CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu quan sát dọc tiến cứu 2.2.2. Thu thập số liệu
Nghiên cứu tiến hành thu thập số liệu theo các bước sau:
a) Phần hành chánh:
Ghi nhận họ và tên, tuổi, giới tính, nghề nghiệp, nơi cư ngụ Đo chiều cao, cân nặng, tính BMI
Hỏi bệnh sử, tiền căn dùng thuốc, tiền căn bệnh lý nội ngoại khoa có trước, nơi cư ngụ trước đây và hiện tại, các triệu chứng cơ năng như nôn ói, đau bụng, tiêu chảy,…
b) Khám lâm sàng: (ghi nhận lúc nhập viện và theo dõi hàng ngày)
Các dấu hiệu sinh tồn: tri giác, mạch, huyết áp, nhiệt độ, nhịp thở, độ ấm đầu chi, dấu hiệu phục hồi màu da, lượng nước tiểu.
Các dấu hiệu xuất huyết da niêm: chấm xuất huyết dưới da, bầm vết chích, khối máu tụ, chảy máu răng, chảy máu mũi, xuất huyết âm đạo bất thường, xuất huyết tiêu hóa (ói ra máu, tiêu phân đen).
Các dấu hiệu liên quan với tình trạng thoát dịch mô kẽ: phù, tràn dịch màng phổi, tràn dịch màng bụng.
Các triệu chứng và dấu hiệu thường gặp khác: gan to, vàng da, 2.2.3. Các bước tiến hành trên lâm sàng:
Trong 24 giờ đầu sau khi nhập viện, những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn sẽ được đưa vào nghiên cứu. Bệnh nhân được thu thập thông tin chi tiết ngay lúc nhập viện và các ngày kế tiếp trong suốt thời gian nằm viện bằng cách sử dụng bảng thu thập số liệu theo thiết kế in sẵn. 5 ml máu tĩnh mạch được lấy mỗi ngày để đánh giá diễn biến của bệnh và thực hiện xét nghiệm
chẩn đoán bệnh. Bệnh nhân được chăm sóc, theo dõi và điều trị dựa vào hướng dẫn chẩn đoán và điều trị nhiễm dengue của Bộ Y tế Việt Nam.
Mỗi bệnh nhân sẽ được theo dõi trị số albumin máu và các xét nghiệm DTHC, số lượng tiểu cầu ở các giai đoạn bệnh:
- Ngày 1- ngày 3 (N1-3): giai đoạn sốt - Ngày 4- ngày 6 (N4-6): giai đoạn nặng - Ngày 7-ngày 10 (N7-10): giai đoạn hồi phục - Sau khi xuất viện 4 tuần: trở lại tái khám
Do không có điều kiện thực hiện các xét nghiệm đông máu huyết tương ngay lúc bệnh nhân đang nằm viện, nên bệnh nhân ở mỗi giai đoạn bệnh được lưu trữ 2 ml máu để thực hiện các xét nghiệm đông máu huyết tương về sau.
Mỗi bệnh nhân được làm siêu âm chẩn đoán ít nhất 1 lần vào giai đoạn N4-6 hoặc N7-10 của bệnh.
1. Các bước tiến hành xét nghiệm cận lâm sàng
Tất cả các xét nghiệm huyết học, sinh hóa, vi sinh và kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh được thực hiện tại BVBNĐ TP.HCM.
c) Xét nghiệm huyết học
Công thức máu toàn bộ: được làm mỗi ngày trong quá trình nằm viện và khi bệnh nhân trở lại tái khám. Xét nghiệm được thực hiện bằng máy phân tích huyết học ADVIA 120 (Bayer, Germany).
DTHC tại giường: thường xuyên được đo theo nhu cầu điều trị.
Xét nghiệm đông máu huyết tương:
Thực hiện các xét nghiệm đo lường chức năng đông máu huyết tương (PT, APTT, fibrinogen) vào các giai đoạn tiến triển của bệnh:
Giai đoạn bệnh tiến triển nặng: ngày 4-6 của bệnh
Giai đoạn hồi phục: ngày 7-10 của bệnh
Thời điểm tái khám của bệnh: sau khi xuất viện 4 tuần.
Khi thực hiện xét nghiệm nghiên cứu, nhân viên xét nghiệm không biết về thông tin lâm sàng của các bệnh nhân. Xét nghiệm thực hiện trên máy Start 4 của hãng Diagnostica Stago (Pháp). Các xét nghiệm bao gồm:
PT: dùng thuốc thử Stago Neoplastine của công ty Diagnostica Stago, để khảo sát đường đông máu “ngoại sinh”.
