CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.5. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposome chứa phức hợp
Phương pháp đánh giá hình thức, phân bố kích thước tiểu phân, thế zeta của liposome
Hình thức: liposome AMB sau khi đùn ép phải là hỗn dịch, màu vàng nhạt, không có lắng cặn tinh thể, không có các tiểu phân có kích thước lớn có thể quan sát được bằng mắt thường.
Đánh giá kích thước tiểu phân (KTTP), phân bố KTTP bằng phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động (DLS) với thiết bị đánh giá Zetasizer ZS 90:
Nguyên tắc : khi chiếu chùm tia laser vào các tiểu phân có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau. Dựa vào mức độ tán xạ của chùm tia sau khi va chạm vào tiểu phân ta có thể tính được KTTP theo thuyết Mic.
Điều kiện : nhiệt độ 25 ± 2ºC, môi trường nước tinh khiết Thiết bị: máy phân tích KTTP Zetasizer ZS 90
Tiến hành :
- Pha loãng hỗn dịch liposome 100 lần bằng nước tinh khiết đã lọc qua màng cellulose acetat 0,2 àm, tiến hành đo KTTP. Thiết bị cũng cho giỏ trị về chỉ số đa phõn tán PDI của hệ.
Đánh giá thế zeta với thiệt bị đánh giá Zetasizer ZS 90:
Nguyên tắc: xác định gián tiếp thông qua linh độ điện di của tiểu phân nano khi đặt trong điện trường. Tốc độ di chuyển của tiểu phân được xác định thông qua việc so sánh sự sai khác về pha giữa ánh sáng tán xạ và ánh sáng từ nguông laser nhờ ứng dụng định luật Doppler.
Tiến hành :
- Tiến hành pha mẫu đo tương tự như đánh giá KTTP và tiến hành đo thế zeta.
Phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hoá
Phương pháp định lượng AMB trong hỗn dịch liposome
Xác định hàm lượng AMB trong hỗn dịch liposome bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV - VIS:
Điều kiện đo:
Bước sóng: 405 nm Pha mẫu chuẩn và mẫu thử:
Mẫu chuẩn: tương tự pha mẫu chuẩn trong mục 2.3.4.3.
Mẫu thử: Hút chính xác 1 ml mẫu thử, hòa tan bằng hỗn hợp dung môi methanol:chloroform tỉ lệ 3:1 v/v trong bình định mức 10 ml, bổ sung thể tích đến vạch. Hút chính xác 1 ml dung dịch trên, pha loãng bằng dung môi methanol trong bình định mức 25 ml, bổ sung thể tích đến vạch.
Hàm lượng AMB được xác định bằng công thức:
CT = 𝐴𝑡
𝐴𝑐 x mc x k.
Trong đó:
CT: nồng độ AMB trong hỗn dịch liposome (mg/ml).
At: độ hấp thụ quang của mẫu thử.
Ac: độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn.
mc: khối lượng cân của mẫu chuẩn (mg).
k: hệ số pha loãng.
Phương pháp xác định hiệu suất liposome hóa
Định lượng AMB toàn phần: nồng độ AMB trong hỗn dịch liposome thô. Hút chính xác 1 ml hỗn dịch liposome thô, định lượng như mô tả mục 2.3.5.2a thu được độ hấp thu quang là Ao.
Định lượng AMB được liposome hoá: để đánh giá được lượng AMB liposome hoá cần loại bỏ AMB tự do không tan ở dạng kết tủa và AMB nằm trong phức hợp AMB-CD chưa được đưa vào khoang nước của liposome:
- AMB tự do không tan trong nước ở dạng kết tủa bị loại đi trong quá trình đùn ép lần lượt qua các màng 1000 – 400 – 200 nm. Mẫu sau đùn ép sẽ tiếp tục loại bỏ phức AMB-CD nằm ngoài liposome bằng phương pháp đổi đệm sử dụng máy lọc tiếp tuyến tuyếnMicroKros® Filter Modules.
-
Hình 2.3: Cơ chế của phương pháp sử dụng máy lọc tiếp tuyến loại bỏ phần AMB ở dạng phức hợp AMB-CD không nằm trong liposome.
Hút chính xác 1ml hỗn dịch sau lọc tiếp tuyến, tiến hành định lượng như mô tả ở mục 2.3.5.2a thu được độ hấp thụ quang là A1.
Hiệu suất liposome hoá được tính theo công thức:
H= 𝐴1
𝐴0 x 100%
Trong đó:
A0 là độ hấp thụ quang của mẫu liposome thô.
A1 là độ hấp thụ quang của mẫu liposome sau LTT.
Giải phóng in vitro
Đánh giá giải phóng in vitro sử dụng phương pháp thẩm tích ở môi trường đệm photphat pH 7,4 tại 37 oC.
Hỗn dịch liposome sau đùn trong môi trường phức hợp pH 5,5
Hỗn dịch liposome trong môi trường đệm photphat pH 5.5
AMB–CD tan trong nước (phần chưa đưa vào trong liposome)
Màng lọc Dung dịch phức hợp tan trong nước
Liposome chứa phức hợp AMB-CD
Qui trình đánh giá giải phóng: Mỗi mẫu hút chính xác 1ml hỗn dịch, đưa vào túi thẩm tích, kẹp chặt 2 đầu túi, nhúng chìm vào 300 ml môi trường đệm photphat pH 7,4 duy trì ở 37 oC, tốc độ quay 100 vòng/phút. Tại các thời điểm 1h, 4h, 8h, 24h lấy toàn bộ lượng hỗn dịch trong túi, định lượng như mô tả ở mục 2.3.5.2 được Atti.
Lượng dược chất giải phóng tại các thời điểm được tính theo công thức:
Mi =(1- 𝐴𝑡𝑡i
𝐴𝑡𝑡0 )x 100%
Trong đó:
Mi: % dược chất giải phóng tại thời điểm i.
Atti: độ hấp thụ quang của mẫu liposome tại thời điểm i h.
Atto:độ hấp thụ quang của mẫu liposome tại thời điểm 0h.
2.4. Xử lý số liệu
Nghiên cứu được xử lý bằng phép thống kê toán học có sự hỗ trợ của phần mềm Microsoft Excel 2007. Kết quả được biểu diễn dưới dạng GTTB ± SD (giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn).
2.5. Điều kiện thí nghiệm
AMB bị mất hoạt tính khi tiếp xúc với ánh sáng, do đó quá trình bào chế và đánh giá cần thiết được tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng.