xúc của con người như bàn tay và hơi thở Hiện nay, môi trường và thiết bị được cung cấp sẵn nhằm giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm này Để giảm thiểu thêm rủi ro, cần chú ý cẩn thận đến từng chi tiết trong quá trình nuôi cấy.
Để giảm thiểu nguồn tạp nhiễm trong nuôi cấy tế bào, cần rửa tay bằng xà phòng diệt khuẩn trước và sau khi thực hiện các quy trình, có thể sử dụng găng tay y tế Hạn chế việc di chuyển vào phòng thí nghiệm trong quá trình thí nghiệm, và làm sạch bề mặt làm việc trước và sau mỗi lần nuôi cấy Sử dụng không gian tiệt trùng như tủ cấy tiệt trùng cho tất cả các thao tác, ống nghiệm nuôi cấy bằng nhựa tiệt trùng và chỉ sử dụng một lần Cuối cùng, chọn môi trường và huyết thanh từ các nhà cung cấp đáng tin cậy để đảm bảo không có tạp nhiễm từ nguồn này (Butler, 2004).
Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy
Sự sinh trưởng của tế bào động vật invitro thường trải qua 4 giai đoạn:
Pha chậm (Lag phase) là giai đoạn đầu tiên khi tế bào được chuyển vào môi trường nuôi cấy cho đến khi bắt đầu quá trình phát triển Thời gian của pha này có thể khác nhau, phụ thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô từ đó tế bào được lấy ra (Nguyễn Như Hiên, 2007).
Pha logarit (Log Phase) hay Pha tiến triển (exponential phase) là giai đoạn tế bào phân chia liên tục và tăng nhanh số lượng tế bào Trong giai đoạn này, tế bào sinh trưởng và phân cắt với nhịp độ tối đa, duy trì sự đồng đều trong quá trình phân chia Quần thể tế bào có trạng thái hóa học và sinh lý học tương đồng, vì vậy giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hóa học và sinh lý học tế bào Sinh trưởng logarit diễn ra đồng đều, với tốc độ tổng hợp các thành phần tế bào ổn định Khi điều kiện dinh dưỡng hoặc môi trường thay đổi, sự sinh trưởng có thể trở nên không đồng đều, dẫn đến sự thay đổi trong nhịp độ tổng hợp cho đến khi đạt được cân bằng mới Hiện tượng này dễ quan sát khi chuyển tế bào từ môi trường nghèo dinh dưỡng sang môi trường giàu dinh dưỡng, yêu cầu tế bào tạo ra ribosome mới để nâng cao khả năng tổng hợp protein, từ đó tăng cường tổng hợp protein và DNA, dẫn đến tốc độ phát triển nhanh chóng.
Giai đoạn dừng (Pha dừng) là giai đoạn mà sự sinh trưởng của tế bào ngừng lại sau giai đoạn logarit Số lượng tế bào trong giai đoạn này không thay đổi, do sự cân bằng giữa tế bào mới sinh ra và tế bào chết đi, hoặc tế bào ngừng phân chia nhưng vẫn duy trì hoạt tính trao đổi chất Nguyên nhân chính dẫn đến sự dừng lại này là sự thiếu hụt chất dinh dưỡng thiết yếu, làm chậm quá trình sinh trưởng Ngoài ra, sự tích tụ của các sản phẩm trao đổi chất có hại trong môi trường cũng có thể gây cản trở sự phát triển Một số nghiên cứu cho thấy khi số lượng tế bào đạt đến một giới hạn nhất định, sự sinh trưởng cũng có thể bị dừng lại (Nguyễn Như Hiên, 2007).
Giai đoạn tử vong là thời kỳ mà tế bào tiêu hao chất dinh dưỡng và tích lũy chất thải độc hại, dẫn đến môi trường sống bị ảnh hưởng và số lượng tế bào sống giảm Tương tự như giai đoạn logarit, sự chết của tế bào cũng diễn ra theo tỷ lệ logarit, với tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là không đổi Để duy trì sự sinh trưởng của tế bào, cần thực hiện các mẻ cấy chuyền vào môi trường mới (Nguyễn Như Hiên, 2007).
Hệ thống Microcarrier
Lý do l ự a ch ọn phương pháp nuôi cấ y trên Microcarrier
Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu cấu trúc và chức năng, cũng như sản xuất các nguyên liệu sinh học thiết yếu như vắc xin, enzyme, hormone, kháng thể, interferon và axit nucleic Việc nuôi cấy Microcarrier đã mở ra những cơ hội mới, cho phép nuôi cấy các tế bào bám dính năng suất cao ở quy mô lớn lần đầu tiên.
