Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Chuẩn bị mẫu: Mẫu rong sau khi thu thập từ các chuyến khảo sát về phòng thí nghiệm, rong được rửa sạch cát và phụ sinh, phơi khô ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong bóng râm. Mẫu được xác định tên chi, loài, nơi thu và được lưu giữ trong túi nilon chuẩn bị cho phân tích các thành phần hóa học.
Xác định Độ ẩm: Cân khoảng 1g rong cho vào cốc, sau đó đem sấy ở nhiệt độ 1050C trong thời gian 4-5 giờ đến khi nguyên liệu khô giòn. Mẫu được sấy trong tủ sấy có quạt (GALLENKAMP, Germany) (Nguyễn Văn Mùi,2007) [6]
2.2.2. Xác định tro (khoáng)
Cân 1g rong cho vào chén nung. Sau đó đem nung ở nhiệt độ 6500C Trong thời gian 7-8 giờ đến khi nào thấy Tro trắng thì ngừng nung. Mẫu được nung trong lò nung điều chỉnh được nhiệt độ (GALLENKAMP, 15000C, Germany (Nguyễn Văn Mùi, 2007)[6]
2.2.3. Xác định hàm lượng nitơ và protein
Định lượng nitơ tổng được thực hiện trên bộ chưng cất Kjeldahl. Protein = nitơ x 6.25 (Nguyễn Văn Mùi,2007) [6]
2.2.4. Xác định hàm lượng lipid
Dùng dung môi hữu cơ chiết Lipid ra khỏi rong. Dung môi được sử dụng để chiết Lipid là cloroform và metylic với tỷ lệ 2:1 (2CH3Cl : CH3OH). Quá trình chiết Lipid thực hiện Trong 5 giờ trên máy soxhlet (Nguyễn Văn Mùi,2007) [6]
Carbohydrate tổng số: Carbohydrate = 100% - (%Độ ẩm+ %Proein+ %Lipid +% Tro) (Márcia, 2004) [29]
2.2.5. Xác định hàm lượng cellulose (Márcia, 2004) [29]
Tiến hành: cân 1g mẫu rong cho thủy phân trong 20ml HCl 5% trong 30 phút. Sau đó lọc rửa bằng nước nóng. Tiếp tục thủy phân bằng 20ml NaOH 5%
trong vòng 30 phút. Rửa sạch suốt, dùng methyl đỏ thử lại. Rửa tiếp bằng 20ml bằng rượu etylic và 20ml Este ethyl. Sấy khô mẫu ở nhiệt độ 100°C trong 3-4h và cân xác định cellulose. Chú ý khi trước khi cân cần xác định chính xác khối lượng giấy lọc để định lượng cellulose được chính xác.
2.2.6. Xác định hàm lượng carbohydrate tổng số của sản phẩm sau thủy phân Xác định carbonhydrate tổng số trong rong biển bằng phương pháp Dubois: (M.
Shanmugam, 2001) [27]
Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử phenol sunfuaric. Cường độ màu của hổn hợp phản ứng tỷ lệ thuận
với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử phenol sunfuaric sẽ tính được lượng đường khử của mẫu phân tích.
Dụng cụ và hóa chất:
- Dung dịch HCl đặc (d=1,19) - Dung dịch phenol 95%
- Dung dịch H2SO4 đậm đặc.
- Dung dịch glucose hoặc galactose tinh khiết.
- Ống nessler 50ml có nắp đậy, cốc thủy tinh đựng ống nessler
Tiến hành:
Chuẩn bị mẫu: quá trình này nhằm tạo ra dung dịch đường khử dùng để so màu.
- Đối với mẫu rong được thủy phân bằng phương pháp axit, sau thủy phân dịch đường được lọc sạch tạp và trung hòa về pH 5,5-6,5 chuẩn bị cho phân tích.
- Đối với mẫu rong được thủy phân bằng phương pháp enzym, sau thủy phân dịch đường được lọc sạch tạp và gia nhiệt để xử lý enzym chuẩn bị cho phân tích
Chuẩn bị dung dịch đường chuẩn:
- Dùng dung dịch Galactose hoặc Glucose pha các nồng độ: 20; 40; 60; 80;
100; 120àg/ml.
- Xác định lượng đường
Lấy 0,5 ml mẫu đã pha loảng + 0,5 ml dung dịch phenol 95% + 2,5 ml H2SO4 đậm đặc cho vào ống nesler khác.
Lắc đều hỗn dịch trong10 phút, sau đó để yên 30 phút. Rồi đem đo ở bước sóng 490nm. Ghi lại chỉ số OD của các mẫu phân tích.
Tiến hành tương tự với mẫu trắng (nước cất) và mẫu chuẩn (dung dịch đường chuẩn).
Tính kết quả:
- Lập biểu đồ đường chuẩn từ các kết quả đo được của mẫu chuẩn.
- Rút ra phương trình tuyến tính của mẫu chuẩn.
- Thế chỉ số OD của mẫu phân tích vào phương trình tuyến tính từ đó rút ra hàm lượng carbonhyrate tổng số của mổi mẫu rong.
2.2.7. Xác định hàm lượng cồn sau lên men
Hàm lượng ethanol sau chưng cất được xác định bằng tỷ trọng kế.
Tiến hành: Sau quá trình lên men dịch lên men có hàm lượng cồn tương đối thấp, nên khó có thể xác định hàm lượng cồn bằng cồn kế. Lấy 200ml dịch lên men mang chưng cất thu 50ml dịch bay hơi đầu tiên. Rót dung dịch rượu này vào ống đông thể tích 50ml, đường kính ống đông to hơn đường kính chỗ to nhất của cồn kế.
Thả cồn kế vào ống đông và đọc độ cồn ghi trên cồn kế. Hàm lượng cồn của dịch lên men được tính dựa trên giá trị hiển thị trên cồn kế chia cho 4.
2.2.8. Xác định hiệu suất sau thủy phân
Hiệu suất sau thủy phân được xác định theo công thức:
Htp: Hiệu suất thủy phân.
MC: Khối lượng carbohydrate sau thủy phân.
MNL: Khối lượng nguyên liệu rong biển khô trước thủy phân.
2.2.9. Xác định hiệu suất lên men
Hiệu suất sau lên men được xác định theo công thức:
Hlm : Hiệu suất lên men.
Mrb : Khối lượng rong biển lên men.
Vtt : Thể tích cồn tạo thành trong dung dịch.
Vtđ : Thể tích cồn tuyệt đối.
Hlm = M rb * Vtđ Vtt
Htp = M C * 100 M NL