VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU
Bordetella pertussis 509 - HL/ĐL94/NT00 chứa ngưng kết nguyên 1,2,5,7
Bordetella pertussis 134 - HL/ĐL92/NT00 chứa ngưng kết nguyên 1,3,7
- Chủng thử thách: Bordetella pertussis 18323 chứa ngưng kết nguyên 1,2,3,5,7
Chủng được kiểm tra LD50 qua các lần thử nghiệm
Các chủng vắc xin ho gà được nhân giống và đông khô tại IVAC, có nguồn gốc từ Viện RIVM - Hà Lan, nhằm tạo ra các hệ chủng master seed lot (MSL) và working seed lot (WSL) phục vụ cho sản xuất và kiểm định vắc xin.
Vắc xin ho gà toàn tế bào mẫu chuẩn quốc gia RP5, với hàm lượng 66 IU/ống, được cung cấp bởi Viện Kiểm định quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế.
2.1.3 Kháng huyết thanh ngưng kết ho gà typ 1, 2, 3, đa giá – do Viện Vắc xin
Pasteur Đà Lạt cung cấp
2.1.4.1 Các môi trường nuôi cấy chính
- Môi trường BG (Bordet Gengou) xem phụ lục số 1
- Môi trường Verwey xem phụ lục số 2
- Môi trường B2 xem phụ lục số 3
- Dung dịch Isotonic xem phụ lục số 4
- Amoniacetat CH3COONH4 Merk – Đức
- Acid acetic CH3COOH Merk – Đức
- HNO3 đậm đặc Merk – Đức
- Chuột nhắt trắng, giống Swiss, trọng lượng 11 - 14 g/con, 14 - 16 g/con, 15 - 17 g/con
- Chuột lang, tên Cavia porcellus, trọng lượng 250 - 350 g/con
- Thỏ giống New Zealand, trọng lượng 2,5 - 3,5 kg/con
- Súc vật thí nghiệm do Trại chăn nuôi Súc vật thí nghiệm của Viện IVAC cung cấp.
THIẾT BỊ, DỤNG CỤ
- Nồi lên men 300 lít, hãng B Braun - Đức, được thiết kế 2 vỏ bằng thép không rỉ
SS 316L, chịu áp lực -3 đến 3 bar, thể tích nuôi cấy 200 lít
Lò hấp ướt tiệt trùng của hãng Gettinge – Thụy Điển, thiết kế với 2 cửa và hoạt động tự động theo chương trình, cung cấp 6 chương trình hấp khác nhau Với công suất 6 KW và thể tích buồng tiệt trùng lớn, thiết bị này đảm bảo hiệu quả tiệt trùng tối ưu cho các nhu cầu y tế và công nghiệp.
- Lò sấy khô, hãng Memmert – Đức, tự động, nhiệt độ sấy tối đa 220 o C, công suất 4800 W, thể tích buồng là 749 lít
- Box vô trùng, hãng Biocyt - Pháp, loại thổi đứng, air class 100 Kích thước lỗ lọc 0,3 àm, hiệu suất lọc 99,999 % Diện tớch sử dụng vựng class 100 là 0,6 m x 1,2 m
- Máy đo độ đục, hãng Milton Roy-Mỹ, mã hiệu Spectronic-20, dải bước sóng
- Máy đo pH, hãng WTW - Đức, hiển thị pH và nhiệt độ, có chế độ in, dải pH đo từ 0 - 14
- Máy khuấy từ, hãng Zenway - Anh
- Cân phân tích, hãng Sartorius - Đức, sai số 0,001 mg, cân tối đa 210 mg
- Cân kỹ thuật Ohaus, trọng lượng cân tối đa 4000 g, sai số 0,01 g
- Kính hiển vi quang học, hãng Fisher Scientific - Mỹ, độ phóng đại 1000 lần
- Nồi pha môi trường, Chemap - Đức, 2 vỏ, thể tích 50 lít
- Nồi bất hoạt, hãng Sartorius - Đức, thể tích 40 lít
- Tủ lạnh âm Acson, độ âm: -20 o C, thể tích 0,2 m 3
- Máy quang phổ Cecil instruments – Anh, cóng đo bằng thạch anh dày 1 cm, có bước sóng đo 470 - 520 nm
- Cân phân tích điện tử AA 250, hãng Denver Instrument Company, Mỹ
- Kho lạnh bảo quản vắc xin 2 - 8 o C
- Micropipette và đầu cụn cỏc loại 20 àl , 50 àl , 200 àl , 1000 àl Hóng BioHit
- Pipette aid đa đầu côn (Multichannel) Hãng BioHit
- Pipette thuỷ tinh các loại 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml Hãng Duran
- Ống đong các loại 50 ml, 250 ml, 1000 ml Hãng Duran
- Tube thuỷ tinh 18mm, 20 mm Hãng Schott
- Bơm kim tiêm nhựa các loại 0,5 ml, 1 ml, 3 ml, 5 ml Hãng Vinahankook
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu ở qui mô thí nghiệm
Lấy mẫu được thực hiện theo các khoảng thời gian khác nhau: sau 1 ngày, sau 2 ngày, sau 3 ngày (thực hiện hai lần), sau 5 ngày và sau 7 ngày.
D3: lấy mẫu sau 3 ngày D3: lấy mẫu sau 3 ngày D5: lấy mẫu sau 5 ngày D7: lấy mẫu sau 7 ngày
D5: lấy mẫu sau 5 ngày D3: lấy mẫu sau 3 ngày D3: lấy mẫu sau 3 ngày
D2: lấy mẫu sau 2 ngày D1: lấy mẫu sau 1 ngày
2.3.1.1 Chọn qui trình cơ bản bất hoạt bằng formalin
Xác định nồng độ formalin và điều kiện bất hoạt (nhiệt độ/thời gian)
- Nghiên cứu thực hiện trên 2 loại canh khuẩn ho gà chủng Bordetella pertussis
509 ( Bp 509 ) và chủng Bordetella pertussis 134 ( Bp 134 )
- Mỗi loại thực hiện với 5 lô liên tiếp ký hiệu: 0111/Pe, 0211/Pe, 0311/Pe,
0411/Pe, 0511/Pe (đối với Bp 509 ) và 0611/Pe, 0711/Pe, 0811/Pe, 0911/Pe,
- Chuẩn bị canh khuẩn ho gà có đậm độ 33 tỷ VK/ml theo qui trình sản xuất nước cốt ho gà của IVAC
- Lấy các mẫu D0 (ngay trước khi cho formalin vào canh khuẩn)
Sau khi thêm formalin vào canh khuẩn, khuấy với tốc độ 200 - 220 vòng/phút Lấy mẫu theo thứ tự D1, D2, D3 cho canh khuẩn bất hoạt ở nhiệt độ 37 độ C và mẫu D3, D5, D7 cho canh khuẩn bất hoạt ở nhiệt độ 25 độ C.
