Nghiên cứu thành phần hóa học của cây một lá (Nervillia aragoana) họ lan trân châu Orchidaceae.

Nghiên cứu thành phần hóa học của cây một lá (Nervillia aragoana) họ lan trân châu Orchidaceae. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây một lá (Nervillia aragoana) họ lan trân châu Orchidaceae. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây một lá (Nervillia aragoana) họ lan trân châu Orchidaceae. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây một lá (Nervillia aragoana) họ lan trân châu Orchidaceae. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây một lá (Nervillia aragoana) họ lan trân châu Orchidaceae. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây một lá (Nervillia aragoana) họ lan trân châu Orchidaceae. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây một lá (Nervillia aragoana) họ lan trân châu Orchidaceae. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây một lá (Nervillia aragoana) họ lan trân châu Orchidaceae. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây một lá (Nervillia aragoana) họ lan trân châu Orchidaceae.

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Xác định cấu trúc các hợp chất

Trong phần thực nghiệm, bột cây N aragoana (4 kg) đã được ngâm chiết trong dung môi EtOH 96%, thu được cao tổng EtOH - NA.Et với khối lượng 280,0 g Phương pháp chiết lỏng - lỏng đã được áp dụng để phân đoạn chiết xuất, cho ra các cao phân đoạn gồm cao n-hexane - NA.H (110,0 g), cao CHCl3 - NA.C (25,0 g), cao EtOAc - NA.E (90,0 g) và cao nước - NA.W (45,0 g).

Các cao chiết đã được xác định hoạt tính gây độc trên hai dòng tế bào MCF-7 và HepG2 ở nồng độ 100 µg/mL, như trình bày ở mục 2.3.3.2 Thử nghiệm được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử, Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, và đã thu được kết quả đáng chú ý.

Bảng 3.1 Hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết

Dòng tế bào Cao chiết Phần trăm gây độc tế bào (%)

Kết quả thử nghiệm cho thấy các loại cao chiết đều không có hoạt tính gây độc trên

2 dòng tế bào MCF-7 và HepG2

Phương pháp xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase của cao tổng và các cao phân đoạn được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa dược, khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, với kết quả đáng chú ý được trình bày trong mục 2.3.3.1.

Bảng 3.2 Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết

Cao chiết IC 50 (àg/mL)

Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các loại cao chiết cho thấy giá trị IC50 của chúng đều thấp hơn so với acarbose (138,4 àg/mL), chứng tỏ hiệu quả ức chế cao Cụ thể, hoạt tính ức chế tăng dần theo thứ tự: cao tổng chiết trong EtOH (NA.Et) với 79,9 àg/mL, cao n-hexane (NA.H) 37,6 àg/mL, cao EtOAc (NA.E) 35,4 àg/mL và cao CHCl3 (NA.C) 18,4 àg/mL.

Kết quả xác định hoạt tính cho thấy các loại cao chiết không gây độc tế bào MCF-7 và HepG2, nhưng có hoạt tính ức chế α-glucosidase mạnh ở cao NA.H, NA.E và NA.C Mặc dù TLC của cao NA.H và NA.C có các vết tương đồng, cao NA.H lại nhiễm béo nhiều, vì vậy cao NA.C và NA.E được chọn để phân lập.

Cao NA.C (25 g) đã được tiến hành chiết xuất và phân tích bằng phương pháp CC và TLC, từ đó phân lập được 9 hợp chất với các ký hiệu lần lượt là NA.03 (6,0 mg), NA.04 (26,0 mg), NA.05 (12,0 mg), NA.06 (17,0 mg), NA.07 (12,0 mg), NA.08 (8,0 mg), NA.09 (15,0 mg), NA.10 (14,0 mg) và NA.11 (10,0 mg).

Cao NA.E (90,0 g) đã được tiến hành chiết xuất (CC) và sắc ký lớp mỏng (TLC), dẫn đến việc phân lập thành công 16 hợp chất, được ký hiệu lần lượt là NA.01 (10,0 mg), NA.02 (14,0 mg), NA.12 (20,0 mg), NA.13 (8,0 mg), NA.14 (18,0 mg), NA.15 (32,0 mg), NA.16 (17,0 mg), NA.17 (11,0 mg), NA.18 (15,0 mg), NA.19 (10,0 mg), NA.20 (23,0 mg), NA.21 (14,0 mg), NA.22 (17,0 mg), NA.23 (8,0 mg), NA.24 (14,0 mg) và NA.25 (26,0 mg).

