ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Tế bào lympho máu ngoại vi người
Bộ NST người ở metaphase thuộc lần phân chia nguyên nhiễm đầu tiên của tế bào lympho máu ngoại vi người nuôi cấy in vitro được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu. Năm mẫu máu toàn phần lấy từ 5 người khỏe mạnh chưa có tiền sử bệnh lý phải điều trị bằng liệu pháp chiếu phóng xạ, được xác nhận qua test kiểm tra sai hình nhiễm sắc thể với mức 1000 metaphase/mẫu. Các mẫu máu được xử lý chống đông trong heparin và bảo quản 40C/24 giờ trước khi chiếu xạ.
2.1.2. Nguồn phóng xạ sử dụng trong nghiên cứu
Nguồn phát gamma đơn năng do đồng vị Co60, hoạt độ 592 Ci, năng lượng photon Eg = 1,25 MeV, LET = 2.0 KeV/àm, suất liều 125 mGy/h. Được quản lý bởi Phòng An toàn phóng xạ, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt.
2.1.3. Các thiết bị nuôi cấy tế bào và phân tích số liệu
Các thiết bị nuôi cấy tế bào động vật và làm tiêu bản cố định nhiễm sắc thể.
Kính hiển vi huỳnh quang ELAB80i (NIKON) độ phóng đại 1500x, chụp ảnh kỹ thuật số, phân tích được trên máy tính.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp chiếu mẫu, đo liều
Mỗi mẫu máu được sử dụng cho 1 tập hợp mẫu. Máu toàn phần vô trùng chống đông bằng lithium heparin được chia ra 6 lọ dung tích 1 ml, dung tích máu 0,5 ml/lọ, số 1 là lọ dùng để đối chứng (0Gy), 5 lọ còn lại được đánh số phân bố trong dải liều từ 0,1 - 0,5Gy. Mỗi lọ được gắn 1 liều kế nhiệt phát quang (TLD - thermal light dosimeter), chiếu mẫu được thực hiện trong hốc chiếu thiết kế đảm bảo trường liều đều, thời gian chiếu phụ thuộc vào liều được tính toán theo thiết kế thí nghiệm. Liều hấp thụ của từng lọ chiếu được xác định bằng phương pháp đo nhiệt phát quang (TLD).
2.2.2. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào lympho và làm tiêu bản hiển vi
Nuôi cấy tế bào sau chiếu xạ được thực hiện theo thường qui của nhóm cố vấn đo liều sinh học thuộc Cơ quan Năng lượng Nguyên tử Quốc tế (IAEA).
- Hóa chất
+ Môi trường nuôi cấy tế bào: Bột F10 (Diffco).
+ Lithium heparin 1000 000 E/ml (Giffco).
+ Phytohaemagglutinin (PHA) (Sigma).
+ Kháng sinh kanamicine.
+ Huyết thanh thai bò (Diffco).
+ L-Glutamin (Giffco).
+ Colchicine (Giffco).
- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Chuẩn bị môi trường gốc: 9,9gr bột F10/ 1000ml nước cất 2 lần, chỉnh PH bằng NaHCO3 đến PH 7.3, lọc vô trùng, bảo quản ở 400C.
Chuẩn bị môi trường toàn phần: 100ml dung dịch F10 + 20ml huyết thanh + 5ml PHA + 1,25ml L-Glutamin + 1,25ml Heparin + 1ml kháng sinh Kanamicine.
- Nuôi cấy tế bào
Mẫu máu toàn phần (0,5 ml) ở mỗi lọ sau khi chiếu xạ được nuôi cấy ở 370C trong 5ml môi trường toàn phần. Thời gian nuôi cấy là 48h, 2giờ trước khi thu hoạch thêm vào 1ml dung dịch colchicin 10-5M để bắt giữ các tế bào đang phân chia ở metaphase của lần phân bào thứ nhất và ngăn chặn sự bắt đầu chu trình thứ hai.
- Cố định tế bào
Sau thời gian ủ 48 giờ: tiến hành ly tâm, hút bỏ bọt khí, xử lý nhược trương trong dung dịch KCl 0.075M (đặt ống nghiệm trong khay nước ấm 370C trong 20 phút). Sau 20 phút xử lý nhược trương, ly tâm với tốc độ 1500v/phút trong 7 phút, giữ cặn lắng, trộn lại trong carnoy (hỗn hợp methanol và acid acetic tỷ lệ 3:1). Ly tâm thay mới carnoy 3 lần. Cặn tế bào có màu trắng trong của lần ly tâm cuối được trộn lại trong 2 ml carnoy.
- Làm tiêu bản hiển vi
Huyền dịch sau cố định được nhỏ từng giọt lên lam kính tráng carnoy, đặt lên máy làm tiêu bản 370C /100 giây. Sau khi ghi ký hiệu, tiêu bản được nhúng qua ethylic 70% /10 phút, sau đó đặt vào cốc nhuộm và đổ thuốc nhuộm vào (5% Giemsa stock trong đệm PBS). Thời gian nhuộm là 20 phút. Rửa tiêu bản trong nước cất để loại thuốc nhuộm thừa, để khô tự nhiên. Trong trường hợp cần bảo quản lâu dài, tiêu bản được gắn lamen.
2.2.3. Phương pháp phân tích sai hình nhiễm sắc thể
Phân tích sai hình NST được tiến hành trên kính hiển vi quang học và ảnh kỹ thuật số truyền qua máy tính. Chỉ tiêu phân tích là các giá trị sinh học của hiệu ứng sai hình NST được hình thành, các giá trị định lượng hiệu ứng: Tần số phân bố sai hình NST qua từng mẫu chiếu, từng điểm chiếu.