- Đối với mẫu D0 kiểm tra các chỉ tiêu: pH, sống sót, ngưng kết và formalin
- Đối với mẫu D1, D2, D3, D5, D7 kiểm tra các chỉ tiêu: pH, sống sót, ngưng kết, an toàn đặc hiệu (MWG) và formalin tồn dư
Chọn các thông số của qui trình bất hoạt: nồng độ formalin, nhiệt độ, thời gian bất hoạt
2.3.1.2 Tối ưu hóa qui trình bất hoạt
Xác định ảnh hưởng của đậm độ vi khuẩn ho gà đối với quá trình bất hoạt bằng formalin
- Chuẩn bị canh khuẩn ho gà có đậm độ 33 tỷ VK/ml, 50 tỷ VK/ml và 100 tỷ VK/ml
- Tiến hành bất hoạt theo qui trình đã chọn Lấy mẫu kiểm tra các chỉ tiêu: pH, ngưng kết, sống sót, an toàn đặc hiệu (MWG)
Xác định hiệu suất thu hồi khi sử dụng phương pháp bất hoạt bằng formalin
Chọn 5 lô canh khuẩn ho gà với độ pH và mật độ khác nhau, mỗi lô có thể tích 500 ml Tiến hành quá trình bất hoạt theo các thông số đã xác định Sau đó, thực hiện ly tâm và hoàn nguyên về thể tích 50 ml Cuối cùng, tính toán kết quả thu được từ quá trình này.
- So sánh hiệu suất giữa bất hoạt bằng nhiệt và bất hoạt bằng formalin
2.3.2 Áp dụng qui trình bất hoạt bằng formalin trên qui mô sản xuất lớn
- Chọn 5 lô canh khuẩn ho gà chủng Bp 509 sản xuất trên nồi lên men B.Braun
D 300 theo qui trình thường nhật của Viện Vắcxin, lô số 1111/Pe,1211/Pe, 1311/Pe, 1411/Pe và 1511/Pe
- Chọn 5 lô canh khuẩn ho gà chủng Bp 134 sản xuất trên nồi lên men B.Braun
D 300 theo qui trình thường nhật của Viện Vắcxin, lô số 1611/Pe,1711/Pe, 1811/Pe, 1911/Pe và 2011/Pe
- Thực hiện bất hoạt theo sơ đồ sau:
Hình 2.2 Sơ đồ bất hoạt NCHG ở qui mô sản xuất lớn
- Lấy mẫu: 5 mẫu x 20 ml/mẫu
- Các chỉ tiêu kiểm tra bao gồm: pH, ngưng kết, LPF, MWG, vô trùng, sống sót, formalin tồn dư
- So sánh hiệu suất bất hoạt nước cốt ho gà đơn chủng bất hoạt bằng formalin với nước cốt ho gà đơn chủng bất hoạt nhiệt truyền thống
Nước cốt ho gà đơn chủng
Tách lọc / hoàn nguyên thu hồi sinh khối vi khuẩn
Nước cốt ho gà hợp chủng PM
Hình 2.2 Sơ đồ bất hoạt canh khuẩn ho gà ở qui mô sản xuất lớn
2.3.3 Thẩm định qui trình bất hoạt formalin trên sản phẩm NCHG hợp chủng (PM) từ nước cốt ho gà đơn chủng bất hoạt formalin
- Đánh giá chất lượng của NCHG hợp chủng PM từ nước cốt ho gà đơn chủng bất hoạt formalin
So sánh tiêu chuẩn cảm quan của nước cốt ho gà hợp chủng PM từ NCHG đơn bất hoạt bằng formalin với PM từ NCHG bất hoạt nhiệt truyền thống cho thấy sự khác biệt rõ rệt Nước cốt ho gà PM từ NCHG đơn bất hoạt bằng formalin có màu sắc và mùi vị đặc trưng hơn, mang lại trải nghiệm tốt hơn cho người tiêu dùng Trong khi đó, PM từ NCHG bất hoạt nhiệt truyền thống có thể thiếu sự phong phú trong cảm quan Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của phương pháp bất hoạt trong việc cải thiện chất lượng sản phẩm.
2.3.4 Đánh giá tính ổn định của nước cốt ho gà hợp chủng PM từ nước cốt ho gà đơn bất hoạt formalin
Nước cốt ho gà được bảo quản ở nhiệt độ 2-8°C chờ kết quả kiểm tra, nếu đạt yêu cầu sẽ được pha chế thành vắc xin ho gà hoặc kết hợp với giải độc tố bạch hầu, uốn ván để tạo vắc xin DPT Nước cốt ho gà có hạn sử dụng 12 tháng, do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu tính ổn định của sản phẩm này trong 12 tháng, với các mẫu được lấy định kỳ tại các thời điểm 0 tháng, 3 tháng, 6 tháng và 12 tháng.
An toàn đặc hiệu (MWG)
Từ đó xác định hạn dùng cho sản phẩm mới
2.3.5 Xây dựng quy trình bất hoạt canh khuẩn ho gà bằng formalin trên quy mô sản xuất lớn
2.3.6 Các phương pháp kiểm tra chất lượng
Bao gồm các tiêu chí: màu sắc, độ lắng cặn và độ hoà tan
Màu sắc: quan sát bằng mắt thường dưới ánh sáng đèn chuyên dụng
Độ lắng cặn của mẫu nước cốt ho gà được xác định bằng cách cho các mẫu trong tube cùng chất liệu và thể tích lắng tự nhiên Sau khoảng thời gian nhất định, sử dụng pipette để lấy phần nước trong cách mặt nước 1 cm và đo OD ở bước sóng 450 - 540 nm, nhằm đánh giá khả năng lắng của mẫu.
Độ hòa tan của các mẫu NCHG được xác định bằng cách lắc với tốc độ 200 - 220 vòng/phút trong một khoảng thời gian nhất định, ghi nhận thời gian từ khi bắt đầu khuấy cho đến khi mẫu tan hoàn toàn, tạo thành dung dịch huyền phù đồng nhất.
pH của một dung dịch được định nghĩa là logarit của nghịch đảo hoạt độ ion hydro, được tính bằng gam ion trên lít Công thức tính pH là pH = -lg C H+ Để xác định pH của dung dịch, người ta sử dụng máy đo pH kết hợp với điện cực chỉ thị.
Để chuẩn hóa máy đo pH, cần sử dụng hai dung dịch đệm chuẩn có trị số pH khác nhau không quá 4 đơn vị Trị số pH của dung dịch cần đo phải nằm giữa hai trị số pH của dung dịch đệm này Sau đó, điều chỉnh máy để đảm bảo đọc được trị số pH chính xác tương ứng với nhiệt độ của dung dịch đệm chuẩn khi tiến hành đo.
- Khi pH dung dịch thử nghiệm:
Trước và sau mỗi lần đo pH, cần rửa điện cực bằng nước cất và lau khô bằng giấy lọc mềm Sau đó, nhúng điện cực vào dung dịch cần khảo sát và thực hiện đo pH ở nhiệt độ tương ứng với các dung dịch đệm chuẩn dùng để hiệu chuẩn máy.
+ Nếu sự khác nhau giữa lần đọc này và trị số gốc của dung dịch chuẩn ấy > 0,05 thì các phép đo phải làm lại
Tiêu chuẩn: pH của vắc xin yêu cầu nằm trong khoảng 7,0 ± 0,3
2.3.6.3 Phương pháp kiểm tra an toàn đặc hiệu bằng thử nghiệm tăng trọng chuột (Mouse Weigh Gain test) [13],[20]
Nguyên lý nghiên cứu dựa trên việc so sánh sự tăng trọng của nhóm chuột được tiêm nước cốt ho gà với nhóm chuột đối chứng, được tiêm nước muối sinh lý, vào ngày thứ 7 sau khi tiêm.
