Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Xác định nơi phân bố và đánh dấu phân biệt nơi phân bố của từng loài từ đó tiến hành theo dõi quan sát.
Phương pháp mô tả hình thái (theo phương pháp mô tả chi tiết các đặc điểm hình thái của Pellegrino và cs, 2005): sử dụng kính hiển vi chuyên dụng hoặc mắt thường quan sát, từ đó mô tả hình thái, màu sắc của lá, hoa; dùng thước đo và thống kê chiều dài, chiều rộng của lá, cánh hoa, cành hoa.
2.2.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng kỹ thuật PCR- RAPD 2.2.2.1. Tách chiết và tinh sạch ADN theo phương pháp CTAB
Nhìn chung tất cả các phương pháp tách chiết đều tuân theo một quy trình công nghệ, bao gồm các bước:
Phá vỡ tế bào -> loại protein và các tạp chất khác bằng các chất có hoạt tính bề mặt (CTAB) -> tủa ADN bằng Isopropanol hay Ethanol -> rửa kết tủa bằng cồn 70% -> hoà tan ADN trong TE hoặc H20.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp có sử dụng CTAB của Obara - Okeyo & Kako (1998) có một số cải tiến nhỏ để tiến hành tách chiết ADN tổng số từ 18 mẫu giống cúc nghiên cứu.
Quy trình:
1. Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 600C.
2. Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn (mẫu cúc, chày, cối được giữ trước ở - 800C);
3. Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800 l CTAB buffer và 60 l SDS 10%. Thành phần dung dịch đệm chiết: Tris - bazơ 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1,4M ; CTAB 2%, PVP 2%.
5. Bổ sung hỗn hợp Chloroform : Iso amylalcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu. Lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa.
Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới.
6. Tiếp tục chiết lần 2 bằng hỗn hợp Chloroform : Iso amylalcohol (24:1), thu đƣợc dịch chiết chứa AND.
7. Tủa ADN bằng ethanol đã làm lạnh. Để ở - 200C trong 1 giờ.
8. Ly tâm thu tủa 14.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C.
9. Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE.
10. Loại ARN: bổ sung RNase vào mẫu ADN và ủ ở 370C trong 1 giờ.
Các bước tiếp theo tương tự các bước 5 – 9.
- Kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch của ADN.
2.2.2.2. Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR
Muốn khuyếch đại một đoạn gen nào đó bằng kỹ thuật PCR cần phải thiết lập một phản ứng gồm ADN khuôn, dNTPs đã đƣợc hoạt hoá, enzym Taq - polymerase chịu nhiệt, mồi. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên trong phản ứng PCR - RAPD. Thành phần của hỗn hợp phản ứng PCR - RAPD bao gồm:
Buffer 1,5 l
Mg2+ 1,2 l
dNTPs 0,4 l
Mồi RAPD 1,5 l
Taq DNA polymerase 0,3 l
AND 2 l
H20 8,1 l
Tổng 15 l
Phản ứng PCR - RAPD đƣợc tiến hành theo chu trình nhiệt sau:
950C – 5 phút 950C – 30 giây
350C – 1 phút 15 giây 40 chu kỳ 720C – 1 phút 30 giây
720C – 7 phút
Sản phẩm phản ứng PCR đƣợc bảo quản ở 40C cho đến khi điện di.
2.2.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose
Điều kiện điện di: sản phẩm của các phản ứng RAPD đƣợc điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100V, cường độ 3A, thời gian từ 30 - 60 phút.
Cách tiến hành:
Cân 0,4 gam agarose cho vào bình tam giác;
Lấy 40 ml dung dịch TAE 1X cho vào bình tam giác trên;
Đun trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn;
Để nguội (khoảng 65oC), bổ sung 2,5 l EtBr;
Đặt lƣợc vào khay, đổ gel vào để nguội đến khi gel đông lại thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5 - 1 cm;
Tra mẫu: mẫu nhuộm với Xanhmetylen (loading dye), tra vào giếng;
Maker 1kb đƣợc tra vào giếng đầu hoặc giữa bản gel để có thể xác định kích thước các băng;
Chạy điện di: sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di đƣợc kết nối với bộ nguồn. Đặt 100V - 3A. Thời gian chạy khoảng 30 - 60 phút;
Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, ADN sẽ được phát sáng nhờ liên kết với EtBr.
2.2.2.4. Tính hệ số đồng dạng di truyền theo công thức của Nei và Li
Hệ số đồng dạng phản ánh mối quan hệ di truyền giữa các giống đóa trắng với nhau. Hai giống càng gần nhau về mặt họ hàng thì hệ số đồng dạng di truyền càng lớn. Ngƣợc lại hai giống càng xa nhau về quan hệ họ hàng thì hệ số đồng dạng càng nhỏ.
Kết hợp với các đặc điểm địa lý và sinh thái để tìm ra mối quan hệ về nguồn gốc chủng loại phát sinh, mối liên hệ về mặt di truyền giữa các loài thuộc cùng một vùng sinh thái.
2.2.2.5. Phân tích và xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học bằng phần mềm Microsoft Excel version 5.0 và các phầm mềm thông dụng khác.
Hệ số tương đồng di truyền và cây phả hệ được phân tích bằng phần mền NT - SYSPC 2.02.
Chương III