HPLC là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).
1.8.1. Nguyén ly
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968
trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cô điền. HPLC là một
phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiêu phân hoặc một chất lỏng phú lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phát triển rất nhanh từ cuối những năm 1980. Việc sử dụng các chất nhồi có kích thước nhỏ (5-10tm) làm cho hiệu quả tách của phương pháp này tốt hơn so với phương pháp lỏng cổ điền.
Có thể nói một cách đơn giản HPLC là một sắc ký cột (column chromatography) đi kèm với một detector nhạy để có thể phát hiện được các chất tách ra trong quá trình chạy sắc ký. Với những tiến bộ kỹ thuật về cột, detector đã chuyên sắc ký cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất cao. Loại này cần phải có hệ thống bơm cao áp để đây pha động với áp suất cao đến khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lưu lượng vài mililit/phút qua cột tách. Lượng mẫu phân tích bằng HPLC chỉ cần khoảng 20ul.
Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường...
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có khả năng tách các hợp chất đặc thù như:
- Các hợp chất cao phân tử và ion thuộc các đối tượng nghiên cứu y học, sinh học...
- Các hợp chất tự nhiên không bền.
- Các hợp chất kém bên nhiệt, các chất dễ nd.
Các hợp chất trên gồm co: nucleozit, nucleotit, axit amin, dudng, polisacarit, sic t6 thuc vat, axit hitu co, lipit không phân cực và phân cực, chất màu, dược phẩm, chất hoạt động bề mặt, vitamin, khang sinh, ...
Điều khác biệt giữa HPLC và GC là trong phương pháp HPLC, mẫu
chỉ cần làm hoà tan mà không cần làm bay hơi, do đó HPLC có thể phân tích
được các chất mà không sợ gây ra sự phân hủy nhiệt trong quá trình phân tích.[3]
1.82 Phân Loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:
Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn(adsorption/liquid chromatography).
Sắc ký phân bó (partition chromatography).
Sắc ký ion (ion chromatography).
Sac ky ray phân tir (size exclusion/gel permeation chromatography).
Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thé phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất
phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000).
SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường (hay còn gọi là sắc ký pha thuận) — SKPT (normal phase chromatography) va sic ky pha dao — SKPD (reversed phase chromatography).
Trong sắc ký ion : Pha tĩnh là các chất hữu cơ mang các nhóm hoạt động khác nhau: cation đề tách các kim loại kiểm và kiềm thổ, amonium, các amin-anion đê tách các anion vô cơ, phosphate hữu cơ.
Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm.
SKPĐ là thuật ngữ đề chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động. Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực. Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng
mà lại rẻ tiền. Do đó, SKPĐÐ được ứng dụng nhiều và phố biến hơn SKPT.[S]
1.83. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý — sac ky long-léng (liquid-liquid chromatography). Pha tinh liên kết hóa học với chất nền — sắc ký pha liên két (bonded phase chromatography).
Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng - lỏng vì một số nguyên nhân sau:
Pha tinh trong hệ sắc ký léng-léng dé bi hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích.
Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thê ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi.
Vi vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bó pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này.
Bề mat cac hat silica — SiO2 (cdc hat này có đường kính 3, 5 hoặc 10 um) được xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với HCI 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH như sau (thông thường chỉ có khoảng 8 mol SiOH/m2 bề mặt):
OH OH OH OH
| 0.1 0.10. | 3s” si” XS Si
Hình 1.8: Bê mat silica đã thủy phân
Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các organochlorosilan dé tao ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.
⁄ (8 7
<a + —s ———*> =e + Hcl
CH, CH;
Hình 1.9: Tạo nhánh trên bề mặt silica
Thường chỉ khoảng 50% nhóm -OH mất H+ để tạo ra HCI (tức <
4umol/m2 bê mặt bị silan hóa) vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng bởi hiệu
ứng lập thể. Ngoài nhóm CI người ta còn sử dung -OCH3.
Hợp chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bởi những lực lượng tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tinh.
Trong SKPD, nhom thé R trong hop chat siloxan hầu như không phân cực hoặc it phan cuc. Do la cac ankyl day dai nhu C8 (n-octyl), C18 (n- octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Người ta nhận thấy các alkyl day dai cho két qua tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất.
CisH37 CisH37 H3C—Si—CH3 H3C—Si—CH3
oe
—O—SI—O—SI—O—Ši—O—
Hình 1.10: Cấu trúc của cột ODS
Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn nhóm -OH chưa phản ứng, gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy môi trường pH phân tích.
Trong môi trường qua acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether (-O-Si-C¡s) ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không còn tương tác tốt với pha tĩnh nữa.
Trong môi trường bazơ (pH > 7). chính nên silic mang pha tĩnh có thê bị hòa tan (SiO; thành silicat), hệ quả là số đĩa lý thuyết N giảm và số nhánh ghép cũng giảm, mũi sắc ký rộng ra và thời gian lưu cũng có thê giảm. Kết quả phân tích như vậy sẽ mất đi độ chính xác.
Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các chất như trimethylchlorosilan CISi(CH:)s hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dung hon) dé tương tác với nhóm —OH này (gọi là hiện tượng end-capping). Lúc này ta sẽ có loại cột ít tương tác với chất phân tích có tính bazơ (cột LC-DB của hãng SUPELCO).
CisH37 Ta CigH37
H3C—Si—CH H3C—Si—CH3 H,C—Si—CHy
| Sĩ: | Ỉ ‘Sr
| |
Hình 1.11: Cấu trúc cột LC-DB
Có một cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm —OH mà không cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của -Si(CH;)z-C¡s bằng những nhóm thế lớn hơn như ¡sopropyl để những nhóm này sẽ che đi những nhóm -OH, cần trở tương tác của nhóm -OH với chất cần phân tích.
a C\gH37 CigH37
**SCH-Si-CH’ ` CH-Si-CH: ” CC O ẽ `Z OH O OL CHG
| | |
—O0—SI—0—SiI—O—Si-O—
Hình 1.12: Cấu trúc cột có gốc isopropyl
Người ta còn ghép lên dây C¡s một số nhóm phân cực đề tăng thêm độ phân cực của day Cig, làm cột có khả năng tach chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh (cột EPS — Expended Polar Selectivity).
Ngoài sườn silica, thời gian gần đây người ta có sử dụng đến nền nhựa polystyren (Polystyren Reversed Phase — PRP) cho phép phân tích trong môi trường pH từ 1 - 13. Cột này dé st dung trong méi trudng acid va bazo manh. [8]
1.84 Pha động trong sắc ký pha đảo
Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích ... ta lựa chọn pha động phù hợp đề cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của Peak
đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm
được dung môi hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động
của thiết bị.
Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:
- Hòa tan mẫu phân tích.
-Phù hợp với đầu dò.
-Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.
~-Có độ nhớt thấp đề tránh áp suất đội lại cao.
-Tinh khiét ding cho sic ky (HPLC grade).
Do đó, trong một pha tinh đã chon néu ta chon duoc pha động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất. Đối với hỗn hợp các chất cần phân tích.
Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau:
e Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có. Không được làm cho pha tĩnh bị biến đối hóa học.
e Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng (đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi
phù hợp đề không làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột Ví dụ: đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên column).
e Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là chúng là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gian phân tích mẫu.
e Phải có độ tinh khiết cao: dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích.
e Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
e Phải phù hợp với loại Detector: Ví dụ: UV - Vis thì dung môi không được hấp thụ quang (Ví dụ: acid acetic ở bước sáng thấp < 220 nm). Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang.
e Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt.
Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thê sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực té cho thay methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) va tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất. Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ đề giảm khả năng rửa giải.
Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive index), d6 nhot (viscocity), nhiét d6 sdi (boiling point), d6 phan cuc (polarity index), độ rua giai (eluent strength)...
Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các mũi sắc ký.
Bảng 1.5: Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng
Dung méi Độ phân | Độrừa | Độ nhớt Chỉ số Nhiệt độ
cực, e giải5 | ŒS"C),eP | khúcx | sôi,"
@sC) Tetrahydrofuran | 4/0 0,57 0,46 1,405 66
Methanol 5,1 0,95 0,54 1,326 65
Acetonitrile 58 0,65 0,34 1,341 82
Ethylenglycol 62 111 16,5 1,431 182
Nước 10,2 Lớn 0,89 1,333 100
Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N, hệ số dung lượng K”, độ chọn lọc œ . Khi sự thay đối thành phần pha động không đem lại kết quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta phải thay
đối bản chất pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đối œ. Đôi khi có thé
phải thay đồi cả pha tĩnh.
Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) hoặc tính bazơ (nhận proton) của dung môi.
Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước. Nước là một dung môi rất phân cực nên nó không tương tác với những nhóm alkyl không phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của SKPĐ. Hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất cột.
—* Methanol
—*— THF
~~ Acetonitril ——
100 2
Ls
(Py) !
Đệ nhớt (cP)
05
0 ‡ T T
0 20 30
% dung môi hữu cơ
Hình 1.13: Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25°C Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu hóa cho những hợp chất cần phân tích. Thông thường, người ta sử dụng hỗn hop dung môi MeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay THE/nước. Với một hỗn hợp chất phân tích phức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung môi hữu cơ với nước. Khi lựa chọn thì phải chọn các hỗn hợp MeOH, ACN và THE với nước có độ rửa giải tương đồng.
Thành phần pha động có thể có định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) đề có hiệu qua tach tốt hơn. [5]
1.85 Các bộ phận của hệ thống HPLC
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản như sau:
+
NE S A ` Detector
Hình 1.14: Sơ đồ hệ thống HPLC
Trong đó:
1: Bình chứa pha động. 2: Bộ phận khử khí 3: Bơm cao áp