Sau đây là phần biện luận để xác định cấu trúc của các hợp chất trên

3.1.1 Các hợp chất thuộc nhóm cycloartane

3.1.1.1 Hợp chất NA.01 (nerviside I, chất mới)

Hình 3.1 Cấu trúc hóa học và tương quan HMBC, NOESY của hợp chất NA.01

Hợp chất NA.01 được phân lập từ cao NA.E (Sơ đồ 2.3), thu được dạng bột, màu trắng

Phổ khối HR-ESI-MS của hợp chất NA.01 cho thấy mũi ion phân tử giả [M-H] - tại m/z 651,4103, gần với giá trị lý thuyết m/z 651,4114, với sai số chỉ 1,1 mmass Kết quả này xác nhận công thức phân tử của hợp chất là C36H60O10.

Phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , δ H ppm) (Phụ lục 1.2) của hợp chất NA.01 cho thấy ở vùng trường cao xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 1 cặp mũi đôi proton geminal ở δ H 0,36 và δ H 0,56 (1H; d; 4,0; H2-19) tương ứng với các proton methylene ở vị trí 19 của vòng cyclopropane của một cycloartane triterpene [60, 61]; 2 proton oxy methine ở δ H 3,34 (1H, brs, H-1); 4,40 (1H; dd; 12,0; 4,5; H-3); 6 tín hiệu proton methyl ở δ H 0,91 (3H, s, H-

Trong phân tích NMR, các tín hiệu quan trọng được ghi nhận bao gồm 0,82 (3H, s, H-21), 0,80-0,82 (3H; m; H-26, H-27), 0,97 (3H, s, H-29) và 0,89 (3H, s, H-30) Bên cạnh đó, tín hiệu cộng hưởng của proton anomer của phân tử đường xuất hiện ở δ H 4,14 (1H; d; 7,5; H-1'), cùng với các proton oxy methine và oxy methylene trong khoảng 2,88-3,66 ppm.

Phổ 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 , δ C ppm) (Phụ lục 1.3), phổ DEPT (Phụ lục

Hợp chất NA.01 được phân tích qua phổ 1H và HSQC, cho thấy tổng cộng 36 tín hiệu carbon Trong số đó, 31 tín hiệu có liên quan đến khung triterpenoid, trong khi 5 tín hiệu còn lại thuộc về đơn vị monosaccharide Cụ thể, 31 tín hiệu carbon cộng hưởng của phần aglycone bao gồm 6 carbon methyl tại các vị trí δ C 18,0 (C-18), 18,3 (C-21), 17,1 (C-26, C-27), 9,5 (C-29) và 19,1 (C-30), cùng với 11 nguyên tử carbon methylene tại các vị trí δ C 36,1 (C-2), 22,0 (C-6), 25,1 (C-7), 25,0 (C-11), 32,6 (C-).

12), 35,3 (C-15), 27,8 (C-16), 28,8 (C-19), 29,0 (C-22), 30,8 (C-23) và 64,7 (C-31) nối với oxy; 8 nguyên tử carbon methine ở δ C 36,6 (C-5), 47,5 (C-8), 51,9 (C-17), 36,4 (C-20), 32,3 (C-25), và 70,8 (C-1), 78,8 (C-3) mang oxy; và 7 carbon tứ cấp ở δ C 53,0 (C-4), 21,1 (C-

9), 28,9 (C-10), 44,8 (C-13), 48,7 (C-14) và 74,6 (C-24) nối với oxy (C-24) và 1 carbon carboxyl δ C 178,5 (C-28) Tín hiệu cộng hưởng của đơn vị đường bao gồm δ C 104,1 (C-1');

Phân tích kết hợp phổ HMBC (Phụ lục 1.6), COSY (Phụ lục 1.7) đã xác định được đầy đủ các tín hiệu 1 H và 13 C cho hợp chất NA.01 (Bảng 3.4)

Phân tích phổ hai chiều HMBC cho thấy trong vòng A có một nhóm methyl và một gốc carboxylic acid nối vào vị trí δ C 53,0 (C-4), dựa trên tương quan của proton oxy methine ở δ H 4,40 (H-3) và methyl ở δ H 0,97 (3H, s, H-29) với carbon ở δ C 53,0 (C-4) và δ C 178,5 (C-28) Thêm vào đó, ba proton ở δ H 0,97 (3H, s, H-29) tương quan với carbon ở δ C 78,8 (C-3) Một nhóm hydroxyl được gắn ở vị trí δ C 70,8 (C-1) dựa trên tương quan của các proton ở δ H 0,36 và δ H 0,56 (1H; d; 4,0; H-19), δ H 4,40 (1H; dd; 12,0; 4,5; H-3) và δ H 2,41 (1H; dd; 12,5; 4,0; H-5) đến vị trí δ C 70,8 (C-1) Tín hiệu H-1 xen lẫn tín hiệu của nước cộng hưởng ở δ H 3,34 ppm, cho thấy sự xuất hiện của nhóm α-hydroxyl.