Phương pháp nuôi cấy trên Microcarrier có các ưu điểm sau:
*) Tạo nhiều cơ hội và ứng dụng mới của nuôi cấy tế bào động vật
Microcarriers là bề mặt lý tưởng cho phát triển tế bào động vật, giúp tăng năng suất từ nuôi cấy một lớp Chúng được ứng dụng trong sản xuất tế bào, vi rút và các sản phẩm tế bào với quy mô lớn, nghiên cứu sự biệt hóa và chức năng của tế bào, cũng như nuôi cấy trong hệ thống môi trường tự động Ngoài ra, microcarriers còn hỗ trợ nghiên cứu hiển vi, thu hoạch tế bào đang phân chia, phân lập tế bào, và nghiên cứu màng tế bào, đồng thời phục vụ cho việc dự trữ và vận chuyển tế bào, cũng như các phương pháp liên quan đến sự vận chuyển và hấp thụ hợp chất có đánh dấu (Nilsson & Kjell, 1998).
*) Tăng khả năng sản xuất
Hệ thống Microcarrier, với diện tích bề mặt nuôi cấy lớn như 30 cm² trong 1ml sử dụng 5mg Cytodex 1, mang lại năng suất tế bào cao mà không cần thiết bị cồng kềnh hay phương pháp phức tạp So với các loại nuôi cấy một lớp khác, Microcarrier yêu cầu ít không gian hơn cho cùng một lượng tế bào hoặc sản phẩm từ chúng (Nilsson & Kjell, 1998).
*) Các tế bào tách biệt với sản phẩm tiết
Công nghệ Microcarrier là phương pháp duy trì tế bào cho phép tỷ lệ pha loãng độc lập với tỷ lệ sinh trưởng của tế bào Điều này giúp giảm số lượng tế bào trong dòng thu hoạch, từ đó đơn giản hóa quá trình xử lý cuối Một phần của bước phân loại sẽ được chuyển vào quá trình lên men, theo nghiên cứu của Nilsson & Kjell (1998).
Hình 2.2 Hình ảnh quá trình tế bào tách biệt với sản phẩm tiết
*) Kiểm soát được nâng cao
Hệ thống Microcarrier cho phép kiểm soát chính xác các thông số nuôi cấy như pH và mức độ khí, mang lại lợi ích cho sự sinh trưởng của các tế bào bám dính Kỹ thuật này kết hợp những ưu điểm của nuôi cấy huyền phù, giúp việc kiểm soát và lấy mẫu trở nên đơn giản hơn so với các phương pháp khác, từ đó dễ dàng tạo ra số lượng lớn tế bào bám dính (Nilsson & Kjell, 1998).
*) Sự bảo vệ chống lại stress vật lý và hóa học
Các Microcarriers dạng macroporous giúp bảo vệ tế bào khỏi sự tác động của đầu nhọn máy khuấy, đặc biệt trong quy trình sản xuất quy mô lớn Nhờ vào sự bảo vệ này, việc sục khí bằng vi bọt sử dụng oxy tinh khiết trở nên khả thi Các tế bào có khả năng chịu đựng nhiều loại stress hóa học như lactate, amoni và oxygen khi chúng được sinh ra trong vi môi trường xung quanh các lỗ.
*) Những yêu cầu được giảm thiểu cho môi trường nuôi cấy
So với các kỹ thuật nuôi tế bào 1 lớp hoặc nuôi huyền phù khác, nuôi cấy Microcarrier có khuấy đã nâng cao năng suất lên tới 100 lần cho nhiều loại tế bào trong cùng một thể tích môi trường nuôi Năng suất siêu cao này đã được ghi nhận ở nhiều hệ thống tế bào như tế bào xơ phôi gà, tế bào thận lợn, tế bào cá, tế bào não chuột Hamster Trung Quốc, tế bào sợi người, tế bào thận khỉ sơ cấp và tế bào sợi chuột biến đổi Việc giảm thiểu yêu cầu về môi trường nuôi cấy đã giúp tiết kiệm đáng kể chi phí, đặc biệt khi tính đến giá thành của huyết thanh bổ sung như huyết thanh bào thai bê Các Microcarrier dạng lỗ đặc biệt tạo ra một vi môi trường lý tưởng, cho phép các tế bào tự tiết hormone sinh trưởng, từ đó giảm nhu cầu bổ sung protein trong môi trường nuôi.
*) Những yêu cầu giảm thiểu về phòng Lab
Nuôi cấy Microcarrier cho phép sản xuất số lượng lớn tế bào trong thể tích nhỏ, đạt hơn 10^11 tế bào/l và sử dụng ít thiết bị Một kỹ thuật viên có thể xử lý sản phẩm vắc xin tương đương 900 bình roller trong một tuần Năng suất tế bào từ Microcarrier tương đương 50 chai roller (490 cm²) và 1-1,5 ml hạt có lỗ có thể đạt năng suất như một chai roller 850 cm² Quy trình nuôi cấy trên Microcarrier đã được đơn giản hóa, giảm thiểu nhân lực cần thiết cho sản xuất hàng ngày Các tế bào có thể tách biệt dễ dàng từ môi trường nuôi cấy, và khi quá trình khuấy dừng lại, tế bào lắng xuống dưới tác động của trọng lực, cho phép loại bỏ dịch phía trên mà không cần bước ly tâm như trong hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào.
