Để nuôi cấy tế bào và giúp cho sự nhân lên của virus sau khi gây nhiễm trên tế bào trong quá trình sản xuất vắc xin sởi thì môi trường nuôi cấy là một yếu tố quan trọng mang tính chất quyết định, ảnh hưởng tới sự phát triển của tế bào và sự nhân lên của virus. Vì thế cần đặc biệt lưu ý khi pha chế môi trường nuôi cấy, phải
đảm bảo đầy đủ về thành phần và chính xác về hàm lƣợng các chất dinh dƣỡng (đa lượng, vi lượng, nguồn Carbon), chất điều hòa sinh trưởng… Một yếu tố rất quan trọng đó là pH của môi trường nuôi cấy, pH không chỉ ảnh hưởng đến khả năng hòa tan các chất khoáng mà còn ảnh hưởng đến hoạt tính của các chất điều hòa sinh trưởng, các chất điều hòa sinh trưởng sẽ bị mất hoạt tính nếu pH quá acid hoặc quá kiềm [33].
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào được thiết lập gần giống như thành phần dịch lỏng trong cơ thể sống bao gồm muối vô cơ, carbonhydrate, vitamin, axit amin, các tiền chất biến dưỡng, nhân tố tăng trưởng, hormone, các yếu tố vi lượng và đặc biệt quan trọng là huyết thanh. Các chất dinh dƣỡng thiết yếu giúp tế bào phân chia như amino acid, acid béo, đường, các ion, các vitamin, cofactor và các phân tử cần thiết để duy trì môi trường hóa học cho các tế bào. Có hai loại môi trường để nuôi cấy tế bào:
o Nhóm môi trường tự nhiên là những môi trường chứa các hợp chất tự nhiên như Lactabumin hydrolysat, huyết thanh, tinh chế mô phôi (gà, người…) o Nhóm môi trường tổng hợp là những môi trường được chế từ các chất hóa học
nhƣ các axit amin, các vitamin, các muối khoáng…
Việc phát hiện ra khả năng nuôi cấy TBĐV ở mức in vitro cũng dẫn tới những nỗ lực tìm kiếm các môi trường nhân tạo với các thành phần phù hợp để nuôi cấy chúng. Cho đến nay, các môi trường nhân tạo này đã đáp ứng được việc nuôi cấy TBĐV và đảm bảo cho sự phát triển của rất nhiều loại tế bào khác nhau. Từ loại môi trường cơ bản được hình thành ban đầu mang tên “Basal media of Eagle” 34]
đã xuất hiện thêm các môi trường có thành phần phức tạp hơn như M199, DMEM.
Thành phần của các loại môi trường tuy khác nhau nhưng đều có chung một yếu tố nhất định là chứa các axit amin thiết yếu, vitamin, muối, đường glucose và huyết thanh.
Axit amin: Trong môi trường nuôi cấy tế bào, các axit amin được cho vào môi trường nuôi cấy, chúng được sử dụngcho việc tổng hợp protein và axit nucleic, tham gia vào qúa trình vận chuyển ion. Bởi vì các axit amin là lƣỡng tính, phản ứng nhƣ là axit và bazơ. Các axit amin tự do có thể đóng vai trò nhƣ là các chất đệm.
Cũng giống nhƣ các tế bào trong cơ thể, TBĐV nuôi cấy in vitro cần đƣợc bổ sung
các axit amin thiết yếu, các axit amin cần thiết là các axit amin mà tế bào không tự tổng hợp đƣợc nhƣ: Arginin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, methionin, Phenylaanin, Thrionin, Tryptophan, valin. Bên cạnh đó, các tế bào nuôi cấy còn cần thêm 3 axit amin quan trọng nữa là Cysteine, Glutamine và Tyrosine. Các tế bào chức năng sản xuất nhƣ tế bào gan có thể tự tổng hợp đƣợc Tyrosine từ phenylalanine, hay tế bào gan và thận đều có thể tự tổng hợp đƣợc glutamine. Các axit amin còn lại và proline, các tế bào trong cơ thể hay nuôi cấy in vitro đều có thể tự tổng hợp đƣợc .
