2.2. Môi tr−ờng pha Lo∙ng – bảo tồn tinh dịch dê
2.2.3. Vai trò của các chất trong môi tr−ờng bảo tồn tinh dịch
Đường có vai trò cung cấp năng lượng cho tinh trùng sống và vận động, bên cạnh đó đường có tác dụng bảo vệ tinh trùng tránh được hiện tượng mất
điện tích bề mặt tinh trùng, do vậy tránh đ−ợc hiện t−ợng tụ dính, giúp cho tinh trùng duy trì sức sống thuận lợi. Ngoài ra đường có tác dụng giải độc cho tinh trùng, ổn định tỷ lệ chất điện giải và chất không điện giải.
Theo Milovanov (1962), tinh trùng sử dụng rất ít glucose đ−ợc đ−a vào môi trường, do glucose, fructose là những đường đơn dễ bị phân huỷ. Những loại đ−ờng khác (saccarose, lactose, maltose...) cũng đ−ợc đ−a vào môi tr−ờng pha loãng.
Đ−ờng giữ vai trò nh− một chất khử. Trong quá trình oxy hoá những
đường khử chịu tác động của oxygen, khi có sự oxy hoá, đường giữ vai trò là một chất chống oxy hoá, là chất bảo vệ cho sự ng−ng kết, tụ dính trong quá
trình này khỏi bị oxy hoá. Đ−ờng có tác dụng chuyển thế năng oxy hoá khử
của tinh trùng sang âm tính có lợi cho tinh trùng. Đ−ờng trong môi tr−ờng pha loãng có tác dụng ức chế những vi khuẩn gây mủ sinh sản, đồng thời
đường làm tăng độ nhớt của môi trường cao hơn so với dung dịch muối.
Hầu hết các tác giả dùng đ−ờng glucose và fructose trong môi tr−ờng pha loãng đông lạnh tinh dịch dê: Amoah và Gelaye [21], Asanbekov [22], Chauhan [26], Deka và Rao [31], [32], Perez [46], Ritar [47], Ritar và Salamon [49], Salamon và Ritar [53], Shamsuddin và cộng sự [55], Tuli và Holtz [59], Vander Westhuysen [60], Nguyễn Xuân Hoàn [7], Đỗ Văn Thu [17], Đỗ Văn Thu và cộng sự [18].
Một số tác giả dùng đường lactose và saccarose trong pha loãng đông lạnh tinh dịch dê: Monji [40], Trejo và cộng sự [58], Peskovatsov [46], Salamon và Ritar [53] cho thấy phần trăm tinh trùng vận động khác nhau trong môi tr−ờng có các loại đ−ờng khác nhau. Trong môi tr−ờng có Tris tỷ lệ tinh trùng vận động cao hơn khi có đường glucose và fructose so với đường saccarose và raffinose. Hàm lượng đường trong môi trường pha loãng đông lạnh ảnh hưởng đến khả năng vận động của tinh trùng sau đông lạnh.
Corteel [28] cho rằng cho thêm đ−ờng glucose vào môi tr−ờng bảo quản làm tăng khả năng vận động của tinh trùng sau đông lạnh. Đường glucose trong dung dịch rửa tinh dịch có tác dụng giảm tỷ lệ tinh trùng chết đáng kể so với rửa tinh dịch bằng dung dịch không chứa đ−ờng glucose. Tinh trùng sống tốt nhất khi tinh dịch đ−ợc rửa và pha loãng trong môi tr−ờng có chứa đ−ờng glucose.
2.2.3.2. Vai trò của chất điện giải
Tinh trùng rất mẫn cảm đối với những dung dịch nuối nh− NaCl, KCl, Na – citrate, nhưng vẫn phải đưa vào môi trường đông lạnh một tỷ lệ muối nhất định, muối không độc và có anion hoá trị cao.
Milovanov nhận thấy trong môi tr−ờng pha loãng, nếu tăng hoá trị của cation thì có hại cho tinh trùng. Muối cation +2 (Ca, Mg, St, Ba) làm cho tinh
trùng tụ dính, muối cation +3 (Al, Fe, Ta) làm cho tinh dịch bị đông đặc và tinh trùng bị chết rất nhanh. Popov (1968) cho thấy các cation hoá trị +1 (Na, K) và hoá trị +2 (Ca, St) đều có tác dụng nh− nhau (trích dẫn theo [17]).