*) Nguy cơ tạp nhiễm thấp
Trong nuôi cấy tế bào, nguy cơ tạp nhiễm tăng lên do số lượng bước thao tác cần thiết để sản xuất tế bào hoặc sản phẩm Việc sử dụng Microcarrier giúp giảm thiểu số lượng bước thao tác này Khi sản xuất một lượng lớn tế bào trong một đợt nuôi cấy Microcarrier, nguy cơ tạp nhiễm được giảm đáng kể so với việc sử dụng nhiều bình roller, theo nghiên cứu của Nilsson & Kjell (1998).
S ự phát tri ể n c ủ a các h ạ t ch ấ t mang
Ý tưởng nuôi cấy tế bào động vật trên Microcarrier được khởi xướng bởi Van Wezel, người đã sử dụng môi trường DEAE Sephadex ™ A-50 trong các thí nghiệm đầu tiên Môi trường này cung cấp bề mặt nuôi cấy lớn với mật độ phù hợp, cho thấy tiềm năng của kỹ thuật Microcarrier trong sản xuất vi rút Van Wezel đã chứng minh rằng hệ thống Microcarrier đồng nhất có thể áp dụng cho nuôi cấy quy mô lớn với nồng độ 1 mg/mL DEAE Sephadex A-50 Tuy nhiên, mật độ tế bào tối đa trong nuôi cấy Microcarrier phụ thuộc vào diện tích tiếp xúc bề mặt, và khi nồng độ DEAE Sephadex A-50 vượt quá 1-2 mg/mL, không có sự gia tăng năng suất tế bào Hiện tượng này được giải thích bởi sự bám kém của tế bào trong giai đoạn đầu nuôi cấy, dẫn đến sự nhân lên chậm và sản lượng thu hoạch thấp, cho thấy rằng tỷ lệ hạt DEAE Sephadex A-50 không tối ưu có thể ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển của tế bào.
Hạt Cytodex 1 đã phát triển và thay thế hạt DEAE Sephadex A-50, trở thành sản phẩm tiên phong trong việc tối ưu hóa tiềm năng nuôi cấy trên Microcarrier với quy mô lớn lên tới vài trăm lít Cytodex 1 đặc biệt phù hợp cho việc nuôi cấy các tế bào có hình thái giống như nguyên bào sợi, mang lại hiệu quả cao trong nghiên cứu và sản xuất tế bào.
Cơ hội phát triển của nuôi cấy Microcarrier được nâng cao với sự ra đời của hạt Cytodex 3, dựa trên nguyên tắc khác biệt so với các bề mặt truyền thống như thủy tinh và nhựa Trong khi các bề mặt này có mật độ phân tử tích điện thấp, Cytodex 3 sở hữu lớp collagen biến tính liên kết chéo với ma trận dextran, giúp tối đa hóa sản lượng tế bào Hạt Cytodex 3 cho thấy hiệu quả vượt trội đối với các tế bào có hình thái giống biểu mô (Nilsson & Mosbach, 1980).
Vi sóng siêu nhỏ gelatin do Kjell Nilsson phát triển đánh dấu một bước tiến quan trọng, giúp tăng cường sự phát triển bên trong các hạt, từ đó nâng cao mật độ tế bào và bảo vệ các tế bào (Nilsson & cs., 1986).
Cytopore là một bước tiến mới, duy trì hầu hết các đặc tính tương tự như Cytodex, nhưng với diện tích bề mặt được cải thiện nhờ vào cấu trúc vĩ mô.
M ộ t s ố ứ ng d ụ ng c ủ a Microcarrier
Hơn 600 bài báo đã chỉ ra sự thành công của công nghệ Microcarrier trong việc nuôi cấy nhiều dòng tế bào khác nhau Hiện nay, ứng dụng chủ yếu của công nghệ này bao gồm sản xuất vắc xin, tạo véc tơ cho liệu pháp gen, cũng như sản xuất protein tự nhiên và tái tổ hợp, bao gồm cả kháng thể đơn dòng.
Nhiều nhà sản xuất vắc xin tại châu Âu và trên toàn cầu đang áp dụng hệ thống Microcarrier để sản xuất vắc xin nhược độc hoặc vô hoạt, phục vụ cho nhu cầu tiêm phòng ở cả con người và động vật.