Việc ghi nhận sai hình NST trong phân tích được thực hiện bằng cách nhận dạng các kiểu sai hình nhiễm sắc thể kết hợp với việc kiểm tra các qui luật di truyền hình thành sai hình NST. Bộ NST chứa NST bất thường được chụp ảnh trực tiếp nhờ máy ảnh kỹ thuật số gắn trên kính hiển vi huỳnh quang, hình ảnh được truyền qua máy tính, dữ liệu phân tích được lưu lại dưới dạng ảnh, tạo điều kiện cho việc nhận dạng các kiểu sai hình NST và so sánh hình ảnh sai hình NST thu nhận được ở các liều từ 0,1Gy đến 0,5Gy của nguồn bức xạ Gamma suất liều thấp.
2 tâm 3 tâm Mảnh Dogleg Minute
Vòng Chuyển đoạn Đảo đoạn Đứt NStử Radical
Hình 2.1. Hình ảnh mô tả một số kiểu sai hình NST
Cơ chế phân loại của Savage được sử dụng để xác định kiểu sai hình nhiễm sắc thể: Mỗi kiểu sai hình nhiễm sắc thể thể hiện được các bằng chứng di truyền học về sự hình thành từ các tổn thương phân tử DNA. Số lượng tâm động là bất biến trong Karyotype – bằng 46. Sự hình thành một sai hình hai tâm
luôn kèm theo mảnh không tâm: Trong trường hợp trao đổi hoàn toàn giữa 2 NST, tức là có sự “nối lại”của hai đoạn không mang tâm động của 2 NST thì một mảnh không tâm sẽ đi kèm với một sai hình hai tâm. Số đơn vị đếm được trong metaphase là 46. Ngược lại, trong trường hợp trao đổi không hoàn toàn thì sẽ có 2 mảnh không tâm đi kèm với một sai hình hai tâm, lúc này sẽ có 47 đơn vị có mặt trong một metaphase. Một sai hình kiểu ring cũng sẽ kèm theo một mảnh không tâm (số đơn vị là 47), hoặc 2 mảnh không tâm (số đơn vị là 48). Một sai hình 3 tâm kèm theo ít nhất hai mảnh không tâm. Trong trường hợp mảnh không tâm xuất hiện trong một metaphase không kèm theo sai hình đa tâm hoặc ring thì số lượng mảnh không tâm sẽ bằng số đơn vị vượt quá 46.
2.2.4. Phương pháp toán học
- Số liệu được thu thập theo phương pháp thống kê. Sử dụng chương trình Excel, phần mềm SPSS (phiên bản 16.0) để xử lý số liệu theo các bước:
(1): Phân tích, thống kê tần số sai hình hai tâm ở các liều khác nhau của nguồn bức xạ nghiên cứu.
(2): Lập bảng quan hệ liều - tần số sai hình hai tâm.
(3): Xác định phương trình phân bố tổng quát.
Phương trình tổng quát được xác định qua việc chọn hệ số tương quan tuyến tính hay hệ số tương quan bình phương, giá trị hệ số tương quan nào gần tới 1 hơn thì phương trình tổng là phương trình phù hợp với tương quan đó.
+ Hệ số tương quan tuyến tính:
r(y,d) = [ồinDiYi - (ồin Di ồin Yi)/n] / {[ồin
Di2 – (ồin
Di)2]1/2[ồin
Yi2 – (ồin
Yi)2]1/2 }.
Trong đó Yi là tần số sai hình hai tâm phân tích được ở mẫu chiếu liều Di;
ni là số lần chiếu mẫu tại liều Di; n là tổng số lần chiếu mẫu của một tập hợp.
Phương trình tổng quát y = kD + b.
+ Hệ số tương quan bình phương:
Tương quan bình phương là dạng có thể tuyến tính hóa bởi vậy nếu đặt D2 = Z sẽ được dạng tuyến tính hóa Y = kZ + C.
Lúc này hệ số tương quan r(y,z) được tính:
r(y,z) = [ồinZiYi - (ồin
Zi ồin Yi)/n] /{[ồin
Zi2 – (ồin
Zi)2]1/2[ồin
Yi2 – (ồin
Yi)2]1/2}. Phương trình tổng quát: y = aD + bD2 + C (4): Xác định phương trình phân bố hồi qui.
Xác định phương trình phân bố hồi qui tức là xác định các hệ số hồi qui thực nghiệm của phương trình phân bố tổng quát đã chọn.
+ Hệ số hồi quy cho phương trình bậc nhất: y = kD + b.
Hệ số k = [ồni yiDi – (ồni Di . ồni yi) / n] / [ồni Di2 – (ồni Di)2 / n].
Hệ số b = (ồni yi - kồni Di) / n.
+ Hệ số hồi quy cho phương trình bậc hai: y = aD + bD2 + C a = {ồni [(yi - C)/Di ] - bồDi} / n .
b = {ồni (yi - C) – [ồni Di . ồni [(yi -C)/Di]] / n } / [ồni Di2 - (ồni Di)2/n ].
Đơn vị của hệ số α là 10-2.Gy-1, đơn vị của hệ số β là 10-2.Gy-2.
Đề tài được thực hiện từ tháng 2/2009 đến 11/2009 tại Phòng Công nghệ Sinh học, Viện nghiên cứu Hạt nhân, Đà Lạt, Việt nam.