Đối với các anion thì có các t−ơng quan thuận: những muối có anion hoá trị -2 tác động lên tinh trùng tốt hơn so với các anion hoá trị -1. Theo quan
điểm trên mặc dù thành phần hoá học của các muối khác nhau, nh−ng đã là anion cùng hóa trị thì tác dụng cải thiện cho đời sống tinh trùng của mỗi chất
đều giống nhau.
Muối trong pha loãng bảo tồn tinh dịch có tác dụng làm chậm hiện t−ợng phồng chất keo colloid của nguyên sinh chất và màng tinh trùng, hạn chế tình trạng tự ngộ độc bằng những sản phẩm toan tính của sự phân giải,
đồng thời duy trì năng lực đệm của môi trường pha loãng và đông lạnh tinh dịch. Theo Salisbury [54], có thể dùng một loại muối để vừa duy trì áp lực thẩm thấu vừa có tác dụng đệm nh− muối natri phosphat dibasic, muối natri kali tartrat, muối natri – citrate, natri – bicarbonat vừa có tác dụng điều chỉnh pH cho thích hợp vừa có tác dụng cung cấp một l−ợng nhỏ CO2 vào môi trường, ức chế sự hoạt động của tinh trùng.
Muối Tris: được nhiều tác giả dùng trong môi trường pha loãng đông lạnh tinh dịch dê: Amoah và Gelaye [21]; Bowen [25]; Deka và Rao [31], [32]; Monji [40]; Ritar [47], Ritar và Salamon [49]; Salamon và Ritar [53];
Sinha và cộng sự [56]; Trejo và cộng sự [58]; Tuli và Holtz [59]; Vander Westhuysen [60].
Perez [45] cho thấy tris có trong môi trường đã làm tăng hoạt lực tinh trùng so với Kreb – ringer hoặc Krebs – ringer – phosphate – glucose. Monji [40] cho biết khả năng sống của tinh trùng các giống dê đều cao khi pha tinh trùng trong môi tr−ờng có tris. Tris có tác dụng bảo vệ acrosom ít bị h− hỏng khi bảo quản. Theo Salamon và Ritar [53], tinh trùng chịu đ−ợc khoảng nồng
độ tris tương đối rộng, nhưng sức sống của tinh trùng còn phụ thuộc vào loại
đường và nồng độ tris trong môi trường. Sức sống của tinh trùng trong thời gian ủ sau giải đông đ−ợc duy trì tốt trong điều kiện nồng độ tris trong môi trường là 45 mM. Tỷ lệ pha loãng và nồng độ tris ảnh hưởng có ý nghĩa đối với phần trăm vận động của tinh trùng trong thời gian ủ sau khi giải đông. Sự giảm khả năng sống của tinh trùng nhanh hơn trong khoảng thời gian ủ 6 giờ sau giải đông khi nồng độ tris 350 mM so với nồng độ tris thấp hơn.
Muối citrate: được các tác giả dùng trong môi trường pha loãng đông lạnh tinh dịch dê nh− Asanbekov [22]; Chauhan [26]; Deka và Rao [32]; sử dụng citrate trong môi trường đông lạnh tinh dịch dê cho kết quả đáng khích lệ: hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh là 61,10%, tỷ lệ thụ thai đạt 88,46%;
Shamsuddin và cộng sự [55]; Nguyễn Xuân Hoàn [7]; Đỗ Văn Thu [17], Đỗ Văn Thu và cộng sự [19].
Muối trilon B, tên hoá học là Disodium diamino Ethane Tetraaxetat axit, các tên gọi khác là EDTA – B2, complexon – 3, Selaton II, Titon.
Công thức là: [CH2N(CH2COOH)CH2COONa]2 . 2H2O Công thức triển khai là:
NaOOC – CH2 NaOOC – CH2
N – CH2- CH2 - N
HOOC – CH2 HOOC – CH2
Công thức rút gọn là: Na2H2Y
Trong dung dịch loãng, Trilon – B bị phân ly:
Na2H2Y 2Na+ + H2Y2- Dạng đầy đủ của H2Y là:
- OOC – CH2 CH2 – COOH
N – CH2 - CH2 - N
HOOC – CH2 CH2 – COO -
Đó là một anion lớn mang điện tích (-) ở hai đầu “càng cua”, nhờ vào cấu trúc nh− trên mà H2Y2- có thể tạo phức “càng cua” với các ion kim loại đa hoá trị (Ca2+, Mg2+...) có mặt trong tinh dịch các loài gia súc làm cho các ion kim loại không thể hoạt hoá tinh trùng, tăng cường quá trình trao đổi chất của tinh trùng giúp cho tinh trùng sống lâu hơn trong quá trình bảo tồn. Trilon – B ức chế quá trình trao đổi chất của các vi sinh vật có trong tinh dịch làm cho sự sinh tr−ởng và sinh sản của chúng bị kìm hãm, giúp cho môi tr−ờng sống của tinh trùng “sạch hơn, sức sống của tinh trùng sẽ đ−ợc bảo vệ tốt hơn”(trích dẫn theo [5]). Ngoài ra, trilon – B còn hạn chế quá trình trao đổi chất trong tinh dịch, nhất là quá trình phân huỷ, giúp tinh trùng duy trì hàm l−ợng ATP, ADP ở mức độ cao, duy trì đ−ợc trạng thái tiềm sinh của tinh trùng, do vậy bảo vệ đ−ợc acrosom của tinh trùng không bị phá huỷ.
