CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp phân tích
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. ác định hoạt tính sinh học của PO
Nguyên tắc: Hoạt tính prebiotic của một chất phản ánh khả năng hỗ trợ sự phát triển của một vi sinh vật nhất định so với các vi sinh vật khác và so với khả năng phát triển trên môi trường không có hoạt tính prebiotic như glucose. Do đó, cacbohydrate có hoạt tính prebiotic nếu nó được chuyển hóa tương tự như glucose bởi các chủng probiotic và được chọn lọc chuyển hóa bởi các chủng probiotic thay vì bởi các vi sinh vật đường ruột khác [37].
Tiến hành: Cấy 1% (v/v - 3x105 cfu/ml) canh trường chứa các chủng thử nghiệm (nuôi riêng rẽ hoặc kết hợp) vào các ống nghiệm chứa môi trường MR bổ sung 1%
glucose (w/v) hoặc 1% POS (w/v). Nuôi ở 37oC. Cấy trang các mẫu canh trường trên ở thời điểm ban đầu và sau 24 giờ vào môi trường thạch đĩa để đếm số lượng khuẩn lạc.
2.2.1.2. ác định vi sinh vật tổng số hiếu khí
TCVN 9977 : 2013. Thực phẩm - Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp sử dụng đĩa đếm petrifilm.
2.2.1.3. ác định Lactobacillus
TCVN 5522 : 1991. Sản phẩm thực phẩm - Phương pháp xác định số vi khuẩn chủng Lactobacillus.
2.2.1.4. ác định Escherichia coli
TCVN 6505 : 2005. Sữa và sản phẩm sữa - Định lượng Escherichia coli giả định 2.2.1.5. ác định Staphylococcus aureus
TCVN 4830 : 2005. Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Staphylococcus trên đĩa thạch.
2.2.1.6. Thử nghiệm độc tính cấp của pectic oligosaccharide
Thử nghiệm được tiến hành tại Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương trên 50 con chuột nhắt trắng giống Swiss với cân nặng 18 – 22 g. Tất cả chuột thử nghiệm được để ổn định 3 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm và theo dõi cân nặng trong quá trình thử nghiệm.
Tiến hành thử nghiệm sơ bộ trên 10 con chuột và chính thức trên 40 chuột, chia thành 4 nhóm gồm 1 nhóm đối chứng dùng nước đun sôi để nguội và 3 nhóm thử nghiệm theo mức liều đã dự tính. Các nhóm thử nghiệm được dùng các hỗn dịch thử ở các mức liều và số lần đưa mẫu thử như bảng 2.4.
Lịch theo dõi: Theo dõi biểu hiện của chuột sau khi uống, trong vòng 2 giờ, 24 giờ đầu và theo dõi hoạt động của động vật thí nghiệm trong thời gian 7 ngày sau khi uống.
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp Nhóm chuột Liều dùng (ml hỗn dịch
thử/20g chuột)
Liều dùng (ml mẫu thử/kg chuột)
Số chuột thí nghiệm
Đối chứng 0.4 ml nước x 3 lần --- 10
Mức liều 1 0.4 ml hỗn dịch thử x 1 lần 20 10
Mức liều 2 0.4 ml hỗn dịch thử x 2 lần 40 10
Mức liều 3 0.4 ml hỗn dịch thử x 3 lần 60 10
2.2.2. Phương pháp hoá lý - hoá sinh
2.2.2.1. Định lượng đường khử theo monogalacturonic bằng phương pháp DN
Đường khử được xác định theo phương pháp của Miller. Bổ sung 1 ml thuốc thử DNS vào 0.2 ml mẫu đường, đun sôi trong 10 phút, làm lạnh nhanh, đo độ hấp thụ ở bước sóng 575 nm, dựa vào đồ thị đường chuẩn Monogalacturonic suy ra hàm lượng monogalacturonic có trong mẫu [40, 41].
Kết quả xây dựng đường chuẩn monogalacturonic được biểu diễn trong đồ thị dưới đây:
Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn monogalacturonic 2.2.2.2. ác định thành phần PO bằng sắc k bản mỏng TLC
Thành phần các oligosaccharide của dịch thủy phân được phân tách bằng kỹ thuật sắc kí bản mỏng với hệ dung môi butanol: acid acetic: nước = 9: 4: 7 (v/v/v) và hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol, sấy ở 120oC trong 5 phút [38].
2.2.2.3. ác định hàm lượng pectic oligosaccharide theo kit D-monogalacturonic (Megazyme)
Cân 100 mg mẫu vào ống thủy tinh có nắp đậy. Thêm 5 mL H2SO4 2M vào mỗi ống và đậy kín nắp rồi ủ ở 100°C trong 6 giờ. Lắc đều ống trong quá trình ủ. Tiếp theo,
làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm 7 mL NaOH 2M. Chuyển dung dịch trong ống sang bình định mức 100 mL và điều chỉnh đến vạch bằng nước cất. Lắc đều dịch và lọc qua giấy lọc Whatman No.1. Lượng đường khử trong dịch lọc được xác định bằng kit D- monogalacturonic (Megazyme) theo quy trình chuẩn kèm theo của nhà sản xuất và được phân tích trên máy đo Nanodrop 2000C (Thermo, Mỹ).
Hàm lượng POS trong mẫu được xác định theo công thức sau:
POS = (a – b) x 0.9 Trong đó
a: hàm lượng monogalacturonic của dịch sau khi thủy phân bằng acid b: hàm lượng monogalacturonic của dịch trước khi thủy phân
0.9: hệ số chuyển từ monogalacturonic sang oligosaccharide.
2.2.2.4. ác định hàm lượng muối trinatri citrate
Hàm lượng muối trinatri citrate được xác định theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm - Chất điều chỉnh độ acid (phụ lục 12), QCVN 4-11:
2010/BYT.