- Phân bố chuột nhắt trắng (14 - 16 g/con, đồng giới) thành các nhóm, mỗi nhóm
- Pha loãng mẫu thử bằng dung dịch nước muối sinh lý (NMSL) đạt đậm độ 15 tỷ VK/ml
- Tiêm 20 chuột/mẫu thử, tiêm phúc mạc, mỗi chuột tiêm 0,5 ml mẫu thử đã pha loãng
- Tiêm 20 chuột/mẫu đối chứng, tiêm phúc mạc, mỗi chuột tiêm 0,5 ml nước muối sinh lý
- Quan sát chuột hàng ngày
- Xác định tổng trọng lượng của nhóm chuột vào ngày thứ 3 và thứ 7 sau tiêm
- Tính kết quả tăng trọng của nhóm chuột tiêm mẫu thử so với nhóm chuột chứng tiêm nước muối sinh lý
Tiêu chu ẩn chất lượng
- Trọng lượng chuột vào ngày thứ 3 phải lớn hơn hoặc bằng trọng lượng chuột ngay trước khi tiêm
- Vào ngày thứ 7, trọng lượng tăng của nhóm chuột tiêm mẫu thử phải lớn hơn hoặc bằng 60 % trọng lượng tăng của nhóm chuột đối chứng (tiêm NMSL)
- Số lượng chuột chết liên quan đến mẫu thử không được nhiều hơn 5 % của
2.3.6.4 Phương pháp xác định công hiệu của nước cốt ho gà [5],[20]
Nguyên lý xác định công hiệu của nước cốt ho gà được thực hiện qua phương pháp thử thách theo quy định của TTKĐQG và TCYTTG Phương pháp này dựa trên việc so sánh liều bảo vệ 50% cho súc vật thí nghiệm giữa vắc xin thử nghiệm và vắc xin chuẩn Sau 14 ngày miễn dịch, toàn bộ chuột sẽ được tiêm thử thách bằng chủng ho gà Bp 18323, với liều LD50 đã được xác định trước đó.
Công hiệu của nước cốt ho gà được tính theo đơn vị của vắc xin chuẩn, biểu thị bằng đơn vị quốc tế (IU/ml)
Chuột có trọng lượng từ 11 đến 14 g và tuổi từ 3 đến 4 tuần Cần chọn chuột đồng giới tính; nếu khác giới, cần tách riêng và phân phối đều cho từng loại vắc xin và độ pha Chuột sẽ được phân phối ngẫu nhiên vào các lồng, mỗi lồng chứa 9 con, và phải được đánh dấu cũng như gắn nhãn rõ ràng.
- Mẫu nước cốt ho gà pha được pha loãng thành 30 tỷ VK/ml
- Mẫu thử và vắc xin chuẩn được pha loãng bậc 5 thành 3 độ pha: 1/5, 1/25, 1/125
- Mỗi độ pha được tiêm vào phúc mạc cho 1 nhóm chuột nhắt 27 con, liều tiêm 0,5 ml/con
- Theo dõi chuột trong thời gian 14 - 17 ngày
- Pha chủng thử thách ho gà Bp 18323 trong đệm casaminoacid 1 % để được nồng độ tương đương 100000 vi khuẩn/0,02 ml
- Tiêm não cho toàn bộ số chuột đã được miễn dịch, liều tiêm 0,02 ml/con
Pha và tiêm cho nhóm chuột đối chứng
- Từ huyền dịch của chủng thử thách pha thành 4 độ pha: 10000 vi khuẩn, 2000 vi khuẩn, 400 vi khuẩn và 80 vi khuẩn/0,02 ml
- Mỗi độ pha tiêm não cho 1 nhóm gồm 10 chuột chưa được tiêm miễn dịch trước đó (được nuôi song song với chuột miễn dịch), liều tiêm 0,02 ml/con
Theo dõi và tính k ết quả
- Chuột được theo dõi trong suốt 14 ngày sau khi thử thách Chuột chết trước ngày thứ 3 sẽ không được tính kết quả
- Số chuột sống ở mỗi độ pha cho cả vắc xin chuẩn và vắc xin thử trong ngày thứ 14 sau thử thách được dùng tính kết quả
- Tính kết quả bằng phần mềm probit analyse của WHO
- Tính LD50 của nhóm chuột đối chứng bằng phương pháp Reed – Muench
LD50 phải nằm trong khoảng từ 100 - 1000 VK
- Trong suốt thời gian miễn dịch cho đến ngày thử thách số chuột chết ở mỗi độ pha không được quá 6 %
Tiêu chu ẩn công hiệu của nước cốt ho gà
- Công hiệu nước cốt ho gà ≥ 6 IU/ml với giới hạn dưới của khoảng tin cậy
2.3.6.5 Phương pháp xác định LPF - Leukocyte Promoting Factor (hoạt tính gây kích thích tăng bạch cầu máu ngoại vi) [13],[20]
Độc tố PT có khả năng kích thích tăng số lượng bạch cầu lympho trong máu ngoại vi của người và một số động vật máu nóng như thỏ và chuột Nghiên cứu đã tiến hành gây nhiễm cho một nhóm chuột nhắt trắng bằng mẫu thử chứa độc tố ho gà hoạt động Sau một thời gian, máu của chuột được lấy để đếm số lượng bạch cầu ngoại vi và so sánh với nhóm chuột chứng, được gây nhiễm bằng mẫu thử không chứa độc tố ho gà hoặc dung dịch nước muối sinh lý.
- Phân bố chuột nhắt trắng (15 - 17 g/con), chuột đực đồng giới thành các nhóm chuột tương ứng, mỗi nhóm 5 con
- Hoàn nguyên ống vắc xin mẫu chuẩn Hà Lan PU 585 bằng NMSL để đạt nồng độ 15 tỷ VK/ml
- Pha loãng mẫu thử đạt đậm độ 15 tỷ VK/ml
- Tiêm mẫu chuẩn, mẫu thử và nước muối sinh lý cho các nhóm chuột tương ứng, mỗi chuột 1 ml/con, dưới da
- Sau 6 ngày, lấy máu mắt chuột
- Xác định số lượng bạch cầu bằng buồng đếm Nebaueur
Tính kết quả: Tính số lượng bạch cầu trung bình cho mỗi nhóm 5 chuột
Số lượng BC đếm trong 25 ô x độ pha loãng mẫu
Số lượng bạch cầu/ mm 3 25 (Số ô) x diện tích của 1 ô (0,004)
= Số lượng BC đếm trong 25 ô x 200
2.3.6.6 Phương pháp LAL xác định nội độc tố (endotoxin) [10]
Lysate là hoạt chất chiết xuất từ máu của loài sam biển (horseshoe crab), trong đó endotoxin kích hoạt proenzyme thành enzyme hoạt động (coagulate) Enzyme coagulate này liên kết và làm đông protein trong lysate, do đó sự hiện diện của endotoxin dẫn đến quá trình đông của lysate.