Peskovatsov [46] đã dùng trilon – B trong môi trường đông lạnh tinh dịch dê.
2.2.3.3. Vai trò của lòng đỏ trứng gà
Tác dụng chính của lòng đỏ trứng gà trong môi trường pha loãng đông lạnh tinh dịch là bảo vệ tinh trùng, giúp tinh trùng chống hiện t−ợng choáng lạnh. Chức năng bảo vệ lạnh này thực hiện đ−ợc là nhờ Ovolecithine, là lipoid (một dạng của lipide) có trong lòng đỏ trứng gà, cấu trúc phân tử của nó có một phần −a n−ớc và một phần kỵ n−ớc. Phần −a n−ớc của nó bị hydrat hoá, phần kỵ n−ớc không bị hydrat hoá và liên kết với nhau tạo thành một hệ l−ới vi thể trong dung dịch, làm giảm hệ số tăng nhiệt trong môi trường, do đó tinh trùng đỡ bị “sốc” (shock) do nhiệt.
Khi thêm lòng đỏ trứng gà vào dung dịch Na – citrate vốn rất kiềm có thể giảm pH xuống hơi toan, thích hợp cho đời sống của tinh trùng trong trạng thái tiềm sinh. Lòng đỏ trứng gà còn có năng lực đệm tốt, do hàm l−ợng PO43- rất cao. Lòng đỏ trứng gà là các colloid nên lực nội ma sát của phân tử rất lớn, do vậy làm tăng độ nhớt của môi trường pha loãng tinh dịch.
Theo Rayxơ và Yâng (1928) lòng đỏ trứng có độ hạ băng điểm ∆t = 0,57
– 0,60 t−ơng đ−ơng với áp lực thẩm thấu của tinh dịch (trích dẫn theo[9]).
Smirnov (1974) (trích dẫn theo [17]) cho rằng trong chừng mực nào đó lòng đỏ trứng có tác dụng hỗ trợ mạnh hơn glycerol trong quá trình đông lạnh tinh dịch. Sự có mặt của lòng đỏ trong môi trường pha loãng làm phức tạp quá
trình xảy ra trong đông lạnh tinh dịch. Theo tác giả, lòng đỏ trứng gà có vai trò nh− một chất đệm thẩm thấu đặc biệt. Sự có mặt của lòng đỏ trứng gà làm giảm tác dụng độc của dung dịch nhược trương gồm đường và muối lên tinh trùng.
Theo Ritar và Salamon [48], tỷ lệ lòng đỏ cao hơn 1,5% (theo thể tích)
đã làm giảm sức sống của tinh trùng dê sau đông lạnh trong trường hợp không rửa tinh trùng. Khi pha loãng môi trường với 50% tinh thanh và 9% lòng đỏ trứng gà đã làm ngưng kết môi trường pha loãng và làm chết hết tinh trùng sau 2 giờ bảo tồn.
Theo Hellemaun và cộng sự [36], tinh dịch dê pha loãng trong môi trường tris có 20% lòng đỏ trứng gà cho kết quả hoạt lực tinh trùng và tỷ lệ acrosom bình th−ờng cao hơn tinh dịch pha loãng trong môi tr−ờng Na – citrate- glucose. Lòng đỏ – tris hoặc sữa tách bơ - lòng đỏ trứng đã đạt đ−ợc kết quả tối −u cho hoạt lực tinh trùng, phần trăm tinh trùng sống và acrosom trước và sau đông lạnh khi tỷ lệ lòng đỏ trứng trong môi trường pha loãng là 20% và 7% glycerol. Lòng đỏ trứng gà được xếp loại tốt nhất cho môi trường pha loãng tinh dịch dê, trong số 21 dê cái đ−ợc thụ tinh bằng tinh đông lạnh trong môi trường lòng đỏ – tris thì 21 con đã đẻ.
