Rong biển là thực vật bậc thấp có cấu tạo tế bào đơn giản, nên quá trình xử lý và thủy phân rong biển không phức tạp như các nguồn sinh khối thực vật khác. Thông thường quá trình xử lý thủy phân rong biển theo các tác giả (Nahak, 2011; Goh, 2010) [34, 17].
Hình 1.1: Sơ đồ xử lý rong biển
Theo các tác giả rong biển tươi sau thu hoạch được loại tạp, loại muối sau đó rong được sấy khô mang lưu giữ chuẩn bị cho quá trình thủy phân.
Trước khi thủy phân rong được xử lý cơ học, xây nghiền nhằm làm nhỏ kích thước rong giúp cho quá trình thủy phân diễn ra dễ dàng.
Rong biển tươi Sấy khô
Thủy phân Xay, nghiền
Loại tạp
Dịch đường
Thủy phân là quá trình phân hủy các polysaccharid thành các oligo- monosaccharid. Quá trình này được tiến hành dưới xúc tác của nhiệt độ cao kết hợp với hóa học (axit, base), hoặc sinh học (enzym)
Kết quả của quá trình thủy phân tạo ra hỗn hợp dung dịch đường và bã rong.
Các phương pháp thủy phân rong biển Cơ chế thủy phân bằng axit H2SO4
Dưới xúc tác của axit các polyme saccharid của rong sẽ bị cắt nhỏ thành các oligo hoặc mono saccharid.
Axit H2SO4 là axit hoạt động mạnh, có ion H+ và nhóm SO42-, hai nhóm này tác động trực tiếp đến polyme saccharid tại các liên kết mắc xính nối các mono sacchadid tạo ra các oligo hoặc mono saccharid.
Quá trình thủy phân rong của axit H2SO4 tạo ra hỗn hợp dung dịch đường cần cho quá trình lên men ethanol.
Cơ chế thủy phân bằng Enzym
Rong biển được tiền xử lý, trước khi được thủy phân bằng enzym. Tiền xử lý rong nhằm đảm bảo khả năng tiếp cận của enzym đến các liên kết của các polysaccharid. Chất được sử dụng tiền xử lý rong là dung dịch axit loãng.
Sau quá trình tiền xử lý, rong được thủy phân bởi nhóm enzym Hydrolase là phức hệ enzym cellulase được thu nhận từ giống vi sinh vật. Nhóm phức hệ enzym này tác động đặc hiệu đến các polysaccharid bao gồm (arabinose, celluose, B- glucan, hemicellulose, xylan) các polysaccharid này sẽ bị enzym cắt tại các vị trí đặt hiệu tạo ra các sản phẩm olygosaccharid và các monosaccharid (glucose, arabinose, xylose, manose). Đây là các loại đường đơn cần cho quá trình lên men ethanol của vi sinh vật.
Hiện nay trên thế giới nhiều quốc gia đang tập trung nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu rong biển, nhưng nguồn nguyên liệu này của mỗi nước là khác nhau do phụ thuộc vào đặc tính phân bố thành phần loài và tình hình kỹ thuật của mỗi quốc gia.
Trung Quốc nghiên cứu sản xuất cồn sinh học từ loài Gracilaria salicornia. Sinh khối của loài Gracilaria salicornia được thủy phân trong điều kiện H2SO4 2%, trong 30 phút ở nhiệt độ 120o C, hiệu suất của quá trình thủy phân 4.3 g glucose/kg rong tươi. Ngoài ra sinh khối Gracilaria salicornia còn được thủy phân bằng enzym và có kết quả hiệu suất 13.8 g glucose/kg rong tươi cao hơn nhiều so với thủy phân bằng axit loãng. Sau khi thủy phân dung dịch đường được lên men với Escherichia coli KO11, đây là loại vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng lên men cồn, cho hiệu suất lên men 79.1g ethanol/1kg rong khô (Wang, 2011) [38].
Trung Quốc còn nghiên cứu sản xuất cồn từ bả thải rong Laminaria japonica sau khi sản xuất aginate. Bả thải được thủy phân bằng axit sunfuric và enzym cellulase và cellobiase sau đó lên men bằng chủng vi sinh vật Saccharose cerevisiae. Điều kiện thủy phân và lên men, bằng axit với nồng độ 0; 0,1; 0,2; 0.5 and 1,0%(w/v) trong thời gian 30 phút, 1 giờ, 1.5 giờ và thủy phân bằng enzym tại điều kiện (500 C, pH 4.8, 48 h) và lên men ở 300C trong 36 giờ. Kết quả thu được sau thủy phân 277,5 mg/g và hiệu suất lên men là 80% (Ge, 2010) [16].