Coagulagen Coagulin Đơn vị endotoxin được tính theo mẫu chuẩn bằng đơn vị quốc tế (EU/ml)
- Tất cả các nguyên vật liệu và dụng cụ sử dụng trong phản ứng đều không được chứa endotoxin
- Pha endotoxin chuẩn (đông khô) chứa 100 EU thành dung dịch có nồng độ 1 EU/ml
- Pha lysate: Lysate đông khô đươc hồi chỉnh trong 5,2 ml nước cất ( không có endotoxin) ngay trước khi sử dụng Chú ý không để tạo bọt
- Cho 20 μl nước cất vào tất cả các giếng trừ A1 đến A10 Pha loãng bậc 2 bắt đầu từ hàng A đến hàng H
- Cho 40 μl mẫu thử vào các giếng từ A1 đến A10
- Cho 40 μl endotoxin chuẩn 1 EU/ml vào các giếng A11 và A12 Pha loãng bậc
2 bắt đầu từ hàng B11- B12 đến hàng H11- H12
- Cho vào tất cả các giếng 20 μl lysate, tuyệt đối tránh không để tạo bọt
- Dùng băng keo dán kín phiến
- Sau khi ủ, cho vào tất cả các giếng 10 μl dung dịch thuốc nhuộm bromothymol blue 0,25 % Để yên ở nhiệt độ phòng 2 phút Đọc kết quả
- Dựng phiến nhựa theo chiều thẳng đứng dưới đèn neon để đọc kết quả
- Phản ứng dương tính khi lysate đông lại tạo thành gel, tạo thành hình màu tròn xanh dính ở đáy giếng
- Phản ứng âm tính khi lysate không tạo thành gel, dung dịch nhuộm màu sẽ chảy xuống dưới, đọng thành vệt màu ở thành của giếng
Tính kết quả so sánh với độ nhạy của mẫu endotoxin chuẩn
Dương tính Âm tính Chứng (+)
2.3.6.7 Phương pháp kiểm tra sống sót vi khuẩn ho gà [20]
Nguyên lý : vi khuẩn ho gà có thể được phát hiện khả năng sống sót khi được cấy trên môi trường đặc hiệu Bordet Gengou (BG)
- Dùng pipette thuỷ tinh lấy 0,1 ml mẫu thử cấy vào 2 đĩa có chứa môi trường thạch BG, láng đều bề mặt thạch
- Hằng ngày quan sát bằng mắt
- Không có sự phát triển của vi khuẩn ho gà hay bất kì loại vi khuẩn nào khác 2.3.6.8 Phương pháp kiểm tra khả năng ngưng kết [20]
PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU
Trong quá trình thí nghiệm, các số liệu thu được đã được tổng hợp và xử lý thống kê thông qua phương pháp phân tích phương sai ANOVA một yếu tố hoặc hai yếu tố, sử dụng phần mềm Microsoft Excel.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Nghiên cứu xác định các thông số của quy trình bất hoạt formalin quy mô thí nghiệm
3.1.1 Xác định nồng độ formalin, nhiệt độ và thời gian bất hoạt
Bảng 3.1 Các chỉ số sinh - hóa của nước cốt ho gà (NCHG) chủng Bp 509 bất hoạt bằng formalin
Chủng Formalin Chỉ tiêu Kết quả
Bảng 3.2 Các chỉ số sinh - hóa của nước cốt ho gà (NCHG) chủng Bp 134 bất hoạt bằng formalin
Chủng Formalin Chỉ tiêu Kết quả
- D0: Mẫu ngay trước khi cho formalin
- D1, D2, D3, D5, D7: Mẫu bất hoạt 1 ngày (24 h) , 2 ngày (48 h), 3 ngày (72 h), 5 ngày (120 h),
Formalin là một hóa chất quan trọng được các nhà nghiên cứu và sản xuất sử dụng để bất hoạt nhiều loại vắc xin, bao gồm vắc xin vi khuẩn như tả, uốn ván, bạch hầu và vắc xin vi rút như cúm, viêm gan B Hóa chất này được ưa chuộng nhờ vào những ưu điểm vượt trội so với các hóa chất khác trong quá trình sản xuất vắc xin.
Nghiên cứu này tập trung vào hai loại vắc xin ho gà được sản xuất từ hai chủng Bordetella pertussis khác nhau, cụ thể là Bordetella pertussis 509 (Bp 509) và Bordetella pertussis 134 (Bp 134), với mật độ 33 tỷ vi khuẩn/ml Quá trình bất hoạt được thực hiện ở nhiệt độ 25 độ C.
37 o C trong thời gian 1, 2, 3 ngày /37 o C và 3, 5, 7 ngày /25 o C
Các kết quả được trình bày ở bảng 3.1 và 3.2 cho thấy:
Tất cả các mẫu nghiên cứu D1, D2, D3 (37 o C) và D3, D5, D7 (25 o C) đều cho kết quả kiểm tra sống sót âm tính, chứng minh rằng formalin có khả năng bất hoạt vi khuẩn ho gà ngay cả ở nồng độ thấp nhất 0,05% trong các điều kiện thí nghiệm khác nhau, bao gồm nhiệt độ, thời gian và chủng vi khuẩn ho gà.
Tất cả các mẫu thí nghiệm đều đạt tiêu chuẩn về formalin tồn dư và pH, với mức formalin tồn dư dưới 0,02% và không bị ảnh hưởng nhiều bởi các điều kiện thí nghiệm khác nhau Đặc biệt, mức formalin tồn dư của các mẫu có mối tương quan thuận với nồng độ sử dụng ban đầu.
Các mẫu nghiên cứu D1, D2, D3 (37 o C) và D3, D5, D7 (25 o C) với ba nồng độ formalin 0,05 %, 0,1 % và 0,2 % đều đạt kết quả an toàn đặc hiệu (MWG) trên 60 % Kết quả tốt nhất được ghi nhận ở các mẫu D1, D2 và D3 (37 o C) với nồng độ formalin 0,1 % Thời gian ngưng kết thấp nhất, cho thấy khả năng ngưng kết mạnh nhất, xảy ra ở mẫu D2 và D3/37 o C Điều này cho thấy nồng độ formalin và các điều kiện thí nghiệm (nhiệt độ, thời gian) ảnh hưởng đến hai chỉ tiêu quan trọng nhất, đó là kết quả MWG và khả năng ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu.
- Các phân tích sâu hơn về tính an toàn của nước cốt ho gà bất hoạt formalin được thể hiện ở phần 3.1.2
3.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ chất bất hoạt formalin đến các chỉ số an toàn của nước cốt ho gà sau bất hoạt.
Kết quả thử nghiệm tăng trọng chuột (MWG test)
Chuột nhắt trắng có trọng lượng từ 14 đến 16 g được tiêm mẫu nước cốt ho gà đã được xử lý với các nồng độ formalin 0,05 %, 0,1 % và 0,02 % Mẫu đối chứng được tiêm với nước muối sinh lý, trong khi mẫu bất hoạt nhiệt được xử lý ở nhiệt độ 54 o C trong 30 phút.
Hình 3.1 Theo dõi tăng trọng chuột trong thử nghiệm MWG ở nhiệt độ bất hoạt
Hình 3.2 Theo dõi tăng trọng chuột trong thử nghiệm MWG ở nhiệt độ bất hoạt
Thử nghiệm an toàn đặc hiệu (MWG) là phương pháp xác định độc tính chung của các kháng nguyên trong nước cốt ho gà, do lượng lớn độc tố từ nuôi cấy vi khuẩn ho gà có thể ảnh hưởng đến trọng lượng chuột Toàn bộ độc tính, bao gồm độc tố không bền nhiệt (HLT), độc tố ho gà PT và nội độc tố (endotoxin), được xem là có tác động lớn đến kết quả MWG Do đó, MWG được coi là thử nghiệm xác định độc tính chung hơn là tính độc của từng loại độc tố riêng lẻ Trọng lượng chuột được đo vào ngày thứ 3 (do nội độc tố LPS) và ngày thứ 7 (do PT/LPS) để đánh giá kết quả của thử nghiệm.