Theo Ritar và Salamon [50], có mối tương quan giữa tỷ lệ lòng đỏ trứng gà và tháng khai thác tinh dịch. Tỷ lệ tinh trùng sống sau giải đông đạt cao nhất khi môi trường đông lạnh có 12% lòng đỏ trứng trong tháng 3và 0- 1,5%
lòng đỏ trứng trong tháng 8.
Amoah và Gelaye [21] cho rằng pha loãng tinh dịch dê trong môi trường có lòng đỏ trứng đã thu kết quả hạn chế nếu tinh dịch không được loại bá tinh thanh.
Sahni (1987) (trích dẫn theo [17]) cho thấy 10 – 20% lòng đỏ trứng trong môi tr−ờng là l−ợng tối −u cho bảo tồn tinh dịch dê.
Earlier, Roy và Gupta(1959) (trích dẫn theo [17]) cho thấy tinh trùng có khả năng sống trong môi trường có lòng đỏ trứng gà, citrate trong trường hợp không rửa tinh dịch tr−ớc khi pha loãng với môi tr−ờng, dĩ nhiên nếu rửa tinh dịch trước khi pha loãng với môi trường có glycine – lòng đỏ hoặc glycero phosphate – lòng đỏ thì tinh trùng có khả năng sống tốt hơn.
2.2.3.4. Vai trò của glycerol
Cũng nh− lòng đỏ trứng, glycerol có vai trò quan trọng trong sự thành công của công nghệ đông lạnh tinh dịch dê ở nhiệt độ thấp. Glycerol là một loại lipid đơn giản, là este của axit béo và glyxerin. Glycerol không hoà tan trong n−ớc và do tỷ trọng thấp (0,866 – 0,973) nên nổi lên trên bề mặt n−ớc.
Khi cho vào hỗn hợp nước, glycerol, lòng đỏ trứng gà, glucose, lactose, một số muối Na, một số protein..., lắc mạnh trong quá trình pha chế môi trường đông lạnh thì thu đ−ợc một dung dịch là nhũ tr−ơng. Trong nhũ tr−ơng glycerol bị phân tán thành những hạt nhỏ li ti bám vào những lỗ nhỏ trên màng tinh trùng, làm giảm sức căng bề mặt của màng tinh trùng, ngăn cách n−ớc thấm vào bên trong tinh trùng và không bị đông cứng ở nhiệt độ lạnh sâu, giúp cho tinh trùng chống đ−ợc choáng lạnh, không bị tr−ơng phồng, bảo vệ đ−ợc chức năng của màng nhất là khu chỏm đầu acrosom không bị ảnh h−ởng trong điều kiện lạnh sâu, do đó bảo tồn đ−ợc tinh trùng lâu dài.
Smirnov (1974)(trích dẫn theo [17]) cho rằng glycerol liên quan chặt chẽ với những chuyển dịch thẩm thấu xảy ra trong pha loãng đông lạnh tinh dịch. Glycerol làm giảm mức độ phân ly của muối, nên làm giảm áp lực thẩm thấu trong môi tr−ờng pha loãng tinh dịch. Glycerol tạo áp suất thẩm thấu bổ sung một cách đáng kể trong môi trường pha loãng, khi đưa glycerol vào môi tr−ờng thì áp suất thẩm thấu hạ xuống. Ngay sau khi pha loãng glycerol tạo ra ASTT trong môi trường ở mức độ nào đó, đã hỗ trợ áp suất bên trong của tế
bào. Sau đó, glycerol xâm nhập vào tế bào chất và làm tăng ASTT của tế bào.
Salamol và Ritar [53] cho thấy sức sống của tinh trùng sau đông lạnh tuỳ thuộc vào ph−ơng pháp pha loãng, thời gian cân bằng tinh dịch ở +5oC và nồng độ glycerol trong môi trường pha loãng tinh dịch, tác giả so sánh nồng
độ glycerol ở các mức khác nhau 2,5 – 4,0 – 5,5% (theo thể tích).
Theo Deka và Rao [31], nồng độ glycerol trong môi trường pha loãng
đông lạnh tinh dịch có ảnh hưởng đến hoạt lực tinh trùng và tỷ lệ tinh trùng có acrosom hư hỏng sau đông lạnh. Nồng độ glycerol ảnh hưởng không có ý nghĩa đối với hoạt lực tinh trùng trong các giai đoạn sau ủ đông. Nồng độ glycerol 6,4% cho hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh cao hơn so với nồng độ glycerol 4% và 9% (theo thể tích), nh−ng nồng độ glycerol 4% cho tỷ lệ acrosom h− hỏng thấp hơn.
