7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều
khiển hệ thống. 8: In dữ liệu.
1.86. Các phương pháp định lượng [7]
Có 4 phương pháp định lượng
1.8.6.1. Phương pháp đường chuẩn
Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn, xây dựng đồ thị chuẩn sự phụ thuộc giữa nồng độ chất chuẩn và diện tích peak thu được, sau đó xứ lý thống kê.
Phương trình hồi qui của đường chuẩn theo diện tích peak có đạng:
y=mx+b Trong đó: x: nồng độ,
y: diện tích peak s m, b: hằng số.
Đo diện tích peak của chất nghiên cứu trong mẫu (trong cùng điều kiện thực nghiệm) như đường chuẩn, thay y vào phương trình trên ta tìm được CWGœ:
1.8.6.2. Phương pháp một mẫu chuẩn
Nếu gọi hx. hạy là chiều cao peak ta xác định Cyurcy theo phuong trình sau: Cy =Cy, "ơ h
ch
1.8.6.3. Phương pháp thêm Do yy=K.Cy
Ta thêm vào dung dịch nghiên cứu một lượng dung dich chuan Cy, ta được:
Vz.„ = K(Cy +C,„) C¿ =C, =
Vậy ta có: y=Œ€¿———”———
Œy,„T— yx)
1.8.6.4. Phương pháp thêm chuẩn
Thêm vào V ml dung dịch nghiên cứu lần lượt C¡, C¿...Cạ dung dịch chuẩn. Sau đó đo các diện tích peak thu được.
Ta có: Yy›W(x+e)3W(+e)-:*›Ÿ(x+€,)
Xây dựng đồ thị y=f(Cyc), xác định Cx theo đỗ thị đó y
Yx Duong y
= fcr)
a, ỘŨỘ Cre
1.87. Phương pháp tiến hành sắc ký
1.8.7.1 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc
May HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ dé bảo đảm máy họat
động tốt cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung
môi, tốc độ dòng, năng lượng đèn... đúng theo yêu cầu thông số của máy đo nhà sản xuất đặt ra.
Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ
hay khi có nghi ngờ về khả năng tách, và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký:
Ví dụ: Với sắc ký pha thuận NP-HPLC: rửa bằng MeOH, không rửa bằng nước
Với sắc ký pha đảo RP-HPLC: Khi chạy pha động có các loại muối thì
phải rửa nước trước cho sạch muối, sau đó rửa giải.
Tỷ lệ ACN hay MeOH: Nước (50: 50) cho sạch hết các chất còn đọng lại trong cột đồng thời đề bảo vệ cột không bị mốc khi đề lâu. Tuyệt đối tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đó đề cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng không thê dùng được. Lưu ý nếu rửa cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thê đáp ứng được các yêu cầu phân tích.
1.8.7.2. Chuẩn bị dung môi pha động
Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC.
Các hóa chất dùng phải là loại PA
Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu, để ôn định dung
môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu. Lọc dung môi qua màng lọc
0.2 — 0,45 um, Siêu âm đuôi bọt khí.
1.8.7.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC
Mẫu thử: Xử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận, qui trình theo nguyên tắc:
Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động đề hòa tan mẫu.
Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách lọc hay chiết...
Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,45 ym.
Nong độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột.
Có thể gây ra nghẽn cội.
Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phan.
1.8.7.4. Cach do HPLC
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản XuẤt, phần mềm sắc ký. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau:
Chạy máy với dung môi pha động đề đuôi hết bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột.
Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như:
+ Cấu hình máy.
+ Tỷ lệ các dung môi pha động.
+ Bước sóng. thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu
Chương 2