VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
- Thời gian nghiên cứu từ tháng 9/2016 – 4/2017.
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Mẫu gà Lương Phượng từ mọi lứa tuổi với triệu chứng hô hấp nghi ngờ mắc bệnh ORT đã được thu thập tại trang trại ở tỉnh Bắc Ninh.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Đánh giá tình hình chăn nuôi của các huyện trên địa bàn tỉnh Bắc Ninh
Nghiên cứu dịch tễ học về bệnh suy giảm hô hấp do vi khuẩn ORT đã xác định được các yếu tố quan trọng như lứa tuổi mắc bệnh, mùa vụ, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong Những thông tin này giúp hiểu rõ hơn về sự lây lan và tác động của bệnh, từ đó hỗ trợ trong việc xây dựng các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.
- Chẩn đoán bệnh lâm sàng và chẩn đoán dựa vào phòng thí nghiệm:
Triệu chứng, bệnh tích của bệnh ORT;
Kết quả nuôi cấy và phân lập vi khuẩn ORT;
Giám định đặc tính sinh hóa của chủng ORT phân lập được
- Tính mẫn cảm của chủng ORT phân lập được với kháng sinh.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ
Sau khi phát hiện triệu chứng bệnh, cần tiến hành thu thập và thống kê tỷ lệ mắc bệnh cùng tỷ lệ tử vong Đồng thời, xác định thời điểm bệnh xuất hiện, vật mang truyền bệnh và con đường lây truyền để có biện pháp phòng ngừa hiệu quả.
3.5.2 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng
Sau khi thu thập mẫu, quan sát triệu chứng lâm sàng, quay phim, chụp ảnh, ghi chép số liệu từng cá thể và toàn đàn
Gà mắc bệnh ORT được cố định trên bàn mổ hoặc khay mổ, sau đó tiến hành mổ khám theo trình tự từ trên xuống dưới Quá trình này giúp bộc lộ các khí quan để quan sát và phát hiện những biến đổi bệnh tích đại thể.
3.5.4 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản
Các mẫu được lấy theo quy định của ngành
Mẫu cơ quan tổ chức cần được lấy đúng cách, bao gồm việc chọn đúng cơ quan và đúng vùng tổn thương điển hình Bên cạnh đó, cần đảm bảo đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và lượng mẫu cần thiết để đạt được kết quả chính xác.
Mẫu có thể được lấy từ dịch hầu họng, dịch khí quản và dịch phế quản, phổi của gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi Các phương pháp lấy mẫu này giúp xác định tình trạng sức khỏe của gà và hỗ trợ trong việc chẩn đoán bệnh.
Để lấy mẫu dịch ngoáy mũi và dịch ngoáy hầu họng của gà bệnh, sử dụng tăm bông vô trùng ngoái sâu vào lỗ mũi hoặc hầu họng đã được lau sạch bằng cồn 70° Sau khi lấy mẫu, để tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trường vận chuyển như Stuart TranspORT Medium, môi trường nước thịt vô trùng hoặc dung dịch PBS Đậy nút ống nghiệm, ghi nhãn và đưa về phòng thí nghiệm trong thời gian 2-8 giờ Nếu khoảng cách đến phòng thí nghiệm xa, cần bảo quản môi trường vận chuyển trong tủ lạnh.
Để thu thập dịch khí quản hoặc dịch phế quản, sử dụng kéo vô trùng cắt dọc theo khí quản hoặc phế quản Sau đó, dùng tăm bông vô trùng đưa vào ống để lấy dịch Cuối cùng, đặt tăm bông vào môi trường thích hợp, đậy nắp, ghi nhãn và chuyển đến phòng thí nghiệm.
- Với mẫu là tổ chức phổi: sau khi mổ khám gà, dùng kéo vô trùng cắt lấy tổ chức phổi ở vùng định xét nghiệm
PCR được áp dụng để phát hiện các tác nhân gây bệnh ORT trong mẫu dịch khí quản từ gà bị bệnh nặng Quy trình PCR bao gồm các thành phần chính như đoạn DNA mục tiêu, các mồi có trình tự bổ sung với DNA mục tiêu, hỗn hợp bốn loại base và enzyme DNA-polymerase thích hợp.
Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR
Lấy bệnh phẩm được bảo quản ở tủ -80ºC cho tan đá
Để chuẩn bị mẫu bệnh phẩm, cắt nhỏ và cho vào ống Eppendorf 1,5ml, sau đó nghiền nát với môi trường DMEM cho đến khi đạt được huyễn dịch đồng nhất Tiến hành ly tâm để loại bỏ phần cặn, và bảo quản dung dịch thu được ở -80°C cho đến khi sử dụng Lưu ý rằng tất cả các thao tác phải được thực hiện trong buồng cấy vô trùng, với hóa chất và dụng cụ đều phải được khử trùng trước và sau khi sử dụng.