Nauy nghiên cứu sản xuất cồn từ rong Nâu, loài được sử dụng sản xuất Laminaria hyperborea and Ascophyllum nodosum, hai giống vi sinh vật sử dụng sản xuất ethanol Zymobacter palmae, Pichia angophorae vì chúng có khả lên men từ đường mannitol, laminaran. Hiệu xuất lên men 0.43g ethanol/1g cơ chất (Horn,2000) [18].
Hàn Quốc là đất nước có nền công nghệ sinh học phát triển. Vì vậy Hàn Quốc đã ứng dụng nhiều kỹ thuật mới và hiện đại vào sản xuất ethanol. Trong đó kỹ thuật xử lý mẫu bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma đã mang lại hiệu quả tích cực cho công nghệ sản xuất cồn. Thành phần loài được sử dụng trong nghiên cứu này là Undaria sp., đây là loài có sinh khối vô cùng lớn được nuôi trồng và khai thác tự nhiên tại Hàn Quốc. Mẫu rong biển sau khi thu hoạch ngoài tự nhiên sẽ được xử lý với tia Gamma với liều chiếu 0, 10, 50, 100, 200 và 500 kGy, sau đó thủy phân trong axit sunfuric 1%,
Sau quá trình thủy phân hổn hợp rong sẽ được trung hòa với CaCO3 rồi lên men với nấm men. Hàm lượng ethanol thu được vào khoảng 0.017 g/L - 0.048 g/L (Minchul Yoon, 2011) [30].
Với sự phát triển của kỹ thuật gene, Hàn Quốc đã thành công trong công nghệ tái tổ hợp. Một nhóm nghiên cứu thuộc trung tâm hóa học và kỹ thuật sinh học phân tử đã tái tổ hợp gene mã hóa tổng hợp ethanol từ nhiều loại đường glucose, mannose, galactose, và mannitol vào chủng vi sinh vật Ecoli để tạo ra chủng giống có tên khoa học Ecoli K11. Chủng vi sinh vật này đã được tiến hành lên men thử nghiệm với nguồn cơ chất là hổn hợp dung dịch đường được thủy phân bằng enzym từ nguồn sinh khối của các loại rong Ulva lactuca, Gelidium amansii, Laminaria japonica, and Sargassum fulvellum. Trong đó hiệu suất lên men sinh ethanol với nguồn cơ chất từ rong Laminaria japonica là cho hiệu suất cao nhất., hàm lượng ethanol dược xác định 0,4g ethanol/g cơ chất carbohydrate (Nag-Jong Kim, 2011) [33].
Ngoài ra Hàn Quốc còn nghiên cứu sản xuất cồn từ rong nâu loài được sử dụng sản xuất Laminaria japonica, vì trong rong nâu chứa nhiều loại đường khác nhau, nhiều nhất là alginate, manitol, laminaran. Các loại đường này sau khi chiết ra từ rong nâu được lên mem với bốn chủng vi sinh vật gồm: Enterobacter sp, Panotoea agglomerans, Eruinia tasmaniensis, Candida lasitancae. Trong đó chủng Candida lasitancae lên mem với đường manitol cho hiệu suất cồn cao nhất 2,59g/L ethanol sau 96 giờ lên men. Ngoài ra alginate sau khi được thủy phân bằng enzym alginate lyase cũng được lên mem với chủng Eruinia tasmaniensis, Candida lasitancae đạt hiệu suất 2,0g/L ethanol (Lee, 2011) [26].
Tại trường đại học Aberystwyth của Anh một nhóm nghiên cứu của viện công nghệ sinh học và môi trường đã nghiên cứu thành công sản xuất cồn từ loài rong biển Laminaria digitata đây là loài rong có sinh khối lớn và phổ biến ở các quốc gia châu âu, kích thước rong có thể đạt 15-20 mét nên được xem là đối tượng thích hợp cho các nghiên cứu sản xuất cồn. Tại phòng thí nghiệm của đại học này, nhóm nghiên cứu đã phân lập giống Trichoderma laminarinase sau đó lên men thu
sản phẩm enzym ngoại bào. Lượng enzym này được dùng thủy phân rong Laminaria digitata. Dung dịch đường sau thủy phân được lên men với vi khuẩn Pichia angophorae. Sản phẩm sau lên men thu được 219 ml ethanol/kg rong khô.
Đây là công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học đầy triển vọng tại châu âu (Adams J.M.M, 2011) [11].
Nhật Bản cũng sử dụng rong lục để nghiên cứu sản xuất cồn. Mẫu rong được thu rãi rát tại Việt Nam, Thái Lan, Nhật bao gồm các chi Enteromorpha, Chaetomorpha, Cladophora, Caulerpa. Sau đó xác định hàm lượng carbohydrate tổng số, và hàm lượng glucose của từng loài. Các chi Enteromorpha, Chaetomorpha, Cladophora có hàm lượng glucose cao 180-335mg/g. rong được sử lý ở nhiệt độ 120oC sau đó thủy phân với phức hệ enzym Acremonium cellulase.