APTT: dùng thuốc thử Stago CK Prest của công ty Diagnostica Stago, để khảo sát đường đông máu “nội sinh”.
Định lƣợng fibrinogen máu: dùng thuốc thử Fibri-Prest 2 của hãng Diagnostica Stago, định lượng theo phương pháp Clauss.
Tất cả xét nghiệm đông máu huyết tương được thực hiện bằng cách lấy và lưu trữ mẫu máu trong vòng 4 giờ sau khi điều dưỡng các khoa lâm sàng lấy mẫu máu tĩnh mạch, chống đông bằng sodium citrate 3,8% tỉ lệ 1/10, nhân viên phòng xét nghiệm sẽ quay ly tâm mẫu máu và nhanh chóng cất giữ phần huyết tương vào tủ đông – 800C. Để đảm bảo kết quả chính xác, những mẫu máu không đủ hay quá thể tích yêu cầu của ống xét nghiệm citrate hoặc mẫu máu bị đông hay tán huyết sẽ bị loại bỏ.
Xét nghiệm albumin máu
Xét nghiệm albumin máu được thực hiện ngay lúc bệnh nhân vào nghiên cứu và tối thiểu 1 lần ở mỗi giai đoạn bệnh sau.
Phương pháp thực hiện xét nghiệm: albumin huyết thanh tác dụng với bromocresol green (BCG) trong môi trường của dung dịch đệm succinate pH 4,2 tạo phức hợp màu xanh lục. Đậm độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ albumin huyết thanh ở bước sóng 620nm bằng phép đo điểm cuối.
Bình thường, nồng độ albumin máu khoảng 35 - 45g/l (giá trị tham chiếu của phòng xét nghiệm BVBNĐ)
Siêu âm chẩn đoán: được thực hiện tại phòng siêu âm của BVBNĐ và do các bác sĩ chẩn đoán hình ảnh của bệnh viện đảm nhiệm. Ghi nhận dấu hiệu tích tụ dịch ở các khoang tự nhiên: dầy thành túi mật, tràn dịch màng phổi, báng bụng.
d) Xét nghiệm chẩn đoán xác định bệnh nhiễm dengue
Để chẩn đoán xác định bệnh nhiễm dengue, tất cả bệnh nhân được làm xét nghiệm MAC-ELISA và xét nghiệm tìm kháng nguyên NS1 trong máu.
Xét nghiệm kháng nguyên NS1:
Được thực hiện bằng kits tìm kháng nguyên NS1 Biorad PlateliaTM làm theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất. Đây là một xét nghiệm miễn dịch enzym vi chuẩn độ kiểu kẹp chả một bước để phát hiện kháng nguyên virus dengue trong huyết thanh hoặc huyết tương người. Các xét nghiệm được thực hiện trên mẫu của bệnh nhân và chứng theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Túm lại, 50 àl huyết thanh mẫu hoặc chứng được ủ trực tiếp và đồng thời với 50 àl dung dịch pha loóng và 100 àl cộng hợp pha loóng trong 90 phút ở 370C trong các giếng của phiến nhựa vi chuẩn độ đã gắn kháng thể đơn dòng kháng NS1. Mật độ quang (OD) được xác định ở bước sóng kép 450/620 nm và tương ứng với lượng kháng nguyên NS1 hiện diện hoặc vắng mặt trong một mẫu riêng biệt căn cứ trên sự so sánh OD của huyết thanh mẫu với huyết thanh chứng ngưỡng. Giá trị ngưỡng (CO) tương ứng với giá trị OD trung bình của hai chứng ngưỡng cung cấp trong bộ sinh phẩm. Kết quả mẫu được biểu hiện như một tỷ lệ, theo công thức sau: tỷ lệ mẫu = S/CO, trong đó S là OD mẫu. Tất cả huyết thanh được xét nghiệm trong hai giếng. Theo khuyến cáo của nhà sản xuất, mẫu được xem là (1) không phản ứng với kháng nguyên NS1 virus Dengue nếu tỷ lệ này nhỏ hơn 0,5, (2) nghi ngờ với kháng nguyên NS1 virus Dengue nếu tỷ lệ này từ
0,5 đến 1,0, và (3) phản ứng với kháng nguyên NS1 virus Dengue nếu tỷ lệ này từ 1,0 trở lên.
