1.3. Thu nhận Pectic oligosaccharide (POS)
1.3.2. Cô đặc, tách, tinh sạch POS
Các nhà khoa học mô tả rằng các monome monogalacturonic không có tác dụng ngăn chặn sự bám dính của các tác nhân gây bệnh lên các tế bào, đặc biệt là các tế bào biểu mô đường tiêu hóa và đường sinh dục, trong khi tỷ lệ ngăn chặn lên đến 91.7%
hoặc 84.6% tương ứng với digalacturonic và trimonogalacturonic, và hiệu quả ngăn chặn mong muốn giảm cùng với trọng lượng phân tử ngày càng tăng của các galacturonic [14]. Như vậy, việc loại bỏ các thành phần không mong muốn như đường monosaccharide, muối đệm là cần thiết để cải thiện hoạt tính prebiotic của chế phẩm POS. Hơn nữa, việc tinh sạch giúp mở rộng khả năng ứng dụng của POS tinh khiết trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Vì vậy, tùy theo mục đích sử dụng mà POS được thu hồi từ dịch thủy phân dưới các dạng chế phẩm khác nhau nhờ một số phương pháp khác nhau.
Quy trình thu nhận của đề tài nhằm thu được chế phẩm POS tinh sạch cho ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng. Các phương pháp chính được sử dụng trong quy trình thu nhận này bao gồm: phương pháp lọc nano, phương pháp kết tủa và phương pháp sắc ký. POS sau khi tách và tinh sạch được tạo chế phẩm dạng bột bằng phương pháp sấy phun để bảo quản lâu dài và thương mại hóa.
Lọc nano
Các phương pháp lọc màng nói chung cho phép đồng thời thực hiện các quá trình tinh sạch và cô đặc dung dịch. Trong đó lọc nano là một phương pháp có nhiều tiềm năng trong tinh sạch và cô đặc POS ở quy mô công nghiệp. Màng kích thước nano có giới hạn khối lượng phân tử (MWCO) trong khoảng 200 – 1000 Da. Đường kính lỗ của hầu hết các màng kích thước nano trong khoảng 0.6 – 2.0 nm, trung bình 0.8 – 0.9
nm. Đường kính của monosaccharides là 0.6 – 0.8 nm. Bên cạnh đó, màng nano có thể tách riêng ion đơn (monovalent ions) ra khỏi hỗn hợp chất đa ion (multivalent ions). Vì vậy, màng kích thước nano có thể phân riêng monogalacturonic ra khỏi digalacturonic và oligogalacturonic.
Có nhiều báo cáo về việc sử dụng phương pháp lọc nano trong tinh sạch các oligosaccharide. Pruksasri và cộng sự sử dụng một màng NF (NP030) để tinh sạch GOS cho độ tinh khiết của sản phẩm đạt 85% (dựa trên hàm lượng monosaccharide) và hiệu suất thu hồi oligosaccharide đạt 82% [67].
Feng và cộng sự đánh giá ảnh hưởng của áp suất vận hành (0.2-0.8 MPa) và nồng độ thấp (5-60 g/l) trong tách GOS sử dụng màng lọc nano cellulose acetate. Một màng NF-3 với giới hạn trọng lượng phân tử 0.8-1 kDa đã được chọn để phân tách một chế phẩm GOS thương mại có hàm lượng oligosaccharide thấp bằng phương pháp lọc pha loãng (diafiltration) ở 50˚C và áp suất 6 bar. Theo đó, 90.5% monosaccharide và 52.5% lactose trong hỗn hợp đã được loại bỏ, năng suất thu hồi oligosaccharides đạt 70.0% [24].
Bốn loại màng NP010, NP030 (Microdyn Nadir, Germany), Desal-5 DL và Desal-5 HL đã được Kuhn sử dụng trong thí nghiệm để lựa chọn loại màng thích hợp trong tinh sạch fructooligosaccharide (FOS) từ hỗn hợp với glucose, fructose và sucrose [42]. Kết quả cho thấy màng NP030 cho khả năng giữ các loại đường khác nhau khác biệt nhất: FOS (0.66), glucose (0.18), fructose (0.15), và sucrose (0.24). Các kết quả đã chứng minh tiềm năng của phương pháp lọc pha loãng (diafiltration) sử dụng màng NP030 trong việc tinh sạch FOS từ hỗn hợp chứa mono và disaccharide.