Tách chiết DNA bằng Kít QIA gen
Sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số theo các bước:
Bước 1: Cho 20àl Proteinase K vào ống Eppendorf Thờm 180 àl Buffer ATL, trộn đều ủ ở 56 o C trong 3 giờ
Bước 2: Thờm 4àl ARNase và 200 àl Buffer AL Ủ ở 70 o C trong 30 phỳt Bước 3: Thờm 200 àl Ethanol (96 - 100%), trộn đều
Bước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch ở dưới
Bước 5: Thờm 500àl Buffer AW1, rồi ly tõm 8000 vũng/phỳt trong 1 phút, bỏ dịch dưới
Bước 6: Thờm 500àl Buffer AW2, ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 2 phút, bỏ dịch dưới Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên
Chuyển cột lọc chứa ADN hệ gen vi khuẩn sang ống Eppendorf 1,5ml, thêm 100 µl Buffer AE và để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau đó, ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu dịch lỏng bên dưới và bảo quản ở -20°C.
Cách tiến hành chạy PCR
Mẫu DNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl)
To amplify the rnn gene segment, specific primer pairs are utilized: OR16S - F1: GAG AAT TAA TTT ACG GAT TAA G and OR16S - R1: TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT (Van and Hafez, 1999).
Tên mồi Trình tự nucleotide 5 ’ -3 ’ Kích thước
Mồi ngược TTC GCT TGG TCT CCGAAGAT
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Chu kỳ
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
Cách tiến hành điện di trên gel agarose đọc kết quả
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Để chuẩn bị bản gel, hòa tan 1,2 gram agarose trong dung dịch đệm TBE 1X và đặt vào lò vi sóng ở 100°C trong 5 phút Sau đó, để nguội đến 45-50°C và bổ sung 3 μl Ethidium bromide (nồng độ 10 μg/μl) Tiếp theo, đổ hỗn hợp vào khuôn đã cài sẵn để tạo hình bản gel Khi bản gel đã đông cứng, đặt vào bể điện di và đổ dung dịch đệm TBE ngập bản gel.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thờm 2 àl loading dye vào 8 àl sản phẩm PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA thường sử dụng từ 4-6 àl DNA marker
Nguồn điện trong điện di sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút
Sau khi thực hiện điện di, các đoạn DNA được phát hiện bằng máy phát tia UV, sau đó chụp ảnh và lưu trữ kết quả Sản phẩm PCR có độ dài 784 bp đã được điện di trên gel 1,2% trong môi trường TBE 1X.
- Mẫu dương tính với vi rút khi giếng chứa mẫu điện di xuất hiện vạch DNA tương ứng với độ dài đoạn gen nhân lên bp
- Mẫu âm tính khi không xuất hiện vạch DNA tương ứng với độ dài đoạn gen khuếch đại
3.5.6 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn là quá trình tách riêng vi khuẩn từ quần thể ban đầu để thu được vi khuẩn ở dạng thuần khiết Vi sinh vật thuần khiết được tạo ra từ một tế bào ban đầu, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật.
Vi khuẩn phát triển trong điều kiện hiếu khí, hiếu khí tùy tiện và yếm khí tùy tiện, với nhiệt độ tối ưu là 37°C, nhưng vẫn có thể sinh trưởng ở khoảng 30 - 42°C Chúng phát triển mạnh mẽ khi được bổ sung 5 - 10% máu cừu vào môi trường nuôi cấy, bên cạnh khả năng sinh trưởng trên môi trường tryptose soy agar và chocolate agar.
3.5.7 Phương pháp thử các đặc tính sinh hóa
+ Phản ứng thử Oxidase: Phát hiện khả năng sinh enzyme cytochrom oxidase của vi khuẩn
NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU
Gà và các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ mắc bệnh ORT, bao gồm phổi, khí quản, phế quản và mẫu Swab (dịch ngoáy miệng, ổ khí quản), được thu thập từ các trang trại chăn nuôi gà ở các huyện thuộc tỉnh Bắc Ninh.
Trong lĩnh vực nghiên cứu và thí nghiệm, các thiết bị như tủ ấm, tủ -80 độ C, kính hiển vi, máy ly tâm, máy vortex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp gel, máy hấp ướt, tủ sấy khô, tủ lạnh bảo quản mẫu và tủ lạnh bảo quản môi trường đóng vai trò quan trọng Những thiết bị này không chỉ hỗ trợ trong việc bảo quản và xử lý mẫu mà còn nâng cao hiệu quả và độ chính xác trong các thí nghiệm khoa học.
Dao, kéo, panh kẹp, khay, đèn cồn, eppendorf, lanmen, lam kính, bộ dụng cụ nhuộm, ống nghiệm, đĩa lồng, pipet, dụng cụ bảo hộ…
- Hoá chất nhuộm Gram: tím Genxian, đỏ fucxin, cồn axetol 70 độ, dung dịch lugon
- Thử phản ứng oxydase: giấy thử phản ứng oxydase tẩm 1% dung dịch Tetrametyl-p Phenylenediamine hydrochloride
- Thử phản ứng indol: thuốc thử Kovac ’ s, nước trypton
- Kit QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN để chiết tách DNA
- Thử phản ứng kháng sinh đồ: các loại kháng sinh.