Xét nghiệm MAC-ELISA:
Được thực hiện bằng cách xác định kháng thể IgM đối với virus dengue trong huyết thanh bệnh nhân. Sử dụng bộ sinh phẩm xét nghiệm MAC-ELISA do Viện Pasteur TP.HCM sản xuất theo quy trình của CDC (Trung tâm kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ), có độ nhạy 96% và độ đặc hiệu 99%. Huyết thanh pha loãng 1:100 trong dung dịch pha loãng (PBS chứa 1% sữa không béo) được cho vào hai giếng và ủ 1 giờ ở 37°C.
2. Định nghĩa các biến số
a) Biến số liên quan đặc điểm dân số:
Dựa vào dữ liệu được thu thập ngay ở thời điểm mới vào nghiên cứu - Tuổi: chia nhóm theo mỗi 10 năm: lứa tuổi 15 – 24 tuổi , lứa tuổi
25- 34 tuổi, lứa tuổi ≥ 35.
- Giới tính: là biến số định tính, có 2 gía trị là nam và nữ - Tình trạng dinh dƣỡng dựa theo BMI :
- Cân nặng: biến định lượng, tính theo đơn vị kilogram (Kg), thực hiện lúc mới vào nghiên cứu
- Chiều cao: biến định lượng, tính theo đơn vị mét (m), thực hiện lúc mới vào nghiên cứu
- BMI = cân nặng / bình phương chiều cao (kg/m2). Phân loại BMI theo 3 nhóm (phân loại của Châu Á):
o Gầy: BMI ≤ 18,5 kg/m2
o Bình thường: 18,5 kg/m2 <BMI ≤23 kg/m2 o Thừa cân và béo phì: BMI > 23 kg/m2
- Truyền dịch tuyến trước: đa số bệnh nhân chưa được truyền dịch. Những bệnh nhân có truyền dịch trước khi nhập viện với số
lượng dịch rất dao động từ ít nhất là 500ml tới nhiều hơn 6000ml.
Chúng tôi chọn giá trị điểm cắt: 2000ml, là lượng dịch trung bình theo nhu cầu nước mỗi ngày của bệnh nhân người lớn. Để đánh giá biến số truyền dịch tuyến trước, chúng tôi quy về biến định tính với 2 giá trị
o Có truyền dịch tuyến trước: bệnh nhân đã được truyền
≥2000 mL dịch trước khi nhập viện
o Không truyền dịch tuyến trước: bệnh nhân chưa được truyền dịch hoặc số lượng dịch truyền không đáng kể (ít hơn 2000mL)
b) Biến số albumin máu:
- Giá trị albumin máu: tính số trung bình ± độ lệch chuẩn, với đơn vị là g/L.
- Hệ số biến đổi albumin máu: ở giai đoạn N1-3, N4-6, N7-10:
tính theo tỷ lệ %.
albumin máu lúc tái khám – albumin máu ở các giai đoạn X100%
albumin máu lúc tái khám c) Tăng tính thấm thành mạch
Bệnh nhân có biểu hiện tăng tính thấm thành mạch khi đạt 1 trong 2 tiêu chuẩn sau:
- Cô đặc máu: khi giá trị cao nhất của DTHC ở giai đoạn nặng (N4-6) hoặc giai đoạn hồi phục (N7-10) tăng ≥ 20% so với giá trị DTHC căn bản thực hiện lúc tái khám. Nếu không có trị số DTHC lúc tái khám, tôi dựa vào giá trị trung bình ở người Việt Nam trưởng thành bình thường (nam:
42,5 ± 5,5% , nữ: 39 ± 5%) [1]
- Tịch tụ dịch ở các khoang tự nhiên: có bất kỳ dấu chứng nào sau đây: dầy thành túi mật, tràn dịch màng phổi, tràn dịch màng bụng dựa trên kết quả siêu âm bụng ở giai đoạn nặng (N4-6) hoặc giai đoạn hồi phục (N7-10) của bệnh.
d) Rối loạn đông máu:
Dựa trên số liệu thu thập từ nhóm bệnh nhân được theo dõi đầy đủ. Căn cứ vào các biến số:
- Giảm tiểu cầu: khi số lượng tiểu cầu giảm <150.000 / mm3 ở giai đoạn nặng (N4-6) và giai đoạn hồi phục (N7-10) của bệnh.