Tuy nhiên nhu cầu về Cystein và Tyrosine thay đổi khác nhau tùy theo từng dòng tế bào. Nồng độ của axit amin thường hạn chế mật độ tối đa của tế bào và sự cân bằng của axit amin sẽ ảnh hưởng đến sự sống và tốc độ tăng trưởng của tế bào.
Glutamine cần thiết cho hầu hết các dòng tế bào, các tế bào giữ chức năng vận chuyển đòi hỏi cao vế Glutamine.
Trong môi trường nuôi cấy lơ lửng và các công nghệ nuôi cấy đặc biệt khác có thể đòi hỏi thêm các axit amin khác chẳng hạn nhƣ Serin cho việc phát triển tế bào đơn lẻ. Vì vậy các axit amin khác ngoài 10 axit amin không thể thay thế thường được thêm vào hầu hết các môi trường nuôi cấy tế bào. Vì các tế bào chỉ sử dụng các đồng phân L của các axit amin, các đồng phân D có thể bị hạn chế, nhìn chung trong môi trường nuôi cấy tế bào chỉ chứa các L axit amin. Những axit amin mà tế bào không tự tổng hợp đƣợc là nhu cầu tối cần thiết cho sự phát triển của tế bào vì nó là nguồn dƣ trữ tạo ADN và protein trong tế bào giúp tế bào sống và phát triển tốt sau khi nuôi cấy. Hiện nay, một số nghiên cứu cho thấy rằng Glutamate đƣợc sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào như nguồn cung cấp năng lượng và carbon.
Vitamin:
Khi tăng thành phần môi trường lên (mục đích để giảm hàm lượng huyết thanh xuống) thì danh sách các Vitamin môi trường cũng tăng theo. Khi mật độ tế bào trong môi trường thấp (trong giai đoạn nhân dòng tế bào) thì cần phải tăng lượng Vitamin cho dù trong môi trường đã có sự hiện diện của huyết thanh. Sự hạn chế về Vitamin có ảnh hưởng rõ rệt trên sức sống và tốc độ tăng trưởng của tế bào hơn là trên mật độ tế bào.
Muối:
Các loại muối chủ yếu là thành phần chính tạo ra áp suất của môi trường.
Trong huyền phù tế bào, lượng thường được giẩm xuống để hạn chế sự kết cụm của tế bào. Nồng độ đƣợc xác định bằng nồng độ CO2 ở dạng khí.
Glucose: Được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cung cấp năng lượng.
Dung dịch đệm:
Khi trong môi trường có dung dịch muối cân bằng thì khả năng đệm của dung dịch đệm bị hạn chế, đó là do sự hiện diện của phosphate. Trong những môi trường đòi hỏi cần có dung dịch đệm thì lượng phải tương đương với lượng CO2 ở dạng khí khi bình nuôi cấy mở nắp.
Khoáng chất:
Cũng nhƣ một vài loại Vitamin, hầu hết các khoáng chất cần thiết cho tế bào được cung cấp bởi huyết thanh. Việc bổ xung các chất này vào môi trường nói chung không cần thiết làm, trừ khi có sự giảm lượng huyết thanh trong môi trường.
Trong môi trường có hàm lượng huyết thanh thấp hoặc hoàn toàn không có huyết thanh thì lúc đó cần phải bổ sung sắt, đồng, kẽm, selenium vào môi trường nuôi cấy.
Các chất hữu cơ khác:
Các hợp chất khác nhau nhƣ nucleoside, các chất trung gian của chu trình Krebs, Pyruvate và lipid cũng có mặt trong môi trường nuôi cấy phức tạp. Những hợp chất này cần thiết khi giảm lượng huyết thanh trong môi trường nuôi cấy. Các chất này có vai trò trong nhân dòng và duy trì các dòng chuyên biệt.
