CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Xây dựng phương pháp định lượng amphotericin B trong phức hợp và trong hỗn dịch liposome
3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của tá dược HPβCD và tá dược lipid đến phương pháp đo quang phổ UV – VIS
Khảo sát ảnh hưởng của tá dược HPβCD đến phương pháp đo quang phổ UV-VIS Bố trí thí nghiệm:
- Pha dung dịch chuẩn AMB trong methanol cú nồng độ 4,5 àg/ml. (dd1)
- Chuẩn bị một mẫu thử dung dịch phức hợp HPβCD: bào chế 1 mẫu phức hợp, sử dụng lượng AMB ban đầu 10 mg. Hút chính xác 1 ml dung dịch phức hợp vào bình 10 ml, bổ sung methanol đến vạch. Pha loãng với methanol để thu được dung dịch có nồng độ AMB khoảng 4,5 àg/ml. (dd2)
- Pha dung dịch HPβCD trong nước, pha loãng bằng methanol có nồng độ tương đương với nồng độ của HPβCD trong mẫu thử trên. (dd3)
- Tiến hành đo quang phổ hấp thụ của cả 3 dung dịch trên tại bước sóng 405 nm.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của HPβCD được trình bày ở bảng 3.1:
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của HPβCD tới phương pháp đo quang phổ UV-VIS
Mẫu AMB chuẩn AMB-HPβCD HPβCD
Mật độ quang (A) 0,497 0,456 0,013
Nhận xét: Kết quả bảng 3.1 cho thấy:
- Giá trị độ hấp thụ quang của HPβCD trong môi trường methanol là 0,013.
Chứng tỏ HPβCD có ảnh hưởng tới kết quả của phương pháp đo quang phổ UV-VIS.
Kết luận: Như vậy, để loại bỏ ảnh hưởng của tá dược HPβCD, khi tiến hành định lượng AMB trong phức hợp cần sử dụng mẫu trắng là dung dịch HPβCD (cùng nồng độ với mẫu thử) trong methanol.
Khảo sát ảnh hưởng của tá dược lipid đến phương pháp đo quang UV-VIS Bố trí thí nghiệm:
- Pha dung dịch chuẩn AMB trong methanol cú nồng độ 4,5 àg/ml. (dd1’)
- Chuẩn bị một mẫu thử hỗn dịch liposome chứa phức hợp AMB: bào chế mẫu liposome 9 mol% dược chất so với tổng phospholipid, tỉ lệ cholesterol 40%, HSPC:DSPG=2:0,8, dung dịch hydrat hoá: dung dịch phức hợp sử dụng HPβCD. Lấy chính xác 1 ml hỗn dịch liposome hoà tan vào bình 10 ml bằng hỗn hợp methanol : chloroform tỉ lệ 3: 1. Pha loãng với methanol tới hệ số pha loãng thích hợp để thu được dung dịch cú nồng độ AMB khoảng 4,5àg/ml. (dd2’)
- Pha dung dịch 2 tá dược lipid trong methanol có nồng độ tương đương với nồng độ của chúng trong mẫu thử trên. (dd3’)
- Tiến hành đo độ hấp thụ của cả 3 dung dịch trên tại bước sóng 405 nm.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lipid được trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tá dược lipid tới phương pháp đo quang UV-VIS.
Mẫu AMB chuẩn Liposome AMB-
CD Lipid
Mật độ quang (A) 0,497 0,453 0,01
Nhận xét: Kết quả bảng 3.2 cho thấy:
- Giá trị độ hấp thụ quang của dd3’ tại bước sóng 405 nm là 0,01. Điều đó chứng tỏ rằng có sự ảnh hưởng của tá dược lipid tới phương pháp đo quang UV-VIS.
Kết luận: Như vậy, tiến hành định lượng AMB trong liposome chứa phức hợp AMB-CD ở bước sóng 405 nm phải dùng mẫu trắng là liposome trắng sử dụng dung dịch hydrat hoá: dung dịch HPβCD trong môi trường đệm photpphat pH = 5,5 pha loãng trong methanol.
3.1.2. Đường chuẩn biểu thị sự tương quan giữa nồng độ amphotericin B trong methanol và mật độ quang
Xây dựng đường chuẩn:
Cân chính xác 0,01g AMB hòa tan vào 25 ml methanol được dung dịch gốc AMB nồng độ 0,4 mg/ml. Từ dung dịch gốc pha loãng được các dung dịch chuẩn AMB trong methanol cú nồng độ lần lượt là 2àg/ml, 3àg/ml; 4àg/ml; 4,5àg/ml;
6àg/ml. Tiến hành đo độ hấp thụ của cỏc dung dịch trờn ở λ = 405 nm. Kết quả đo quang thể hiện ở bảng 3.3:
Bảng 3.3: Mật độ quang của các dung dịch chuẩn trong methanol.
Nồng độ (àg/ml) 2 3 4 4,5 6
Mật độ quang 0,226 0,334 0,445 0,501 0,705
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ AMB và độ hấp thụ quang.
Nhận xét:
Từ kết quả trên cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ AMB với độ hấp thụ quang A tại bước súng 405 nm trong khoảng nồng độ từ 2 – 6 àg/ml với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1.
y = 0.119x - 0.022 R² = 0.996
0 0.2 0.4 0.6 0.8
0 1 2 3 4 5 6 7
Mật độ quang (A)
Nồng độ mẫu chuẩn (àg/ml)