Nghiên cứu về tính an toàn của nước cốt ho gà bất hoạt formalin cho thấy ảnh hưởng của nồng độ formalin đến các chỉ số MWG và độc tố HLT, được trình bày qua các hình 3.1, 3.2, 3.3 và 3.4.
Kết quả tăng trọng chuột từ hình 3.1 và 3.2 cho thấy:
Với nồng độ formalin 0,05%, tất cả các mẫu (D2/37 o C và D5/25 o C) cho thấy mức độ tăng trọng chậm hơn so với các mẫu được xử lý với nồng độ formalin 0,1% và 0,2% Đặc biệt, mẫu D5/25 o C ghi nhận sự giảm trọng lượng ở ngày đầu tiên sau khi tiêm, nhưng đến ngày thứ 2, chuột đã phục hồi và tiếp tục tăng trọng cho đến khi kết thúc thời gian theo dõi.
Trong nghiên cứu, chuột được tiêm với nồng độ formalin 0,05 % ở 25 o C cho thấy sự tăng trọng chậm trong 7 ngày, có thể do nồng độ formalin và điều kiện bất hoạt không đủ để loại bỏ độc tố PT Điều này dẫn đến việc giảm trọng lượng chuột trong 24 giờ sau khi tiêm Biểu đồ cho thấy mẫu bất hoạt bằng formalin 0,05 % ở 25 o C có mức tăng trọng kém nhất Ngược lại, với nồng độ formalin 0,1 % và 0,2 % ở các mẫu D2/37 o C và D5/25 o C, chuột bắt đầu tăng trọng ngay từ ngày đầu tiên và tốc độ tăng trọng dần dần nhanh hơn cho đến ngày theo dõi cuối cùng.
Kết quả so sánh tăng trọng chuột giữa các mẫu bất hoạt bằng formalin và mẫu bất hoạt nhiệt 54 o C/30 phút cho thấy mẫu bất hoạt bằng formalin 0,1 % đạt hiệu quả tăng trọng tốt nhất, vượt trội hơn so với các mẫu bất hoạt formalin 0,2 % và phương pháp truyền thống.
Kết quả thử nghiệm xác định độc tố không bền với nhiệt (HLT) cho thấy độc tố này gây hoại tử da, chết và teo lách khi thử nghiệm trên chuột nhắt trắng và thỏ HLT được sinh ra trong pha I của chủng Bordetella pertussis Việc không có mặt của HLT là tiêu chuẩn quan trọng trong việc xuất xưởng vắc xin, và quá trình thẩm định sản xuất cần chứng minh sự vắng mặt của HLT trong vắc xin ho gà sau khi đã được bất hoạt Cả hai tính chất hoại tử và gây chết được sử dụng để đánh giá độc tố này.
Mẫu nước cốt ho gà được xử lý với các nồng độ formalin 0,05 %, 0,1 % và 0,2 % đã được tiêm dưới da thỏ, và sau 4 ngày, đường kính vòng phản ứng được đo Mẫu chứng âm sử dụng nước muối sinh lý, trong khi mẫu đối chứng là nước cốt ho gà được bất hoạt bằng nhiệt ở 54 °C trong 30 phút Kết quả nghiên cứu được trình bày trong hình 3.3 và 3.4.
Hình 3.3 Kết quả hàm lượng tồn dư của độc tố không bền nhiệt (HLT) trong NCHG bất hoạt formalin ở nhiệt độ 25 o C
Hình 3.4 Kết quả hàm lượng tồn dư của độc tố không bền nhiệt (HLT) trong
NCHG bất hoạt formalin ở nhiệt độ 37 o C
Kết quả kiểm tra độc tố HLT cho thấy:
- Với chứng âm là nước muối sinh lý: phản ứng hoàn toàn âm tính
- Với mẫu đối chứng là nước cốt ho gà bất hoạt nhiệt: đường kính trung bình của vòng phản ứng đo được là 4mm
Mẫu thử NCHG được bất hoạt bằng formalin 0,05 % ở 25 o C cho thấy đường kính trung bình của vòng phản ứng lần lượt là 12,1 mm (D3/25 o C), 8,5 mm (D5/25 o C) và 7,4 mm (D7/25 o C) Khi nồng độ formalin 0,05 % được duy trì nhưng nhiệt độ bất hoạt tăng lên 37 o C, đường kính vòng phản ứng của HLT giảm xuống.
Khi thời gian bất hoạt tăng lên, lượng độc tố HLT giảm dần, điều này được thể hiện qua đường kính vòng phản ứng giảm từ 8,2 mm (D1/37 o C) xuống 6,4 mm (D3/37 o C) Mặc dù mẫu D3/37 o C có đường kính vòng phản ứng thấp nhất là 6,4 mm với nồng độ formalin 0,05%, nhưng vẫn cao gấp 1,5 lần so với mẫu đối chứng ở 54 o C trong 30 phút, chỉ đạt 4 mm.
- Với mẫu thử là NCHG bất hoạt formalin 0,1 % và 0,2 % ở cả 2 nhiệt độ bất hoạt
Áp dụng quy trình bất hoạt bằng formalin trên canh khuẩn ho gà sản xuất ở qui mô lớn
3.2.1 Nước cốt ho gà sản xuất trên qui mô lớn từ chủng Bp 509
Chất lượng nước cốt ho gà chủng Bp 509 bất hoạt bằng formalin
Chọn 5 lô canh khuẩn ho gà chủng Bp 509 sản xuất trên nồi lên men B Braun D
Viện IVAC đã tiến hành bất hoạt 300 mẫu theo quy trình thường nhật với các lô số 1111/Pe, 1211/Pe, 1311/Pe, 1411/Pe và 1511/Pe Quá trình bất hoạt sử dụng formalin 0,1% trong thời gian 48 giờ ở nhiệt độ 37°C Kết quả của nghiên cứu được trình bày chi tiết trong bảng 3.6.
Nước cốt ho gà đơn chủng
Ly tâm/ hoàn nguyên thu hồi sinh khối vi khuẩn
Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra chất lượng nước cốt ho gà chủng Bp 509 bất hoạt formalin
Kết quả sau bất hoạt pH Ngưng kết
Chọn 5 lô canh khuẩn ho gà chủng Bp 509 sản xuất trên nồi lên men B Braun D
Viện IVAC thực hiện quy trình bất hoạt nhiệt cho các lô vaccine số 0110/Pe, 0210/Pe, 0310/Pe, 0410/Pe và 0510/Pe ở nhiệt độ 54°C trong 30 phút Kết quả của quá trình này được trình bày chi tiết trong bảng 3.7.
Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra chất lượng nước cốt ho gà chủng Bp 509 bất hoạt bằng phương pháp nhiệt truyền thống (54 o C/30 phút)
Kết quả sau bất hoạt pH Ngưng kết
Kết quả bảng 3.6 và 3.7 cho thấy:
- Các giá trị pH đều nằm trong khoảng cho phép (7,0 – 7,2)
- Các kết quả kiểm tra sống sót đều âm tính nghĩa là vi khuẩn bị giết chết hoàn toàn
Khả năng ngưng kết của các mẫu bất hoạt nhiệt vượt trội hơn so với các mẫu bất hoạt bằng formalin Tuy nhiên, sự khác biệt này không đạt ý nghĩa thống kê với p > 0,05 (F thực nghiệm = 0,87 < F lý thuyết = 5,32).
- Các lô bất hoạt formalin cho kết quả MWG cao hơn các lô bất hoạt nhiệt Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (F thực nghiệm = 5,41 > F =5,32)
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với một số nghiên cứu của một số tác giả trước đây [14], [44]
Hình 3.6 So sánh giá trị trung bình MWG của nước cốt ho gà bất hoạt formalin
0,1 %/37 o C/48 h và bất hoạt nhiệt 54 o C/30 phút chủng Bp 509
Chỉ số LPF cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa NCHG bất hoạt formalin và NCHG bất hoạt nhiệt, trong đó NCHG bất hoạt formalin dẫn đến số lượng bạch cầu tăng thấp hơn so với NCHG bất hoạt nhiệt Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05, với F thực nghiệm đạt 7,64 lớn hơn F lý thuyết là 5,32 (hình 3.6).
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với một số nghiên cứu của một số tác giả trước đây
Hình 3.7 So sánh giá trị trung bình LPF của nước cốt ho gà bất hoạt formalin
Hiệu suất bất hoạt nước cốt ho gà chủng Bp 509 bất hoạt formalin
Bảng 3.8 So sánh hiệu suất bất hoạt của phương pháp bất hoạt formalin và nhiệt trên quy mô sản xuất lớn của chủng Bp 509
Loạt số Trước bất hoạt Sau bất hoạt Hiệu suất
Kết quả bảng 3.8 cho thấy:
Hiệu suất bất hoạt bằng formalin cao hơn 1,26 lần so với phương pháp bất hoạt nhiệt, với tỷ lệ lần lượt là 70,05% và 55,39% Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05, cho thấy ưu điểm vượt trội của phương pháp bất hoạt bằng formalin.
Hình 3.8 So sánh hiệu suất bất hoạt bằng formalin 0,1 %/ 37 o C/48 h và bất hoạt bằng nhiệt 54 o C/30 phút của chủng Bp 509
3.2.2 Nước cốt ho gà sản xuất trên qui mô lớn từ chủng Bp 134
Chất lượng nước cốt ho gà chủng Bp 134 bất hoạt bằng formalin 0,1 %/ 37 o C/ 48 h
Chọn 5 lô canh khuẩn ho gà chủng Bp 134 sản xuất trên nồi lên men B.Braun D
300 theo qui trình thường nhật của Viện IVAC, lô số 1611/Pe, 1711/Pe, 1811/Pe, 1911/Pe và 2011/Pe Tiến hành bất hoạt formalin 0,1 %, 48h ở nhiệt độ 37 o C Kết quả được trình bày ở bảng 3.9
Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra chất lượng nước cốt ho gà chủng Bp 134 bất hoạt bằng formalin
Kết quả sau bấthoạt pH Ngưng kết
Bảng 3.10 Kết quả kiểm tra chất lượng nước cốt ho gà chủng Bp 134 bất hoạt bằng phương pháp nhiệt truyền thống (54 o C/30 phút)
Kết quả sau bất hoạt pH Ngưng kết
Kết quả bảng 3.9 và 3.10 cho thấy:
Ngưng kết cho thấy rằng các mẫu NCHG bất hoạt bằng formalin và NCHG bất hoạt nhiệt có sự khác biệt, tuy nhiên sự khác biệt này không đạt ý nghĩa thống kê với p > 0,05 (F thực nghiệm = 4,33 < F lý thuyết = 5,32).
An toàn đặc hiệu (MWG) cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các mẫu NCHG bất hoạt formalin và NCHG bất hoạt nhiệt Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05, trong đó F thực nghiệm đạt 5,41, vượt qua F lý thuyết là 5,32.
Hình 3.9 So sánh giá trị trung bình MWG của nước cốt ho gà bất hoạt formalin
0,1 %/37 o C/48 h và bất hoạt nhiệt 54 o C/30 phút chủng Bp 134
Hình 3.10 So sánh giá trị trung bình LPF của nước cốt ho gà bất hoạt formalin
Chỉ số LPF cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các mẫu NCHG bất hoạt bằng formalin và nhiệt, trong đó NCHG bất hoạt bằng formalin có chỉ số LPF thấp hơn Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05, với giá trị F thực nghiệm là 5,34 lớn hơn F lý thuyết 5,32.
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với một số nghiên cứu của một số tác giả trước đây
Hiệu suất bất hoạt nước cốt ho gà chủng Bp 134 bất hoạt formalin
Bảng 3.11 So sánh hiệu suất bất hoạt của hai phương pháp bất hoạt formalin và nhiệt trên quy mô sản xuất lớn của chủng Bp 134
Trước bất hoạt Sau bất hoạt
Hình 3.11 So sánh hiệu suất bất hoạt của nước cốt ho gà bất hoạt formalin 0,1 %/
37 o C/48 h và bất hoạt nhiệt 54 o C/30 phút chủng Bp 134
Kết quả bảng 3.11 cho thấy:
Hiệu suất bất hoạt bằng formalin trung bình cao gấp 1,25 lần so với bất hoạt bằng nhiệt, với tỷ lệ lần lượt là 68,22% và 54,44% Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Nước cốt ho gà đơn chủng (Bp 509 hoặc Bp 134) được sản xuất quy mô lớn và bất hoạt bằng formalin có chất lượng vượt trội hơn so với nước cốt ho gà bất hoạt bằng nhiệt Các chỉ số an toàn (MWG và LPF) của nước cốt ho gà bất hoạt bằng formalin đều đạt yêu cầu cao hơn so với NCHG bất hoạt nhiệt ở 54 oC trong 30 phút Đặc biệt, hiệu suất bất hoạt bằng formalin cao gấp 1,25 lần so với NCHG bất hoạt nhiệt.
Thẩm định qui trình bất hoạt formalin trên sản phẩm NCHG hợp chủng (PM) từ nước cốt ho gà đơn chủng bất hoạt formalin
Trong sản xuất vacxin, dây chuyền sản xuất bao gồm nhiều quy trình và theo quy định của GMP, bất kỳ thay đổi nào cũng cần thẩm định lại toàn bộ quy trình bằng cách đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm Việc thẩm định quy trình bất hoạt rất quan trọng, đặc biệt là đánh giá toàn diện các chỉ tiêu chất lượng của nước cốt ho gà từ đơn chủng đến hợp chủng, bao gồm cả tính ổn định của nước cốt ho gà hợp chủng Nghiên cứu này đánh giá chất lượng của 5 lô nước cốt ho gà PM được hỗn hợp từ các lô nước cốt ho gà đơn bất hoạt formalin 0,1%, so sánh với nước cốt ho gà PM từ NCHG đơn bất hoạt nhiệt ở 54°C trong 30 phút.
3.3.1 Đánh giá chất lượng của NCHG hợp chủng PM từ nước cốt ho gà đơn chủng bất hoạt formalin
Nước cốt ho gà đơn chủng, dù được bất hoạt bằng nhiệt truyền thống hay formalin, là nguyên liệu chính để sản xuất nước cốt ho gà hợp chủng PM (vắc xin ho gà).