Huyết thanh:
Ngoài những yếu tố kể trên, việc bổ sung 5 - 20% huyết thanh động vật vào môi trường là cần thiết. Huyết thanh là hỗn hợp của hàng trăm protein các loại kèm theo các yếu tố phát triển, các hormone sinh trưởng và cả insulin. Vì vậy, người ta cho rằng huyết thanh cung cấp các yếu tố kích thích sinh trưởng và là nguồn protein dồi dào cho tế bào nuôi cấy in vitro. Bên cạnh đó huyết thanh còn giữ vai trò quan trọng trong sự bám dính của tế bào lên bề mặt cơ chất nuôi cấy. Trong trường hợp không được sử dụng huyết thanh như khi nghiên cứu biệt hoá tế bào gốc thì một số thành phần khác cần đƣợc bổ sung nhƣ axit linoneic, axit lipoic, putrescine, pyruvate, thymidine, các axit amin nhƣ L-alanine, L-asparagine, một số
yếu tố vi lượng như Mn, Mo, Ni, Se, Si, Sn, V, Cd, các yếu tố sinh trưởng và hormone sinh trưởng như insulin, transferring, hydrocortisol... [10,13].
Được cung cấp đầy đủ các yếu tố cần thiết kể trên từ môi trường, tế bào nuôi cấy có đủ khả năng tự tổng hợp các tiền chất của các axit nucleic để thực hiện quá trình sinh trưởng và phân chia của mình ở mức in vitro, duy trì được sự phát triển ổn định trong quá trình nuôi cấy.
Điều kiện nhiệt độ và điều kiện môi trường khí quyển trong khu vực nuôi cấy rất cần thiết cho quá trình nuôi cấy TBĐV in vitro. Nhiều nghiên cứu cho thấy nhiệt độ thích hợp nhất cho các tế bào nuôi cấy phát triển là 36.5-370C. Đây là nhiệt độ cơ thể bình thường của nhiều loài động vật. Sau khi được tách khỏi cơ thể, sống trong nuôi cấy in vitro, các tế bào cũng yêu cầu điều kiện nhiệt độ tương thích như trong cơ thể sống để có thể phát triển và thực hiện các chức năng.
Về điều kiện môi trường khí quyển trong khu vực nuôi cấy ví dụ như trong tủ ấm thì nồng độ Oxygen và khí CO2 được xem là có ảnh hưởng lớn nhất đến khả năng phát triển của tế bào nuôi cấy.
Các loại tế bào hay mô khác nhau có yêu cầu khác nhau về nồng độ oxygen trong môi trường. Trong khi hầu hết các tế bào nuôi cấy in vitro chỉ cần có nồng độ oxygen thấp 4] thì một số mô tế bào nhƣ phôi ở giai đoạn sớm lại yêu cầu thành phần oxygen lên tới 95% trong khí quyển nuôi cấy chúng 35]. Sự khác biệt này chủ yếu do các tế bào nuôi cấy dàn trải trên bề mặt nuôi cấy nên có thể dễ dàng tiếp xúc với oxygen khuyếch tán và hoà tan trong môi trường, ngược lại các tế bào ở sâu trong mô nuôi cấy không được tiếp xúc trực tiếp với môi trường nên lượng oxygen hoà tan cần cao hơn nhiều lần để thẩm thấu với hàm lƣợng cao hơn và tế bào nội mô có thể hấp thụ được. Ngoài ra, trong môi trường nuôi cấy không có huyết thanh thì vai trò của oxygen hoà tan rất quan trọng, do đó nồng độ oxygen trong môi trường thiết bị nuôi cấy cần đƣợc quan tâm để đảm bảo cho sự phát triển phù hợp của tế bào. Bên cạnh đó, môi trường nuôi cấy luôn cần được duy trì lượng oxygen hoà tan trong đó, giúp cho tế bào có đủ lƣợng oxygen cần thiết cho hoạt động sống của chúng.
Hàm lƣợng khí CO2 cũng đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình nuôi cấy TBĐV in vitro bởi vì nó đƣợc xem là một trong những yếu tố duy trì độ pH cho môi trường nuôi cấy luôn ở trung tính, phù hợp cho tế bào phát triển.
