Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp thực hiện
Các bệnh phẩm sau khi được lấy bằng các kỹ thuật phù hợp và đạt yêu cầu (các dụng cụ lấy bệnh phẩm phải tuyệt đối vô khuẩn, dụng cụ chứa đựng bệnh phẩm phải có nắp đậy kín và phải vô khuẩn, lấy bệnh phẩm đúng nơi, đúng thời điểm và lấy đủ số lượng) được dán nhãn ghi rõ họ tên và gửi ngay đến phòng xét nghiệm vi sinh trong vòng 2 đến 4 giờ cùng với phiếu yêu cầu xét nghiệm. Tại đây sẽ thực hiện qui trình cấy phân lập, chọn khuẩn lạc vi khuẩn gây bệnh và làm kháng sinh đồ.
Cấy phân lập và định danh vi khuẩn
− Cấy phân lập các loại bệnh phẩm trên môi trường thích hợp, riêng đối với bệnh phẩm nước tiểu thì cấy định lượng.
− Định danh: chọn các khúm khuẩn nghi ngờ và ghi nhận tính chất nuôi cấy, đặc điểm khúm, nhuộm Gram, thực hiện test Catalase, Oxidase và Coagulase và các thử nghiệm khác để định danh vi khuẩn.
Bảng 2.1. Quy trình định danh staphylococci tại bệnh viện Nhân dân Gia Định Cầu khuẩn Gram dương Catalase (+) Oxidase (-) Coagulase
(+) (-) Polymycin:
S. aureus (R) S. intermdius (S)
S. saprophyticus (R) S. epidermidis
S. haemolyticus (S) S. lugdunensis
Novobiocin:
MSA Ure Orn Pb S. epidermidis - + V R S. haemolyticus V - - S S. lugdunensis - V + V
• Tính chất nuôi cấy: mọc trên BA, không mọc trên MC. Quan sát hiện tượng tiêu huyết, hình dạng và sắc tố khúm: khúm lồi, bờ tròn, có màu trắng đục đến vàng kem, một số có vòng tiêu huyết bêta.
Một số loại staphylococci như S. aureus có khả năng sinh ra ngoại độc tố hemolysin làm ly giải hồng cầu, làm xung quanh khúm vi khuẩn mọc trên thạch máu xuất hiện vòng sáng tiêu huyết.
• Nhuộm Gram: staphylococci là cầu khuẩn Gram dương, bắt màu xanh tím, sắp xếp dạng chùm nho hoặc rời rạc.
• Thử nghiệm catalase: Men catalase có tác dụng biến hydrogen peroxide (H2O2) thành nước và khí oxygen. Thử nghiệm này dùng để phân biệt giữa staphylococci và streptococci.
2H2O2 2H2O + O2↑
Tiến hành: Nhỏ một giọt hydrogen peroxide 3% lên lame, sau đó đặt lên 1 khúm vi khuẩn, nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương, kết luận là staphylococci. Nếu không có hiện tượng sủi bọt là phản ứng âm, kết luận là streptococci.
Catalase
Hình 2.1: Thử nghiệm catalase
Lưu ý: khi lấy vi khuẩn trên môi trường có máu nên lấy ở phần trên của khúm khuẩn để tránh tiếp xúc với môi trường vì hồng cầu có khả năng làm thử nghiệm catalase dương tính giả (do hồng cầu cũng có peroxidase) [2].
• Thử nghiệm oxidase: dùng để phân biệt staphylococci và micrococci.
Tiến hành: dùng que cấy lấy một phần khuẩn lạc trải lên đĩa giấy oxidase.
Nếu vi khuẩn có khả năng tiết oxidase sẽ có sự đổi màu trong 10-20 giây, là phản ứng dương tính, kết luận là micrococci. Nếu đĩa giấy oxidase không có sự đổi màu là phản ứng âm tính, kết luận là staphylococci.
Hình 2.2: Thử nghiệm oxidase
• Thử nghiệm Coagulase: Men coagulase hiện diện dưới 2 dạng: coagulase dạng liên kết (bound coagulase hoặc clumping factor) và coagulase dạng tự do (free coagulase), được phát hiện khi gặp huyết tương gây nên hiện tượng lợn cợn hoặc đông đặc huyết tương. Đây là thử nghiệm quan trọng nhất để phân biệt staphylococci coagulase dương với các loại staphylococci coagulase âm khác.