Theo Chauhan [26], Chemineau và Cagnie [27], Corteel [28], Olav Lyngset và cộng sự [43], với glycerol 7% cho kết quả bảo tồn tối −u về hoạt lực tinh trùng, phần trăm tinh trùng sống và tỷ lệ tinh trùng có acrosom h−
hỏng sau đông lạnh. Amoah và Gelaye [21] cho thấy 5% glycerol trong môi trường pha loãng đông lạnh cho kết quả cao hơn nồng độ 3 – 4% glycerol, dùng môi trường 3 – 4% glycerol để đông lạnh tinh dịch.
Singh và cộng sự (1995), cho thấy pha loãng tinh dịch dê trong môi tr−ờng có 6% glycerol giống với pha loãng môi tr−ờng có 1% dimethyl Sulfoxide (DMSO), kết quả cho thấy sự kết hợp giữa glycerol và đ−ờng lactose trong môi trường đông lạnh tinh dịch dê tốt hơn so với chỉ có riêng glycerol.
Singh (1996) cho thấy tinh dịch dê đông lạnh trong môi trường có glycerol kết hợp với đ−ờng lactose cho hoạt tính acrosin cao hơn trong tr−ờng hợp pha tinh trùng với môi tr−ờng có glycerol kết hợp với DMSO (trích dẫn theo [17]).
2.2.3.5. Vai trò của chất kháng sinh
Tinh dịch của gia súc và môi trường pha loãng đông lạnh tinh dịch (nhất là lòng đỏ trứng trong môi trường pha loãng đông lạnh tinh dịch) là môi
tr−ờng thuận lợi cho nhiều loại vi khuẩn phát triển. Trong tinh dịch th−ờng nhiễm một số vi khuẩn (trích dẫn theo [5]). Chúng phát triển rất nhanh trong tinh dịch, chúng trao đổi chất mạnh mẽ, làm nghèo chất dinh d−ỡng trong tinh dịch, làm giảm pH môi trường và thải độc tố làm nhiễm bẩn môi trường. Để hạn chế tác hại của vi khuẩn, cần tuân thủ nghiêm ngặt quy trình vệ sinh và cần thiết phải bổ sung chất kháng khuẩn vào môi tr−ờng. Nguyên tắc sử dụng kháng sinh là về định tính và định l−ợng phải thích hợp để ức chế tối đa vi sinh vật và vô hại với tinh trùng.
Các chất kháng sinh thường được dùng để bổ sung vào môi trường là penicillin, streptomycin, tetracylin.... Cơ chế tác dụng của các chất kháng sinh phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo tế bào của vi khuẩn và cấu trúc hoá học của kháng sinh.
Nhóm penicillin: ức chế sự tổng hợp các mucôpeptit của vỏ tế bào. Khi vi khuẩn lớn lên, vỏ tế bào mỏng ra ở một số điểm để chuẩn bị phân bào, tại các điểm đó penicillin sẽ phong bế enzym chuyển hoá peptit và làm cho vỏ tế bào không đ−ợc bổ sung và cấu trúc bị thiếu sót. Trong khi thể tích nguyên sinh chất, áp lực bên trong tế bào của vi khuẩn vẫn tăng lên (vì quá trình tổng hợp protein không bị penicillin ức chế) do đó vỏ tế bào dung dải một phần sẽ bị vỡ tung ra (d−ới áp lực bên trong). Vì vậy tế bào vi khuẩn cũng bị dung giải và vi khuẩn bị huỷ diệt. Vi khuẩn Gram (+): vỏ tế bào có 60% mucôpeptit nên rất nhạy cảm với penicillin. Vi khuẩn Gram (-): vỏ tế bào chỉ có 10%
mucôpeptit nên không nhạy cảm với penicillin. Tuy nhiên, penicillin có thời gian kháng khuẩn ngắn và có một số vi khuẩn sinh sản ra enzym penicilliaza, β- lactamaza làm mất tác dụng của penicillin. Do vậy, ng−ời ta sản xuất một loại β- lactamin bán tổng hợp để khắc phục nh−ợc điểm này.
Nhóm streptomycin: cơ chế chủ yếu của nhóm này là tác động lên sự tổng hợp protein bằng cách gây ra hiện t−ợng h− biến trong khi tổng hợp protein và trực tiếp hay gián tiếp làm chết tế bào. Streptomycin làm tổn hại