Carbon Dioxide (CO2)có vai trò phức tạp hơn O2 vì có sự tương quan giữa mọi hoạt động của nó, nhƣ CO2 hòa tan, pH và nồng độ HCO3-. Khó có thể xác định đƣợc tác dụng chính của nó. Áp lực của CO2 không khí sẽ điều hòa trực tiếp nồng độ CO2 hòa tan trong môi trường tương tự như vai trò của nhiệt độ. Sự hòa tan CO2 trong nước sẽ tạo ra acid.
CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3- (1)
HCO3- có độ hòa tan thấp và không kết hợp với các cation hiện diện trong môi trường. Nó có khuynh hướng tái hợp để tạo ra acid. Kết quả cuối cùng của sự tăng CO2 không khí là sự giảm pH môi trường. Ảnh hưởng này có thể giải quyết bằng cách tăng nồng độ bicarbonate trong môi trường nuôi cấy.
NaHCO3- Na+ + HCO3- (2)
Sự tăng nồng độ bicarbonate sẽ đẩy phương trình (1) lệch sang trái và sự cân bằng chỉ đạt đƣợc khi pH = 4. Nếu sử dụng một chất kiềm khác nhƣ NaOH thay cho NaHCO3 thì kết quả cuối cùng cũng tương tự.
NaOH + H2CO3 NaHCO3 + H2O Na+ + HCO3- + H2O (3) Mỗi môi trường đòi hỏi một nồng độ HCO3-
và áp lực CO2 để đạt đƣợc pH và áp suất thẩm thấu chính xác. Tuy nhiên, vẫn có những thay đổi tối thiểu xảy ra trong các phương pháp chuẩn bị môi trường khác nhau. Thông thường khí CO2 được bổ sung vào khí quyển nuôi cấy ở nồng độ 5%. Tuy nhiên, tuỳ theo lƣợng tế bào nuôi cấy và hệ nuôi cấy mở hay kín mà nồng độ này nên đƣợc điều chỉnh cho phù hợp.
Khi tế bào đƣợc nuôi cấy với mật độ trong bình có nắp cho phép không khí lưu thông thì cần phải được nuôi trong điều kiện có CO2 không khí, nồng độ của CO2 phải cân bằng với nồng độ bicarbonate sodium trong môi trường, nhưng trong trường hợp lượng tế bào nuôi cấy rất ít (như trong khi tách dòng – cloning) thì cần tăng cường hàm lượng CO2 lên rất cao. Trong hệ nuôi cấy kín, hàm lượng CO2 cũng nên đƣợc bổ sung cao hơn so với nuôi cấy hở.
Tuy nhiên, khi lƣợng tế bào nuôi cấy với mật độ dày đặc thì nên giảm hàm lƣợng CO2 trong khí quyển do lúc này một lƣợng axit lớn đƣợc sản sinh trong quá trình nuôi cấy, ngoài ra lúc này các CO2 tự sinh của tế bào cũng tăng cao. Vì vậy, trong nuôi cấy TBĐV in vitro hàm lƣợng CO2 cần đƣợc điều chỉnh phù hợp cho từng loại tế bào và yêu cầu nghiên cứu của từng thí nghiệm để đảm bảo cho tế bào có thể phát triển tốt 36]. Trong trường hợp tế bào tạo ra nhiều acid và CO
thì cần phải nới lỏng nắp bình để CO2 thoát ra ngoài. Trong những trường hợp này cần phải bổ xung dung dịch đệm HEPES (20mM) vào môi trường để ổn định pH.
Tóm lại, việc nuôi cấy tế bào yêu cầu một số điều kiện nhất định để có thể duy trì khả năng sống và hoạt động chức năng của tế bào nhƣ cần có những bề mặt nuôi cấy phù hợp, những môi trường có đầy đủ thành phần dinh dưỡng, những điều kiện về nhiệt độ, nồng độ oxy, cacbonic trong khí quyển nuôi cấy và cuối cùng là điều kiện vô trùng tuyệt đối.