Tiến hành:
Trên lame (tìm coagulase liên kết): nhỏ một giọt nước cất lên lame, lấy vài khúm vi khuẩn quậy đều với giọt nước cất để tạo nên huyền dịch vi khuẩn. Sau đó, nhỏ một giọt huyết tương bên cạnh rồi trộn đều huyết tương và vi khuẩn. Quan sát
trong 10 giây, nếu thấy xuất hiện những hạt lợn cợn là thử nghiệm coagulase dương tính.
Lưu ý: nếu để lâu quá 10 giây có thể cho phản ứng dương tính giả. Không lấy vi khuẩn làm thử nghiệm từ những môi trường có nồng độ muối cao như MSA vì có thể cho phản ứng dương tính giả. Nếu thử nghiệm coagulase trên lame âm tính đều phải làm lại trên ống nghiệm để xác định kết quả [2].
Trên ống nghiệm (tìm coagulase tự do): huyết tương được pha loãng 1/5 rồi trộn với canh cấy vi khuẩn cùng thể tích, ủ ở 37oC. Một ống nghiệm khác đựng huyết tương trộn với một chất lỏng vô khuẩn ủ ở 37oC để làm chứng. Sau 1-4 giờ, nếu có hiện tượng đông đặc huyết tương là thử nghiệm coagulase dương tính. Nếu sau 4 giờ không quan sát thấy hiện tượng đông đặc huyết tương phải ủ lại ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và đọc kết quả sau 18 giờ [2].
Hình 2.3: Thử nghiệm coagulase
Các thử nghiệm kháng novobiocin, lên men mannitol … dùng để phân biệt các staphylococci coagulase âm.
• Thử nghiệm kháng novobiocin: S. saprophyticus có khả năng đề kháng novobiocin, thử nghiệm này dùng để phân biệt S. saprophyticus và các staphylococci coagulase âm khác.
Tiến hành: dùng tăm bông trãi đều vi khuẩn lên mặt thạch, đặt đĩa giấy kháng sinh novobiocin lên và ủ ở 35oC trong 24 giờ. Nếu đường kính vòng vô khuẩn ≥12mm thì vi khuẩn đề kháng novobiocin, kết luận là S. saprophyticus. Nếu đường kính vòng vô khuẩn ≤ 16mm, thì vi khuẩn nhạy cảm novobiocin, kết luận S.
aureus hoặc các staphylococci coagulase âm khác [2].
• Thử nghiệm lên men mannitol trên môi trường MSA (Manitol Salt Agar):
Một số loại staphylococci có khả năng lên men đường mannitol trên môi trường MSA, acid sinh ra sẽ làm đổi màu chất chỉ thị đỏ phenol từ đỏ sang vàng [2].
Tiến hành: dùng vòng cấy vô trùng lấy vi khuẩn và vạch zig-zag lên mặt thạch nghiêng ống MSA, ủ ở 35oC trong 24 giờ. Nếu ống MSA chuyển sang màu vàng là vi khuẩn lên men đường mannitol, nếu ống MSA vẫn giữ nguyên màu đỏ là vi khuẩn không lên men đường mannitol.
• Thử nghiệm Urease: urease là một enzyme do một số vi khuẩn sản xuất ra, có thể phân giải urea thành ammoniac làm kiềm hóa môi trường. Urea được pha vào môi trường có đỏ phenol làm chất chỉ thị pH, môi trường sẽ có màu vàng khi pH < 6,8 và màu đỏ khi pH > 8,1 [2].
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
Tiến hành: Dùng vòng cấy vô khuẩn lấy vài khúm vi khuẩn pha vào nước cất tạo nên huyền dịch vi khuẩn, cho đĩa giấy urea vào, ủ ở 35oC trong 24 giờ. Nếu môi
enzyme
trường chuyển sang màu đỏ là phản ứng dương, nếu môi trường có màu vàng là phản ứng âm.
Đối với mẫu nước tiểu, phải đếm định lượng, chỉ làm tiếp khi số lượng CFU
> 100.000/ml.
− Dựa vào các thử nghiệm, chọn khuẩn lạc được xác định là các chủng Staphylococcus spp.
Làm kháng sinh đồ đối với các chủng staphylococci phân lập và định danh được.