Bảng 3.12 Đánh giá chất lượng của nước cốt ho gà hợp chủng PM từ NCHG đơn chủng bất hoạt formalin
Phương pháp bất hoạt Lô số
PM.0112 7,17 97,56 9,78 17160 0,0075 0,0012 15000 PM.0212 7,21 92,17 7,80 28440 0,0090 0,0009 18000 PM.0312 7,20 82,45 8,88 20650 0,0070 0,0011 10500 PM.0412 7,22 90,23 7,48 22600 0,0073 0,0014 14400 PM.0512 7,23 84,67 6,41 24640 0,0059 0,0008 32000
Kết quả bảng 3.12 cho thấy:
Tất cả các chỉ tiêu của lô NCHG hợp chủng PM bất hoạt formalin đều đạt yêu cầu chất lượng theo TCCS, với chỉ tiêu về formalin tồn dư rất thấp so với mức tối đa cho phép và chỉ tiêu pH ổn định Mặc dù chỉ tiêu cảm quan không được đề cập trong bảng, nhưng sẽ được đánh giá riêng Phân tích sâu hơn về công hiệu và an toàn (MWG) của nước cốt ho gà PM bất hoạt formalin và bất hoạt nhiệt cho thấy những kết quả tích cực.
Công hiệu và an toàn là hai tiêu chí quan trọng trong việc xuất xưởng vắc xin Kết quả cho thấy công hiệu của các lô NCHG hợp chủng PM bất hoạt bằng formalin thấp hơn so với các lô NCHG hợp chủng PM bất hoạt bằng nhiệt Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 (F thực nghiệm = 0.25 < F lý thuyết = 5,32).
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với một số nghiên cứu của một số tác giả trước đây
Hình 3.12 So sánh giá trị trung bình công hiệu của nước cốt ho gà hợp chủng PM bất hoạt formalin 0,1 %/37 o C/48 h và bất hoạt nhiệt 54 o C/30 phút
Chỉ số an toàn của MWG cho thấy rằng các lô NCHG hợp chủng PM bất hoạt formalin đạt kết quả cao hơn so với các lô NCHG hợp chủng PM bất hoạt nhiệt.
Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05
Hình 3.13 So sánh giá trị trung bình MWG của nước cốt ho gà hợp chủng PM bất hoạt formalin 0,1 %/37 o C/48 h và bất hoạt nhiệt 54 o C/30 phút
Hàm lượng endotoxin trong các mẫu NCHG hợp chủng PM bất hoạt formalin trung bình thấp hơn so với các mẫu PM bất hoạt bằng nhiệt, với giá trị là 17980 EU/ml.
Nghiên cứu cho thấy nồng độ endotoxin trong vắc xin ho gà toàn tế bào Pw đạt 34480 EU/ml, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Endotoxin, thành phần không mong muốn trong vắc xin, luôn có mặt do bản chất của vắc xin này Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo cần giảm nồng độ endotoxin tối đa có thể, đồng nghĩa với việc tối ưu hóa mật độ vi khuẩn trong một liều vắc xin mà vẫn đảm bảo hiệu quả Việc giảm thiểu sự ly giải của vi khuẩn đã được giết chết cũng giúp hạ thấp hàm lượng endotoxin Kết quả này phù hợp với nghiên cứu tại Biken, Nhật Bản, cho thấy rằng việc bất hoạt bằng formalin làm giảm hoạt tính enzyme trong tế bào ho gà, từ đó giảm độc tính và hạn chế ly giải tế bào, dẫn đến lượng endotoxin thấp hơn so với phương pháp bất hoạt bằng nhiệt Điều này có thể giúp giảm phản ứng phụ khi tiêm vắc xin ho gà cho trẻ.
Hình 3.14 So sánh hàm lượng endotoxin của nước cốt ho gà hợp chủng PM bất hoạt formalin 0,1 %/37 o C/48 h và bất hoạt nhiệt 54 o C/30 phút
Chỉ số LPF không phải là tiêu chí chính để xuất xưởng vắc xin, nhưng việc thực hiện chỉ số này được khuyến cáo nhằm theo dõi tính ổn định của quy trình Kết quả cho thấy LPF của các lô PM bất hoạt theo hai phương pháp khác nhau có sự khác biệt, nhưng không đạt ý nghĩa thống kê với p > 0,05.
Phương pháp bất hoạt formalin cho thấy NCHG hợp chủng PM có các chỉ số an toàn (MWG, LPF và endotoxin) vượt trội hơn so với NCHG hợp chủng PM bất hoạt nhiệt.
3.3.2 So sánh tiêu chuẩn cảm quan của nước cốt ho gà hợp chủng PM từ NCHG đơn bất hoạtbằng formalin
Nước cốt ho gà hợp chủng sau khi đạt yêu cầu về các chỉ tiêu chất lượng được lưu trữ ở điều kiện sau:
- Đậm độ : 200 - 220 tỷ VK/ml
Thời gian bảo quản nước cốt ho gà là từ 0 đến 6 tháng Nghiên cứu so sánh tiêu chuẩn cảm quan của hai loại nước cốt bất hoạt bằng hai phương pháp khác nhau thông qua việc đánh giá độ lắng cặn (chỉ số OD) và độ hòa tan (thời gian khuấy mẫu tan hoàn toàn) Các mẫu nước cốt được bảo quản trong cùng một điều kiện và lấy mẫu định kỳ theo thời gian Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.13 và 3.14.
Bảng 3.13 So sánh độ lắng cặn của nước cốt ho gà hợp chủng PM bất hoạt formalin và bất hoạt nhiệt 54 o C/30 phút (n = 5)
Kết quả đo OD của NCHG
T1 : 1 tuần, T2 : 2 tuần, T3 : 1 tháng, T4 : 2 tháng, T5 : 3 tháng, T6 : 6 tháng
Bảng 3.14 So sánh khả năng hoà tan của nước cốt ho gà hợp chủng PM bất hoạt formalin và bất hoạt nhiệt 54 o C/30 phút (n = 5)
Thời gian khuấy làm tan hoàn toàn NCHG (giây)
Từ kết quả bảng 3.13 và 3.14 cho thấy:
So sánh OD của các mẫu nước cốt ho gà trong thời gian bảo quản từ 0 - 6 tháng cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về độ lắng cặn giữa NCHG PM bất hoạt bằng formalin và NCHG PM bất hoạt bằng nhiệt, với p > 0,05 (F thực nghiệm = 0,002 > F lý thuyết = 4,75).
Khả năng hòa tan của NCHG PM bất hoạt bằng formalin vượt trội hơn so với NCHG PM bất hoạt bằng nhiệt, được thể hiện qua thời gian khuấy để làm tan hoàn toàn NCHG bất hoạt bằng formalin ngắn hơn Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05, với F thực nghiệm đạt 8,1 lớn hơn F lý thuyết là 4,96.
Nước cốt ho gà chứa lượng protein cao, khi bất hoạt bằng nhiệt ở 54 oC trong 30 phút, dễ xảy ra hiện tượng vón và tăng độ nhớt, đặc biệt khi bảo quản ở 2 - 8 oC trong thời gian dài từ 3 tháng trở lên Nhiệt độ cao cũng làm nước cốt sậm màu, trong khi quá trình bảo quản kéo dài 5 đến 6 tháng có thể dẫn đến ly giải một lượng lớn tế bào vi khuẩn ho gà Để pha chế vắc xin từ NCHG, cần một lực cơ học lớn để tạo dung dịch huyền phù đồng nhất; tuy nhiên, lực quá mạnh có thể phá vỡ tế bào, ảnh hưởng đến tính an toàn và hiệu quả sản phẩm Khi tế bào bị ly giải, nội độc tố được giải phóng, gây phản ứng phụ khi tiêm vắc xin, đây là hạn chế lớn của nước cốt ho gà bất hoạt bằng nhiệt.