- Bất thường đông máu huyết tương: dựa trên các xét nghiệm đánh giá tình trạng đông máu huyết tương (PT, APTT,
fibrinogen/ máu) được thực hiện ở giai đoạn nặng (N4-6), và giai đoạn hồi phục (N7-10) của bệnh
- PT: biến liên tục, giá trị bình thường 10-14 giây, bất thường khi giá trị 15 giây [1]
- Activated partial thromboplastin time (APTT) (giây): biến liên tục, giá trị bình thường 25 – 36 giây, bất thường khi giá trị
> 36 giây [1]
- Nồng độ fibrinogen trong máu (g/L): biến liên tục, giá trị bình thường 2-4 g/L, giảm fibrinogen máu khi < 2 g/L [1]
3. Định nghĩa biến chứng và độ nặng
Tất cả biến chứng và độ nặng của bệnh được phân loại ở thời điểm bệnh nhân xuất viện dựa trên nguyên tắc chọn mức độ nặng nhất đối với mỗi bệnh nhân.
a. Độ nặng của tăng tính thấm thành mạch (thoát huyết tương) Ở giai đoạn N4-6 và giai đoạn N7-10 của bệnh có 3 mức độ
- Nhiễm dengue không thoát huyết tương: nhóm bệnh nhân không có biểu hiện tăng tính thấm thành mạch
- Nhiễm dengue thoát huyết tương nhẹ: nhóm bệnh nhân có biểu hiện tăng tính thấm thành mạch nhưng không có biểu hiện sốc
- Nhiễm dengue thoát huyết tương nặng (sốc dengue): nhóm bệnh nhân có biểu biện tăng tính thấm thành mạch kèm dấu hiệu sốc. Sốc dengue khi có đủ 2 yếu tố:
- Thoát huyết tương: DTHC tăng ≥20% giá trị căn bản hoặc tràn dịch đa màng
- Không ổn định huyết động: HA kẹp (≤ 20mmHg) hoặc HA tâm thu< 90mmHg, mạch nhanh nhẹ, dấu hiệu phục hồi màu da ≥2 giây, chi mát, tiểu ít.Độ nặng của giảm tiểu cầu Có 4 mức độ:
- Không giảm tiểu cầu: số lượng tiểu cầu> 150000 /mm3 - Nhẹ: 50000/mm3<số lượng tiểu cầu≤ 150.000/mm3 - Vừa: 20000/mm3 <số lượng tiểu cầu ≤ 50000/mm3 - Nặng: số lượng tiểu cầu≤ 20.000/mm3
b. Rối loạn đông máu huyết tương (RLĐMHT) Có 4 mức độ:
- Không rối loạn đông máu huyết tương: không có bất thường ở bất kỳ xét nghiệm đông máu huyết tương nào.
- Rối loạn đông máu huyết tương nhẹ: có bất thường 1 xét nghiệm đông máu huyết tương
- Rối loạn đông máu huyết tương vừa: có bất thường 2 xét nghiệm đông máu huyết tương
- Rối loạn đông máu huyết tương nặng: có bất thường ở cả 3 xét nghiệm đông máu huyết tương
c. Độ nặng của xuất huyết Gồm 4 mức độ:
1) Không xuất huyết da niêm
2) Xuất huyết da niêm nhẹ: chỉ có tử ban điểm hoặc bầm vết chích 3) Xuất huyết da niêm vừa (không cần can thiệp cầm máu) xuất
huyết da kèm xuất huyết niêm mạc nhẹ, mức độ mất máu nhẹ, không cần truyền máu.
4) Xuất huyết da niêm nặng, bao gồm 1 trong các tình huống sau:
- Tình trạng sốc kéo dài không ổn định về sinh hiệu mặc dù đã được hồi sức dịch truyền tích cực và DTHC có xu hướng giảm nhanh ≤40%.
- Những trường hợp có biểu hiện lâm sàng rõ rệt của tình trạng xuất huyết nội không tự cầm máu: xuất huyết tiêu hóa, xuất huyết não, màng não, xuất huyết khoang màng phổi, ổ bụng, khối máu tụ lớn trong cơ và có nhu cầu truyền máu và các chế phẩm máu.
4. Kiểm soát sai lệch trong nghiên cứu Các sai lệch có thể xảy ra trong nghiên cứu:
- Sai lệch trong chọn mẫu
- Sai lệch trong đo lường các biến số nghiên cứu
- Các yếu tố gây nhiễu liên quan với đặc điểm về dân số.