− Chọn khúm vi khuẩn đạt yêu cầu của các chủng staphylococci phân lập và định danh được và làm kháng sinh đồ. Thực hiện kháng sinh đồ bằng máy miniAPI, hoặc thực hiện kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby - Bauer (Độ đục McFarland để làm kháng sinh đồ tương đương 0,5): kháng sinh tẩm vào đĩa giấy với nồng độ quy định theo tiêu chuẩn quốc tế sẽ khuếch tán vào thạch, ức chế sự phát triển của vi khuẩn tạo thành vòng vô khuẩn.
− Đối chiếu bảng kết quả kháng sinh đồ (kháng sinh đồ bằng máy miniAPI) hoặc tiến hành đo đường kính vòng vô khuẩn xuất hiện quanh đĩa giấy kháng sinh (kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby – Bauer) để xác định sự nhạy cảm, trung gian hay đề kháng với các loại kháng sinh đó.
− Kỹ thuật tiến hành:
Kỹ thuật làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby – Bauer:
Nguyên tắc: Kháng sinh tẩm vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp sẽ khuếch tán ra mặt thạch chung quanh, ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. Đường kính vòng vô khuẩn bị ức chế diễn đạt tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với thuốc kháng sinh. Trường hợp không có vòng ức chế, vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh.
Chuẩn bị:
Đĩa kháng sinh: trước khi thử nghiệm kháng sinh đồ, các ống chứa đĩa kháng sinh phải được lấy ra khỏi tủ lạnh 1-2 giờ trước khi mở nắp.
Sử dụng các hộp thạch MHA có độ dày khoảng 4mm, đã được ủ và kiểm tra đảm bảo vô trùng để làm kháng sinh đồ. Để phát hiện S. aureus kháng methicillin, sử dụng môi trường có thêm NaCl 2%.
Phương pháp:
Sử dụng nước cất vô trùng để pha loãng khuẩn lạc vi khuẩn thành huyền dịch ở độ đục tương đương 108 CFU/ml (so sánh với độ đục chuẩn Mc Farland 0.5).
Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào huyền dịch, ép hết nước thừa trên thành ống nghiệm, trãi đều vi khuẩn trên mặt thạch, xoay hộp petri 90o rồi vạch đều một lần nữa. Sau đó, để yên khoảng 5-10 phút cho khô mặt thạch trước khi đặt đĩa kháng sinh.
Dùng pince đặt các đĩa kháng sinh lên mặt thạch, ép nhẹ mỗi đĩa để đảm bảo mặt đĩa kháng sinh tiếp xúc đều với mặt thạch. Các đĩa kháng sinh cách mép hộp thạch từ 2 – 2,5cm và cách nhau 2 - 3cm. Không dời đĩa kháng sinh sau khi đã đặt lên mặt thạch.
Ủ 37oc trong vòng 18 đến 24 giờ.
Đọc kết quả kháng sinh đồ: đo đường kính vòng vô khuẩn (mm) và dựa theo tiêu chuẩn của CLSI để xác định mức độ là nhạy cảm (S: susceptible), trung gian (I:
intermediate) và kháng (R: resistant) (xem phần phụ lục).
Kỹ thuật làm kháng sinh đồ bằng máy miniAPI:
ATB strip dùng làm kháng sinh đồ cho staphylococci gồm có 16 cặp giếng:
cặp đầu là giếng chứng C và c; các giếng còn lại là kháng sinh theo danh mục.
Để ATB strip, ATB medium và ATB medium 2% NaCl ở nhiệt độ phòng xét nghiệm vài giờ trước khi dùng. Ghi mã số bệnh nhân lên strip. Câu vi khuẩn vào NaCl 0,85% vụ trựng với độ đục 2 McF. Cho 200àl độ đục 2 McF vào ATB medium và 200àl vào ATB medium NaCl 2% (khụng được lắc). Dựng pipette nhỏ 135àl ATB medium NaCl 2% vào giếng OXAE/OXA, nhỏ 135àl ATB medium vào các giếng còn lại. Đậy nắp ủ ở 35-37oc trong 24 giờ ở môi trường hiếu khí và sau đó đọc kết quả.
Hình 2.4: Kháng sinh đồ bằng ATB Staph
Xử lý và phân tích số liệu:
− Nhập liệu các thông tin, số liệu.
− Xử lý thống kê trên excel