Một hội thảo Microcarrier (2002 tại Rome) đã xác nhận nhiều ứng dụng trong ngành công nghiệp vắc xin:
Bảng 2.2 Một số ứng dụng Microcarrier trong ngành sản xuất vắc xin
Tên công ty Bài báo Tạp chí/ bằng sáng chế Microcarrier
Baxter, Áo Vắc xin cúm, đậu mùa Hội thảo Microcarrier 2002 Cytodex 3
NVI, Hà Lan Sản xuất IPV Hội thảo Microcarrier 2002 Cytodex 3
Nuôi cấy Microcarrier mật độ cao cho sản xuất vi rút, vắc xin bại liệt trên tế bào
Tư vấn.Hoạt hình.Tế bào-
Aventis Nuôi cấy tế bào JEV, vero quy mô 2000l Bằng sáng chế Cytodex 1
Sản xuất Vắc xin giả dại trên tế bào BHK, Vero Hội thảo Microcarrier 2002 Cytodex 1
2.5.3.2 S ản xuất vi rút và tế bào
Các tế bào được nuôi cấy trên Microcarrier thường được sử dụng làm nền để sản xuất vi rút hoặc các sản phẩm tế bào
Hệ thống Microcarrier là một giải pháp nuôi cấy nhỏ gọn, cho phép sản xuất một lượng lớn vi rút và nhiều loại vắc xin quan trọng Các loại vắc xin được sản xuất trong hệ thống này bao gồm bại liệt, rubella, bệnh dại, cúm, viêm não Nhật Bản, RSV và vắc xin bệnh lở mồm long móng (FMD).
Nuôi cấy Microcarrier mang lại nhiều lợi thế trong sản xuất vắc xin, bao gồm tăng năng suất, giảm chi phí và hạn chế tạp nhiễm so với các phương pháp nuôi cấy tế bào khác Theo báo cáo của Von Seefried và Chun, vi rút bại liệt có khả năng lây nhiễm cao đạt sản lượng 8,84 log 10 TCID50/mL khi sử dụng nguyên bào sợi người (MRC-5) phát triển trên Cytodex Bên cạnh đó, tế bào Vero phát triển trên Cytodex cũng đã được ứng dụng để sản xuất vắc xin bại liệt ổn định từ thể tích nuôi cấy 140 lít.
Spier và Whiteside đã nghiên cứu sự sản xuất vi rút FMD từ tế bào BHK được nuôi cấy trên Microcarrier và trong huyền phù Kết quả cho thấy vi rút FMD Type O nuôi cấy trên Microcarrier có khả năng lây nhiễm cao hơn so với nuôi cấy trong huyền phù (Spier & cs., 1976).
2.5.3.3 Protein t ự nhiên và tái tổ hợp
Quy trình sản xuất protein tự nhiên thường sử dụng tế bào lưỡng bội trên Microcarrier, với các protein tái tổ hợp chủ yếu được thể hiện trong tế bào CHO Những tế bào này gắn vào bề mặt sóng siêu nhỏ và phát triển ban đầu, nhưng sau vài ngày, quá trình tổng hợp diễn ra và tế bào bắt đầu rơi ra Mặc dù nhiều tế bào CHO đã được điều chỉnh cho nuôi cấy huyền phù, nhưng mật độ tế bào phát triển vẫn khá thấp so với nuôi cấy trên Microcarrier.
Gần đây, các quy trình sử dụng vi sóng siêu nhỏ để tăng mật độ tế bào đã được phát triển Theo nghiên cứu của Shirokaze, khi nuôi cấy Microcarrier, năng suất r-Il4 có thể tăng gấp đôi so với nuôi cấy huyền phù Sản lượng này được đo bằng phương pháp ELISA trong khoảng thời gian 11 ngày.
Interferon đã được sản xuất với năng suất cao từ Microcarrier, với báo cáo đầu tiên ghi nhận sản lượng đạt 4 × 10^3 IU HuIFNb/10^6 nguyên bào sợi của con người (Giard & cs., 1979) Các nhà nghiên cứu Clark và Hirtenstein đã tối ưu hóa quy trình thử nghiệm phát triển tế bào và sửa đổi quy trình cảm ứng, nâng cao sản lượng lên 3 × 10^4 IU.
Kỹ thuật sử dụng HuIFNb với 10^6 nguyên bào sợi của con người tương ứng với 2 × 10^4 IU HuIFNb / mg Cytodex, cho phép tạo ra nuôi cấy đạt 3 ×.
10 8 IU HuIFNb / 5 lít (Clark &Hirtenstein, 1981)
Nuôi cấy Microcarrier đã tạo điều kiện cho sự phát triển mạnh mẽ của tế bào ung thư biểu mô đại tràng ở người, từ đó giúp sản xuất kháng nguyên carcinoembryonic (Page & Dufour, 1979).
PHẦN 3 NỘI DUNG - VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