Xây dựng quy trình bất hoạt canh khuẩn ho gà bằng formalin trên quy mô sản xuất lớn
Từ những kết quả nghiên cứu trên, qui trình bất hoạt canh khuẩn ho gà bằng formalin trên quy mô sản xuất lớn được xây dựng như sau:
Hình 3.15 Quy trình bất hoạt canh khuẩn ho gà ở qui mô sản xuất lớn
Nước cốt ho gà đơn chủng
Tách lọc / hoàn nguyên thu hồi sinh khối vi khuẩn
Nước cốt ho gà được xử lý theo phương pháp truyền thống bằng cách bất hoạt ở nhiệt độ 54 o C trong 30 phút Quá trình này bao gồm việc lọc canh khuẩn ho gà qua TFF để loại bỏ nước nổi, thu sinh khối và cô đặc thể tích từ 180 lít xuống còn 15 - 20 lít Để đảm bảo an toàn cho người sử dụng, canh khuẩn ho gà được bất hoạt ngay sau khi kết thúc nuôi cấy, sau đó cô đặc để loại bỏ lượng formalin tồn dư Cuối cùng, canh khuẩn ho gà được ly tâm hoặc lọc bằng TFF để loại bỏ nước nổi và giảm thiểu formalin còn lại trong sản phẩm.
Trong quá trình bất hoạt canh khuẩn ho gà trên nồi lên men 300 lít, việc duy trì vận tốc khuấy từ 200 đến 220 vòng/phút trong suốt 48 giờ là rất quan trọng Vận tốc này giúp tăng cường khả năng tiếp xúc giữa formalin và canh khuẩn, từ đó nâng cao hiệu quả của quá trình bất hoạt.
Ở quy mô thí nghiệm, sinh khối được thu bằng phương pháp ly tâm lạnh ở 4°C với tốc độ 4000 vòng/phút trong 30 phút Tuy nhiên, trong quy mô sản xuất lớn, phương pháp lọc bằng TFF được ưa chuộng hơn do tính hiệu quả và tiết kiệm thời gian.
+ Tiết kiệm thời gian, hiệu suất thu hồi cao
+ Tránh tạp nhiễm do thực hiện trong quy trình kín, không thao tác quá nhiều
- Đậm độ nước cốt ho gà sau khi hoàn nguyên từ 200 - 400 tỷ VK/ml
3.5 Tính ổn định của nước cốt ho gà hợp chủng PM từ nước cốt ho gà đơn chủng bất hoạt formalin
Mục tiêu theo dõi tính ổn định là cung cấp bằng chứng về chất lượng sinh phẩm theo thời gian và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường như nhiệt độ và độ ẩm Qua đó, đưa ra khuyến cáo về điều kiện bảo quản, các giai đoạn thử nghiệm cần lặp lại và hạn sử dụng của sinh phẩm Tính ổn định cũng giúp đánh giá quy trình sản xuất.
Sau đây là kết quả tính ổn định theo thời gian thực của 03 lô nước cốt ho gà
PM (lô số PM.0112, PM.0212, PM.0312) được hỗn hợp từ nước cốt ho gà đơn chủng bất hoạt formalin
Các kết quả về sinh học:
Bảng 3.15 Tính ổn định theo thời gian thực của nước cốt ho gà hợp chủng PM từ nước cốt ho gà đơn chủng bất hoạt formalin (n = 3)
Chỉ tiêu Lô số Thời gian bảo quản (tháng)
Tính ổn định của nước cốt ho gà hợp chủng PM phụ thuộc vào phương pháp bất hoạt Kết quả từ bảng 3.15 cho thấy nước cốt ho gà bất hoạt bằng sinh học đạt hiệu quả, an toàn và chỉ số LPF tương đối cao, phù hợp với các giới hạn về an toàn và công hiệu Tuy nhiên, sau 9 tháng, công hiệu của sản phẩm có xu hướng giảm nhanh chóng WHO khuyến cáo hạn sử dụng của nước cốt ho gà PM không nên vượt quá thời gian quy định.
1 năm Vì thế thời gian sử dụng của nước cốt ho gà sản xuất tại Viện trong giới hạn
6 - 9 tháng là hợp lý Điều này phù hợp với một số nghiên cứu trước đây [14]
- Về an toàn có xu hướng ổn định cao trong khoảng thời gian từ 6 - 9 tháng Sau 9 tháng chỉ số an toàn có chiều hướng tăng nhanh
Các kết quả hóa học:
Hình 3.16 Biến thiên các chỉ số hóa học của nước cốt ho gà hợp chủng PM bất hoạt bằng formalin theo thời gian bảo quản
Từ hình 3.16 cho thấy NCHG hợp chủng PM bất hoạt bằng formalin có :
- Chỉ số pH có tính ổn định cao.
Hàm lượng formalin và merthiolate tồn dư có sự ổn định cao trong khoảng thời gian từ 0 đến 6 tháng Tuy nhiên, sau tháng thứ 6, nồng độ của chúng có xu hướng giảm nhanh chóng và thấp hơn nhiều so với tiêu chuẩn cho phép.
Tính ổn định của nước cốt ho gà hợp chủng PM từ nước cốt ho gà đơn chủng bất hoạt formalin
1 Đã xây dựng được quy trình bất hoạt canh khuẩn ho gà ở quy mô thí nghiệm: nồng độ formalin 0,1 % v/v, nhiệt độ 37 o C, thời gian 48h, đậm độ 33 - 50 tỷ vi khuẩn/ml Sản phẩm nước cốt ho gà thu được đạt các chỉ tiêu về hóa học, vô trùng, an toàn (MWG) theo tiêu chuẩn của WHO và TTKĐQG Đồng thời sản phẩm mới có khả năng dung nạp và đáp ứng miễn dịch tốt trên súc vật thí nghiệm Hiệu suất bất hoạt bằng formalin cao hơn so với phương pháp bất hoạt bằng nhiệt Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Điều này có ý nghĩa kinh tế rất lớn và là ưu điểm nổi trội của phương pháp bất hoạt bằng formalin
2 Đã áp dụng được quy trình bất hoạt bằng formalin trên quy mô sản xuất lớn tạo ra NCHG đơn chủng Bp 509 và Bp 134 có chất lượng cao hơn các chỉ số về an toàn (MWG và LPF) so với NCHG bất hoạt bằng nhiệt 54 o C/30 phút Hiệu suất bất hoạt formalin cao gấp 1,25 lần so với bất hoạt nhiệt
3 Đánh giá thẩm định được chất lượng NCHG bất hoạt bằng formalin thông qua đánh giá chất lượng NCHG hợp chủng PM NCHG hợp chủng PM có các chỉ số về an toàn (MWG, LPF và endotoxin) đều tốt hơn so với NCHG hợp chủng PM bất hoạt nhiệt Riêng về chỉ số công hiệu thấp hơn so với sản phẩm bất hoạt bằng nhiệt nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Đã xác định tính ổn định của NCHG hợp chủng PM bất hoạt bằng formalin (6 - 9 tháng) đồng thời xây dựng tiêu chuẩn qui trình bất hoạt canh khuẩn ho gà bằng formalin ở quy mô sản xuất lớn.
