CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VẦ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1.1. Định tính các nhóm hoạt chất trong dược liệu Định tính các nhóm chất theo tài liệu [4],[5]
2.3.1.2. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập các hợp chất Chiết xuất
Chiết xuất các hoạt chất từ dược liệu bằng ethanol 96% theo phương pháp chiết nóng. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm. Phân đoạn dịch chiết bằng dung môi công nghiệp có độ phân cực tăng dần n-hexan (Hx), ethyl acetat (EtOAc) và n-butanol (BuOH).
Xác định hàm ẩm của dược liệu, cao đặc dược liệu
Cao đặc dƣợc liệu là cao đặc đƣợc bào chế từ dịch chiết ethanol sâm cau, sau đây gọi tắt là cao đặc sâm cau (CĐ)
Cân chính xác khoảng 2 g bột dƣợc liệu (hoặc CĐ) vào cốc (đã biết chính xác khối lượng), sấy ở 105oC, dưới áp suất thường trong 3 giờ. Sau đó lấy cốc ra, làm nguội tới nhiệt độ phòng bằng cách cho vào bình hút ẩm 15 phút, rồi cân ngay.
Làm lại nhiều lần đến khối lƣợng không đổi [6].
23
Độ ẩm dƣợc liệu (hoặc CĐ) tính theo công thức:
X = x 100%
Trong đó:
X: hàm ẩm dƣợc liệu (hoặc CĐ) tính ra phần trăm m1: khối lƣợng dƣợc liệu (hoặc CĐ) khi chƣa sấy
m2: khối lƣợng dƣợc liệu (hoặc CĐ) sau khi sấy đến khối lƣợng không đổi.
Phân lập
Các phân đoạn được phân lập trên sắc ký cột silica gel pha thường (Merck), sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18, cột Sephadex LH-20. Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn 60 GF254 (Merck), RP18 (Merck). Sắc ký lớp mỏng dùng để theo dõi vết các chất từ các phân đoạn. Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%
trong ethanol.
2.3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập
Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm; 366 nm và hơ nóng ở 110oC) với tối thiểu 2 hệ dung môi khác nhau.
2.3.1.4. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc dựa vào các tính chất hóa lý (trạng thái, màu sắc, nhiệt độ nóng chảy, độ quay cực...) và dữ liệu các phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HMBC, HMQC, COSY, NOESY) và so sánh các dữ liệu thu đƣợc từ thực nghiệm với các tài liệu đã công bố.
2.3.2. Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng tăng lực 2.3.2.1. Đánh giá độc tính cấp
Đánh giá độc tính cấp của CĐ sâm cau qua đường uống theo Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ Dược thảo của Viện Dược liệu (2006) [17], và Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc theo tác giả Đỗ Trung Đàm (1996) [10].
Chuột nhắt trắng thực nghiệm đƣợc nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 3 ngày. Chuột đạt yêu cầu về cân nặng 20 ± 2 g sẽ đƣợc đƣa vào thí nghiệm.
24
Tiến hành thử nghiệm trên các lô chuột (mỗi lô 10 con) theo mức liều 10,0 g CĐ/kg thể trọng; 20,0 g CĐ/kg thể trọng; 30,0 g CĐ/kg thể trọng; 45,0 g CĐ/kg thể trọng.
Cho chuột nhịn ăn, không nhịn uống 16 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm.
Theo dõi chuột liên tục trong vòng 6 giờ, 24 giờ, số chuột chết trong 72 giờ và các dấu hiệu khác trong vòng 7 ngày sau khi dùng mẫu thử. Các chỉ tiêu theo dõi gồm:
- Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tƣ thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, phân, nước tiểu.
- Tỷ lệ chuột chết trong 72 giờ và các dấu hiệu khác trong vòng 7 ngày sau khi thử nghiệm.
- Xác định LD50 (nếu có) theo phương pháp Litchfield –Wilcoxon.
2.3.2.2. Nghiên cứu tác dụng tăng lực
Chúng tôi đánh giá tác dụng tăng lực trên mô hình trụ quay Rotarod theo tài liệu [32].
Nguyên tắc: Chuột nhắt trắng đƣợc cặp chì vào đuôi với trọng lƣợng bằng 6%
trọng lƣợng của chuột, sau đó cho chuột bám trên trụ quay, xác định thời gian từ khi đƣa chuột lên đến khi chuột bị rơi xuống.
Tiến hành: Chuột mua về được nuôi 3 ngày trước khi thí nghiệm để chuột thích nghi điều kiện thí nghiệm. Trước khi tiến hành thí nghiệm 1 ngày, cho chuột làm quen với trụ quay Rotarod bằng cách cho chuột bám vào trụ đang quay với tốc độ tối thiểu trong 2 phút và lặp lại một lần nữa sau 2 giờ. Bố trí thí nghiệm:
+ Ngày thứ 1: Chuột đã đƣợc nhịn ăn, không nhịn uống qua đêm, cặp chì vào đuôi từng chuột (trọng lƣợng chì bằng 6% trọng lƣợng chuột). Cho trụ quay với tốc độ 24 vòng/phút, thả cho từng chuột bám vào mỗi ngăn riêng biệt, ghi lại thời gian bám của từng con kể từ khi bám vào trụ quay cho đến khi chuột bị rơi xuống. Sau lần chạy thứ nhất, chia đều chuột vào 3 lô thí nghiệm và tính thời gian bám trung bình ( ) của chuột theo từng lô:
Lô 1 (lô chứng): uống nước cất
Lô 2 (lô điều trị): chuột uống CĐ liều 0,2 g/kg thể trọng Lô 3 (lô điều trị): chuột uống CĐ liều 0,5 g/kg thể trọng
25
Mẫu thử đều được pha trong nước cất, ở nồng độ phù hợp để đảm bảo thể tích 1 lần cho uống đều ở tất cả các lô là 0,2 ml/10 g thể trọng chuột với liều thử nhƣ trên.
Sau khi uống 60 phút, kẹp chì vào đuôi chuột và cho chuột bám vào trụ quay và ghi lại thời gian bám của từng con. Tính thời gian bám trung bình ( ) của chuột theo từng lô. Tiếp tục cho chuột uống nước, cao đặc sâm cau hàng ngày với liều như trên.
+ Ngày thứ 7: Sau khi cho chuột uống 60 phút, kẹp chì vào đuôi và cho chuột bám vào trụ quay tốc độ 30 vòng/phút. Ghi lại thời gian bám của từng chuột và tính thời gian bám trung bình của chuột ở ngày thứ 7 theo từng lô ( ). Tiếp tục cho chuột uống nước hoặc cao chiết ethanol sâm cau hàng ngày với liều như trên.
+ Ngày thứ 14: Sau khi cho chuột uống 60 phút, kẹp chì vào đuôi và cho chuột bám vào trụ quay tốc độ 24 vòng/phút. Ghi lại thời gian bám của từng chuột và tính thời gian bám trung bình của chuột ở ngày thứ 14 theo từng lô ( ).
Kết quả thực nghiệm: được biểu thị dưới dạng (M ± SE).
Xử lý số liệu: phương pháp thống kê sinh học, sử dụng phần mềm SPSS; sự khác biệt có ý nghĩa khi p<0,05
Đánh giá kết quả: tỷ lệ % thời gian bám trên trụ quay của từng chuột sau khi uống thuốc 1 giờ, 7 ngày và 14 ngày so với trước khi uống thuốc
T =