Tín hiệu H-3 xuất hiện dưới dạng mũi đôi có hằng số ghép cặp J aa = 12,0 Hz và J ae

Tín hiệu 4,5 Hz xác định vị trí β-hydroxyl và độ dịch chuyển ở δ C 78,8 (C-3) của aglycone cho thấy monosaccharide liên kết tại vị trí này Điều này được xác nhận qua tương quan HMBC của proton ở δ H 4,14 (1H; d; 7,5; H-1') với δ C 78,8 (C-3) Phổ 1 H-NMR trong vùng δ H 2,5-4,5 ppm xác nhận sự hiện diện của một saccharide duy nhất, được xác định là β-xylose dựa trên tín hiệu mũi ba proton ở δ H 2,97 (1H; t; 11,5; H-5') và δ H 3,66 (1H; dd; 11,5).

5,0; H-5') [62] Cấu hình β-xylopyranose được khẳng định dựa vào hằng số ghép lớn của proton anomer của H-1' (J = 7,5 Hz)

Phổ HMBC cho thấy mối tương quan giữa proton oxy methylene cộng hưởng ở δH

3,25 (2H, m, H-31) với δ C 30,8 (C-23), δ C 74,6 (C-24) và δ C 32,3 (C-25) xác định sự xuất hiện của nhóm hydroxy methyl ở C-24, giống với chuỗi của các chất nerviside đã được báo cáo trước đây [66, 67]

Phổ COSY của hợp chất NA.01 cho thấy mối tương quan giữa các proton trong vòng xylopyranose, với độ dịch chuyển hóa học và các giá trị hằng số ghép cặp hoàn toàn phù hợp với các giá trị J đã được báo cáo trước đây cho β-D-xylopyranose.

Phổ NOESY (Phụ lục 1.8) của hợp chất NA.01 cho thấy các tương quan giữa các proton ở δ H 3,34 (1H, brs, H-1), δ H 0,36 và δ H 0,56 (1H; d; 4,0; H-19), và δ H 0,97 (3H, s, H-

29) xác định hướng β của chúng, do đó vị trí α của nhóm 4-COOH cũng được xác định

Hóa học lập thể của các vòng A/B/C/D [71] được cung cấp bởi dữ liệu 1 H-NMR và

13C-NMR của hợp chất NA.01 gần giống với các cycloartane triterpene [72], nerviside A-

C-24 có thể được xác định cấu hình tuyệt đối thông qua các phép tính độ dịch chuyển hóa học 13 C-NMR, sử dụng mô hình đơn giản gồm hai vòng C và D Phương pháp cấu trúc điện tử được áp dụng cho các cấu trạng có năng lượng thấp nhất của hai đồng phân epimer C-24, được xác định nhanh chóng bằng cách quét bề mặt năng lượng từ các tọa độ trong các CIF tinh thể học tia X liên quan đến dẫn xuất cycloartane So sánh dữ liệu 13 C-NMR mô phỏng với dữ liệu phổ thực tế cho thấy cấu hình 24R với độ tin cậy đạt 99,2%.

Bảng 3.3 Kết quả tính toán DFT cho hai epimer 24R và 24S của hợp chất NA.01

Vị trí 24R 24S Dữ liệu phổ thực tế của NA.01

Hình 3.2 Cấu trúc hóa học của hợp chất nerviside C, D

Từ những dữ liệu trên và so sánh với tài liệu [22] (Bảng 3.4) và (Hình 3.2), hợp chất

NA.01 là 3β-O-D-xylopyranosyl-1a,24R,31-trihydroxylcycloartan-28-oic acid Kiểm tra trên Scifinder ngày 17/04/2019 tại trường Đại học Chulalongkorn Thái Lan cho kết quả chất mới, được đặt tên là nerviside I (Hình 3.1)

Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất NA.01

Hợp chất NA.01 (DMSO-d 6 ) Nerviside D

3.1.1.2 Hợp chất NA.02 (nerviside J, chất mới)

Hình 3.3 Cấu trúc hóa học và tương quan HMBC của hợp chất NA.02

Hợp chất NA.02 được phân lập từ cao NA.E (Sơ đồ 2.3), dạng chất rắn vô định hình, màu trắng

Hoạt tính sinh học của các hợp chất

3.2.1 Hoạt tính ức chế enzyme a -glucosidase

Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất tinh khiết được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa dược, khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Kết quả thử nghiệm được trình bày chi tiết trong Bảng 3.30.

