Phần 2: Nội dung Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2. Khái quát về nghiên cứu sử dụng đột biến trong chọn tạo giống cây trồng
1.2.3.2. Các chỉ thị dựa trên PCR
PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử cho phép khuyếch đại, tạo một số lƣợng rất lớn bản sao của gen (hay một đoạn ADN) trong một thời gian ngắn mà không cần đến cơ thể sống.
Nguyên tắc PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của ADN và nguyên lý tổng hợp ADN. Trên cơ sở của đoạn ADN khuôn, đoạn mồi tự do (primer), các nucleotid tự do (dNTP) và enzym ADN polymerase có thể tổng hợp đƣợc đoạn ADN giới hạn bởi các đoạn mồi. Lặp lại nhiều lần chu trình nhân gen, trong một thời gian ngắn số lƣợng bản sao ADN tạo thành tăng theo cấp số nhân [7].
* Nguyên lý chung của phương pháp
PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ cao 90 - 95°C, cao hơn nhiệt độ biến tính (Tm) của khuôn, làm đứt các liên kết hydro của phân tử ADN, hai mạch phân tử ADN tách rời nhau. Đoạn khuôn ADN có các đoạn dài gồm nhiều nucleotid giống nhau, hoặc tỉ lệ G - C càng cao, có nhiệt độ biến tính cao hơn.
Do vậy cần căn cứ đặc điểm của ADN khuôn để lựa nhiệt độ biến tính phù hợp. Giai đoạn này kéo dài 1 - 2 phút.
Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ khoảng 55 - 56°C để các mồi bắt cặp với các mạch đơn ADN khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên lý Chargaff. Giai đoạn này khoảng 30 - 60 giây.
Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ 70 - 72°C thích hợp với điều kiện hoạt động của enzym ADN polymerase. Enzym ADN polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotid vào cuối đoạn mồi, các mồi đƣợc kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn, tạo nên các mạch đơn ADN mới, giai
đoạn này gọi là giai đoạn polymer hoá. Thời gian giai đoạn này từ 30 giây đến vài chục phút, tuỳ thuộc vào kích thước của đoạn ADN. Thông thường với thời gian 2 phút, tổng hợp được những đoạn ADN kích thước dưới 2 kb.
Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu kỳ trước lại được làm khuôn ở chu kỳ kế tiếp, nên số lượng bản sao tạo thành tăng theo cấp số nhân. Một phản ứng PCR thường thực hiện 20 - 40 chu kỳ, từ mỗi đoạn ADN khuôn có thể tạo nên 220- 240 bản sao ADN. Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, cần lưu ý ở những chu kỳ sau lượng khuôn tăng, lƣợng mồi và dNTP tự do giảm, enzym ADN polymerase hoạt động yếu dần. Do đó, cần tính toán hàm lƣợng mồi dNTP, enzym để bảo đảm phản ứng PCR có kết quả tốt nhất [7].
* Các yếu tố cần thiết cho phản ứng PCR
ADN khuôn: đoạn khuôn ADN tinh sạch là một yếu tố quan trọng, đảm bảo kết quả phản ứng PCR tạo được các sản phẩm PCR chính xác. Kích thước đoạn khuôn nhỏ hơn 3kb cho kết quả nhân gen tốt nhất. PCR có thể khuyếch đại đƣợc ADN từ những mẫu sinh học đang bị phân huỷ nhƣ: vết máu, vết tinh dịch để lâu ngày, tóc và xương của người chết,...
Các nucleotid tự do (dNTP): cần thiết cho phản ứng PCR bao gồm:
dATP, dTTP, dGTP và dCTP. Trong mỗi phản ứng PCR cần chú ý tỉ lệ G - C trong đoạn khuôn để xác định hàm lƣợng mỗi đoạn ADN phù hợp. Nồng độ dNTP mỗi loại, thường sử dụng trong các phản ứng PCR khoảng 50 – 200
M. Khi hàm lƣợng các loại dNTP tự do quá ít, tạo sản phẩm PCR không đủ để phát hiện, ngƣợc lại nồng độ dNTP tự do quá cao thì phản ứng PCR khó thực hiện. Do đó, tuỳ theo kích thước đoạn gen và số chu kỳ PCR thực hiện để tính toán nồng độ dNTP thích hợp.
Mồi: là các đoạn oligonucleotid ngắn khoảng 14 - 35 nucleotid, có vai
một đoạn ADN bằng phản ứng PCR, cần có một cặp mồi thích hợp. Một cặp mồi trong PCR gồm mồi xuôi F (Foward) và mồi ngƣợc R (Revert). Mồi có vai trò tạo các nhóm 3’ OH tự do, cần thiết cho phản ứng polymer hoá. Mồi xuôi phải có trình tự tương đồng với trình tự của mạch ADN mang mã di truyền, mồi ngƣợc bắt cặp với mạch ADN mang mã di truyền ở đầu 3’ của mạch.
Emzym ADN polymerase: là yếu tố quan trọng, có vai trò quyết định hiệu quả của phản ứng PCR. Mỗi loại enzym ADN polymerase có đặc tính và vai trò khác nhau trong phản ứng PCR, sử dụng các loại enzym ADN polymerase khác nhau thu đƣợc sản phẩm PCR có tính đặc hiệu khác nhau.
Hàm lượng enzym ADN polymerase cũng ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả PCR. Do đó, trong các phản ứng PCR, tuỳ theo mục đích cụ thể của các nghiên cứu để lựa chọn loại enzym với hàm lƣợng thích hợp.
Dung dịch đệm cho PCR: là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của phản ứng PCR. Dung dịch đệm của phản ứng PCR cần đảm bảo thành phần các chất cần thiết cho hoạt động của enzym ADN polymerase nhƣ: MgCl2, KCl, Tris,... Trong dung dịch đệm, ion Mg2+ là thành phần có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả của phản ứng PCR, do Mg2+ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạch khuôn.
Thiết bị thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR là một chuỗi các chu kỳ tuần hoàn nhiệt, do vậy có thể thực hiện phản ứng PCR trong các thiết bị chuyên dụng là các máy PCR. Ngoài ra, phản ứng PCR có thể thực hiện trong các bể ổn nhiệt, có bộ đếm giờ với dụng cụ thông dụng trong phòng thí nghiệm [7].
* Các ứng dụng chủ yếu của PCR
Sử dụng PCR trong tách dòng gen, xây dựng ngân hàng gen, lập các loại bản đồ gen và giải trình tự gen, bộ gen.
PCR đƣợc ứng dụng trong các nghiên cứu chuẩn đoán sớm các bệnh nhiễm virus, vi khuẩn và các đột biến gây rối loại di truyền.
PCR đƣợc sử dụng trong tạo đột biến in vitro, và trong một số kỹ thuật chuyển gen nhằm tạo ra các giống vật nuôi, cây trồng và vi sinh vật mới.
PCR có vai trò quan trọng trong nghiên cứu nguồn gốc các loài sinh vật và trong phân loại phân tử.
Ưu điểm của phương pháp này là: chỉ cần một lượng nhỏ ADN và có thể không cần đến mẫu dò gắn phóng xạ, có khả năng khuyếch đại trình tự ADN từ các mô đã đƣợc bảo quản, có thể ứng dụng cho nhiều loại chỉ thị di truyền, có khả năng chọn lọc nhiều gen trong cùng một thời điểm và trong thời gian ngắn. Phương pháp này có thể áp dụng được ở tất cả các phòng thí nghiệm quy mô nhỏ và có thể tiết kiệm đƣợc chi phí [7].