Chúng tôi áp dụng phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên với các tiêu chuẩn loại trừ chặt chẽ nhằm kiểm soát sai lệch trong chọn mẫu. Mặc khác chúng tôi áp dụng phương pháp hồi quy tuyến tính trong phân tích đa biến nhằm kiểm soát các yếu tố gây nhiễu liên quan tới đặc điểm dân số như tuổi, giới
tính, tình trạng dinh dưỡng, truyền dịch trước khi nhập viện. Để kiểm soát các sai lệch liên quan tới đo lường các biến số, chúng tôi sử dụng kết quả xét nghiệm được thực hiện tại phòng xét nghiệm của Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới (đạt chuẩn ISO) và nếu nghi ngờ kết quả xét nghiệm có sai lệch lớn chúng tôi cho thực hiện lại mẫu xét nghiệm khác ngay lập tức.
5. Các bước thực hiện mục tiêu nghiên cứu Thực hiện mục tiêu 1:
Mô tả sự biến đổi albumin máu qua các giai đoạn bệnh: khảo sát và so sánh giá trị trung bình và hệ số biến đổi albumin máu ở các giai đoạn bệnh với giá trị albumin máu thực hiện lúc tái khám (giá trị tham chiếu của từng cá nhân người bệnh) .
Thực hiện mục tiêu 2:
Mô tả sự biến đổi albumin máu của các nhóm bệnh nhân phân theo biểu hiện cô đặc máu, tích tụ dịch ở các khoang tự nhiên và độ nặng thoát huyết tương qua các giai đoạn bệnh:
- Khảo sát và so sánh giá trị trung bình albumin máu theo thời gian của 2 nhóm bệnh nhân có hoặc không có cô đặc máu.
- Khảo sát và so sánh giá trị trung bình albumin máu theo thời gian của 2 nhóm bệnh nhân có hoặc không có tích tụ dịch ở các khoang tự nhiên.
- Khảo sát và so sánh giá trị và hệ số biến đổi albumin máu của các nhóm bệnh nhân phân loại theo độ nặng thoát huyết tương qua các giai đoạn bệnh. Tìm hiểu mối liên quan giữa sự biến đổi albumin máu và độ nặng của thoát huyết tương.
Thực hiện mục tiêu 3:
Mô tả sự biến đổi albumin máu của các nhóm bệnh nhân dựa theo mức độ rối loạn đông máu và xuất huyết qua các giai đoạn bệnh:
- Khảo sát và so sánh giá trị trung bình và hệ số biến đổi albumin máu theo thời gian của từng nhóm bệnh nhân phân theo độ nặng xuất huyết. Tìm hiểu mối liên quan giữa sự biến đổi albumin máu và độ nặng của xuất huyết.
- Khảo sát và so sánh giá trị trung bình và hệ số biến đổi albumin máu của các nhóm bệnh nhân phân loại theo mức độ giảm tiểu cầu.
- Khảo sát và so sánh giá trị trung bình và hệ số biến đổi albumin máu của các nhóm bệnh nhân phân loại theo mức độ rối loạn đông máu huyết tương.
Thực hiện mục tiêu 4:
Dựa trên số liệu thu thập từ nhóm bệnh nhân được theo dõi ở giai đoạn nặng (N4-6), đánh giá mối tương quan của albumin máu với các yếu tố khác cảnh báo sốc dengue và xuất huyết nặng.
Ứng dụng đường cong ROC tìm điểm cắt (cut-off point) của giá trị albumin máu ở giai đoạn nặng (N4-6) giúp cảnh báo các biến chứng sốc dengue, xuất huyết nặng và nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh phối hợp (xuất huyết nặng kèm sốc dengue). Qua đó, xác định độ nhạy và độ đặc hiệu, đồng thời tính giá trị tiên đoán dương (PPV) và giá trị tiên đoán âm (NPV) của các điểm cắt này.
- Tuổi - Giới tính
- Tình trạng dinh dƣỡng - Truyền dịch tuyến trước
THOÁT HUYẾT TƯƠNG
- Không - Nhẹ
- Sốc dengue
RỐI LOẠN ĐÔNG MÁU Giảm tiểu cầu:
- Không - Nhẹ - Vừa - Nặng
Rối loạn đông máu huyết tương:
- Không - Nhẹ - Vừa - Nặng BIẾN ĐỔI ALBUMIN MÁU
Giá trị trung bình albumin máu
Hệ số biến đổi albumin máu
Giai đoạn: sốt (N1-3), nặng (N4-6), hồi phục (N7-10), tái khám
XUẤT HUYẾT - Không - Nhẹ - Vừa - Nặng
Sơ đồ 2.1. Mô hình nghiên cứu