Bảng 3.30 Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các chất tinh khiết

Thứ tự chất Tờn chất IC50 (àM)

NA.07 4',5,6,7-Tetramethoxyflavone >250 NA.08 5-Hydroxy-7-methoxyflavone >250 NA.10 5,7-Dihydroxy-3',4'-dimethoxyflavone >250

Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của 19 hợp chất tinh khiết được thể hiện trong Bảng 3.30, cho thấy rằng giá trị IC50 của các hợp chất NA.03, NA.04, NA.05, NA.06, NA.07, NA.08, NA.10, NA.11, NA.16 và NA.23 lớn hơn 250 àM, cao hơn so với đối chứng acarbose (214,5 àM) Các hợp chất còn lại có giá trị IC50 thấp hơn, trong đó khả năng ức chế enzyme α-glucosidase được sắp xếp theo thứ tự từ cao nhất đến thấp là: NA.25, NA.18, NA.20, NA.22 và NA.15.

Trong nghiên cứu về hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, các hợp chất NA.12, NA.13, NA.21, và NA.14 cho thấy khả năng ức chế lần lượt là 1,4; 31,6; 35,6; 36,9; 42,0; 62,8; 68,3; 86,6; và 97,7 àM Hợp chất NA.25 có khả năng ức chế mạnh nhất, gấp 153,2 lần so với đối chứng acarbose, tuy nhiên kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu về caffeic acid trong điều trị đái tháo đường type 2 với IC50 0,90 àM Các hợp chất NA.18, NA.20, NA.22, và NA.15 có khả năng ức chế cao gấp 5,1-6,8 lần, trong khi NA.12, NA.13, NA.21, và NA.14 cao gấp 2,2-3,4 lần so với acarbose Đặc biệt, hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của isoquercitrin có IC50 36,9 àM, thấp hơn so với kết quả nghiên cứu trước đó (24,0 àM).

Tiềm năng ức chế α-glucosidase của flavonoid đã được nghiên cứu rộng rãi, cho thấy mối quan hệ giữa các nhóm thế trên cấu trúc của chúng Các nghiên cứu chỉ ra rằng nhóm hydroxyl tại vị trí C-3, C-5 và C-4' tăng cường khả năng ức chế α-glucosidase, trong khi nhóm methyl hoặc đường tại C-3, C-7 lại làm giảm tác dụng này Đặc biệt, nhóm hydroxyl tự do ở C-4' được coi là quan trọng do khả năng tạo tương tác chính với enzyme Nghiên cứu về α-glucosidase của S cerevisiae cũng chỉ ra rằng các nhóm hydroxyl ở C-3, C-7 và oxy carbonyl ở C-4, cùng với các nhóm hydroxyl của vòng B, là những yếu tố chính tăng cường liên kết thông qua liên kết hydrogen.

Hình 3.31 Ảnh hưởng của các nhóm thế flavonoid lên hoạt tính ức chế α-glucosidase

Nghiên cứu hoạt tính ức chế α-glucosidase của tám hợp chất flavonol (NA.18, NA.20, NA.22, NA.15, NA.12, NA.13, NA.21, NA.14) cho thấy tất cả đều có nhóm hydroxyl tự do ở vị trí C-5 và C-4', cùng với nhóm oxy carbonyl ở vị trí C-4 Sự khác biệt trong mức độ ức chế α-glucosidase giữa các hợp chất này là do các nhóm thế khác nhau gắn ở các vị trí C-3, C-7 và C-3', bao gồm hydroxyl, methoxy và O-glycoside.

3.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào

Phương pháp thử hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào khối u MCF-7 và K562 với các chất tinh khiết NA.01 và NA.02 đã được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử, Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Kết quả thử nghiệm cho thấy hiệu quả của các chất này trong việc ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

Bảng 3.31 Hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất NA.01 và NA.02

Dũng tế bào Hợp chất IC50 (àM)

Kết quả thử nghiệm cho thấy cả hai hợp chất NA.01 và NA.02 đều có hoạt tính trung bình chống lại hai dòng tế bào ung thư Theo tài liệu [19, 22], các hợp chất nerviside A-H không có hoạt tính gây độc tế bào HepG2, kết hợp với kết quả thử hoạt tính của các loại cao chiết (Bảng 3.2), do đó không tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc trên dòng tế bào HepG2 này.

Nghiên cứu đã đánh giá hoạt tính sinh học và khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của các cao tổng, cao phân đoạn và 19 hợp chất tinh khiết Hai loại cao NA.C và NA.E cho kết quả IC50 lần lượt là 18,4 và 35,4 (àg/mL) Các hợp chất ức chế enzyme α-glucosidase chủ yếu thuộc nhóm flavonol và acid caffeic, trong đó flavonol có hoạt tính ức chế mạnh hơn từ 2,2 đến 6,8 lần, còn acid caffeic thể hiện hoạt tính mạnh nhất gấp 153,2 lần so với acarbose Ngoài ra, hợp chất nerviside I và nerviside J cho thấy hoạt tính gây độc tế bào trung bình trên hai dòng tế bào K562 và MCF-7.