Phương pháp lọc nano cũng đã được nghiên cứu trên quy mô pilot được thực hiện bởi Zhang và cộng sự để nghiên cứu khả năng giữ disaccharide (lactulose và lactose) và chất xúc tác (NaCl và H3BO3) trong chế phẩm xi-rô lactulose. Kết quả thu được cho thấy khả năng được giữ lại trên màng khác biệt lớn và giảm dần theo thứ tự:
disaccharide (94.7–98.5%) > NaCl (9.0–20.0%) > H3BO3 (−19.9–0.0%). Ngoài ra, một mô hình đã được sử dụng để mô phỏng độ tinh khiết và hiệu suất thu hồi disaccharide trong quá trình diafiltration liên tục. Theo mô phỏng, 25 bar đã được chọn làm áp suất vận hành tối ưu cho quá trình diafiltration liên tục. Kết quả thử nghiệm cho thấy rằng hơn 96.5% NaCl và H3BO3 đã được loại bỏ khỏi xi-rô lactulose với chỉ một tỉ lệ thất thoát disaccharide nhỏ (11.0%) và hệ số pha loãng là 5.0 cho màng sử dụng [74].
K. Manderson và cộng sự tiến hành lọc dịch POS (sản xuất từ pectin vỏ cam bởi acid HNO3) bằng màng lọc nano DS-5-DL để làm giảm khoảng 5 lần hàm lượng muối và loại monosaccharide. Sau đó POS sau lọc được sử dụng để nghiên cứu hoạt tính prebiotic trên các vi khuẩn đường ruột [53].
Lọc nano có nhiều lợi thế hơn so với các kỹ thuật sắc ký khác như tiết kiệm năng lượng, chi phí vận hành và bảo dưỡng thấp, đơn giản trong hoạt động và mở rộng quy mô.
Đối với quá trình cô đặc bằng lọc nano, các yếu tố ảnh hưởng chính đến hiệu suất thu hồi bao gồm áp suất, nhiệt độ và nồng độ dịch ban đầu. Goulas và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của 3 yếu tố này trong một thí nghiệm tinh sạch chế phẩm oligosaccharide. Kết quả cho thấy khả năng loại fructose tăng từ 0.1 đến 0.42 khi tăng áp suất lọc bằng cách tăng vận tốc dòng dung môi, tuy nhiên khả năng tách loại glucose giảm từ 0.58 xuống 0.43 nếu nồng độ các chất này trong dung dịch cao hoặc khi tăng nhiệt độ lọc thì khả năng loại fructose giảm từ 0.72 xuống 0.48. Việc lựa chọn nhiệt độ lọc cũng phải dựa vào thông số kỹ thuật của từng loại màng [29].
Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Việc bổ sung các dung môi hữu cơ vào các dung dịch làm giảm khả năng hòa tan của một số thành phần trong dung dịch do làm giảm hằng số điện môi của môi trường.
Các dung môi hữu cơ thường dùng bao gồm ethanol, acetone và iso propanol. Trong số đó, ethanol là dung môi thông dụng nhất và thường được sử dụng để kết tủa POS.
C. Onumpai và cộng sự đã sử dụng ethanol với nồng độ cuối 64% kết tủa POS ở 4oC trong 18 giờ để nghiên cứu khả năng sử dụng POS của vi khuẩn đường ruột [13].
Dịch POS thu từ bã ép quả oliu được A. Lama-munoz và cộng sự kết tủa phân đoạn bằng ethanol 20%, 40%, 60%, 80% và 90% [7]. Kết quả cho thấy kết tủa bằng ethanol trên 80% thu được POS có kích thước 0.3 - 1 kDa.
Dịch sau thủy phân bằng phương pháp thủy phân tích hợp màng lọc đã loại bỏ phần lớn cơ chất dư và enzyme, tuy nhiên vẫn còn chứa các thành phần không mong muốn như monosaccharide và muối đệm trinatri citrate. Do đặc tính của muối trinatri citrate không tan trong ethanol nên phương pháp kết tủa bằng ethanol cũng được kì vọng để loại bỏ muối.