Sau quá trình thủy phân rong được lên men với Saccharomyces cerevisiae IR-2.(Isa A, 2009) [19]
Đầu năm 2011 nhóm nghiên cứu của Mitsunori Yanagisawa của viện khoa học kỹ thuật Tokyo Nhật Bản đã đưa ra kỹ thuật sản xuất cồn từ rong (Ulva pertusa Kjellman), (Alaria crassifolia Kjellman), and agar weed (Gelidium elegans Kuetzing). Quá trình thủy phân các polysaccharid của các loại rong này được thực hiện sau khi đã tiền xử lý với nhiệt 121oC trong 20 phút, sau đó rong được thủy phân bởi các nhóm enzym thủy phân cellulose (Avicel, Merck, Germany), thủy phân tinh bột (Starch, Sol-uble, Wako Pure Chemical Industry Ltd., Japan), and thủy phân B1,3-glucan (Curdlan, Wako Pure Chemical Industry Ltd., Japan). Sau đó xác định hàm lượng carbohydrate tổng số, và hàm lượng glucose của từng loài bởi hệ thống HPLC. Sau quá trình thủy phân rong được lên men với Saccharomyces cerevisiae IAM 4178. Sau quá trình lên men thu được 30.0 - 34.4 g/L ethanol (Mitsunori Yanagisawa, 2011) [31].
Trong những năm gần đây Ấn Độ đặc biệt chú trọng đến việc phát triển nhiên liệu sinh học từ nguồn sinh khối thực vật nhằm giải quyết vấn đề nhiên liệu cho quốc gia. Các nguồn sinh khối đã được nhà nước Ấn Độ chú trọng phát triển bao gồm cây Jatropha, các cây họ dầu cọ, sắn, mía đường và cả rong biển. Tuy
nguồn sinh khối rong biển ứng dụng trong sản xuất cồn vừa mới được nghiên cứu ứng dụng nhưng cũng đã thu được một số kết quả bước đầu. Một nhóm nghiên cứu thuộc phòng công nghệ sinh học thuộc trường cao đẳng Vivekanandha, đã nghiên cứu sản xuất cồn từ rong Eucheuma sp. và Hypnea sp..Mẫu rong được thủy phân bởi axit loãng 1% tại nhiệt độ 100oC trong 3 giờ, dung dịch đường sau thủy phân sẽ được trung hòa bằng BaCO3 sau đó lên men với nấm men. Kết quả sau lên men cho thấy, hiệu suất lên men ethanol của rong Eucheuma sp. là 0,51 g ethanol/g galactose cao hơn Hypnea sp. 0,20 g ethanol/g galactose (Karunakaran S., 2011) [22]
Ngoài hai loài rong đỏ nêu trên, Ấn Độ còn nghiên cứu sản xuất cồn từ rong Kappahycus alvarezii. Đây là loài rong đỏ được nuôi trồng phổ biến có sinh khối lớn, có hàm lượng carbohydrate cao với thành phần chính là polysaccharid carrageenan. Rong Kappahycus alvarezii sau khi được thủy phân với axit loãng được lên men với mấm men Saccharomyses cerevisiae. (Kalpana, 2011) [21] . Rong Lục cũng được Ấn Độ sử dụng lên men ethanol, loài được dùng làm nguyên liệu là Enteromorpha spp.. Đây là loài rong lục có hàm lượng carbohydrate cao chiếm 70-72% khối lượng khô. Rong được xử lý thủy phân với axit H2SO4 loãng sau đó lên men với chủng vi sinh vật Saccharomyses cerevisiae. (Nahak, 2011) [34]
Malaysia sử dụng rong đỏ Echeuma spp. lên mem ethanol. Rong Echeuma spp. là loài rong có kích thước lớn, phân bố rộng trong vùng biển Malaysia, nuôi trồng đạt năng suất cao, hàm lượng carbohydrate cao 0,7kg/kg. Rong Echeuma spp.
được lên men với chủng Saccharomyces cerevisiae. (Goh, 2010) [17]
Từ các kết quả nghiên cứu của các tác giả có thể suy ra kỹ thuật sản xuất cồn từ rong biển gồm các bước sau:
Hình 1.2: Sơ đồ sản xuất cồn từ rong biển Rong nguyên
liệu
Rửa mặn và lọc tạp
Cắt/
nghiền nhỏ
Thủy phân (axit/ enzym)
Dịch đường Xử lý dịch
đường
Thu hồi Ethanol
thô
Chưng cất
Thu hồi Ethanol tinh sạch Chủng
giống vi sinh vật
Lên men