Swennen và cộng sự sử dụng phương pháp kết tủa phân đoạn ethanol để nghiên cứu tách arabinoxylooligosaccharides (AXOS) từ dịch thủy phân arabinoxylan (AX).
Các phân đoạn kết tủa bao gồm: F0-60% , F60-90% và F>90% (trên 90%) được để qua đêm ở 4˚C, thu hồi kết tủa bằng cách ly tâm 10 000 vòng/phút trong 20 phút ở 4˚C, sau đó hòa tan kết tủa trong nước khử ion và đông khô. Các mẫu được được phân tích bằng GC, HPSEC và HPAEC- PAD. Kết quả phân tích cho thấy phân đoạn F0-60% chứa thành phần AX với DP trung bình là 53. Phân đoạn F60-90% chứa AXOS phân tử trung bình với DP trung bình là 23. Phân đoạn F>90% chứa AXOS phân tử trung bình với DP trung bình là 5 và khối lượng phân tử trong khoảng 300-2000 Da, phân tích HPAEC cho thấy phân đoạn này chứa arabinose, xylose, xylobiose và xylooligosaccharides (XOS) với DP 3-6 [68].
Sen và cộng sự đã sử dụng nồng độ ethanol cao (>70% v/v) để kết tủa chọn lọc galacto oligosaccharide (GOS) từ hỗn hợp GOS, lactose, glucose và galactose [20].
Hàm lượng GOS đã được tăng lên 2.3 lần trong kết tủa ở nồng độ ethanol 90% v/v, trong khi hàm lượng GOS tăng 2.4 lần với phương pháp hấp thụ bởi than hoạt tính, 1.3 lần khi lên men chọn lọc monosaccharide bởi nấm men hay 1 lần với sắc ký loại trừ
theo kích thước, tuy nhiên kết tủa là phương pháp đơn giản và thuận tiện hơn cả.
Phương pháp kết tủa có thể sử dụng thay thế hoặc kết hợp với các phương pháp này.
Hơn nữa, thực hiện 2 lần kết tủa liên tiếp ở nồng độ ethanol 90%, hàm lượng monosaccharide giảm từ 48% (w/w) tổng lượng đường xuống còn 4% (w/w), như vậy khả năng loại monosaccharide của phương pháp này là rất cao.
Trong thí nghiệm kết tủa của mình, Sen và cộng sự cũng đã nghiên cứu những ảnh hưởng của nồng độ ethanol sử dụng để kết tủa, nồng độ saccharide trong dung dịch ban đầu và nhiệt độ kết tủa [20]. Theo đó, tại nồng độ 70% ethanol, kết tủa tạo ra là chưa rõ ràng, kết tủa tạo ra thấy rõ bằng mắt ở nồng độ 85% tại tất cả các mức nhiệt độ (10; 25 và 40˚C) và hàm lượng saccharide khảo sát (60 và 81 g/l) và tại 90% ethanol thì kết tủa tạo ra tại tất cả các phương án thí nghiệm. Báo cáo cũng chỉ ra rằng việc tăng nồng độ saccharide tổng trong dung dịch ban đầu làm giảm khả năng hòa tan của từng loại saccharide riêng biệt, do đó lượng saccharide kết tủa được nhiều hơn. Nhiệt độ được biết là ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các loại saccharide, nhiệt độ càng thấp thì khả năng hòa tan càng giảm dẫn đến hiệu suất kết tủa càng cao. Tuy nhiên ở nồng độ ethanol cao, ảnh hưởng của sự biến đổi về nhiệt độ đến quá trình tinh sạch POS là không đáng kể.
Như vậy, phương pháp kết tủa có thể được sử dụng như là một bước để làm giàu và cô đặc POS trước khi sắc ký. Ngược lại, lọc nano có thể được sử dụng để cô đặc các dung dịch đường trước một bước kết tủa cuối cùng. Và vì vậy, phương pháp này có tiềm năng lớn để áp dụng trong công nghiệp vì sự đơn giản trong vận hành và hiệu quả tinh sạch cao.