Ph−ơng pháp nghiên cứu sinh học tinh dịch

3.2. Nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu

3.2.1. Ph−ơng pháp nghiên cứu sinh học tinh dịch

Theo phương pháp của Milovanov (1962): Xác định qua ống hút pipét thuỷ tinh có chia độ hoặc theo độ đã chia sẵn trong phễu hứng tinh, đặt lọ tinh dịch trên mặt phẳng nằm ngang và đọc kết quả ở mặt cong dưới mặt tinh dịch.

3.2.1.2. Hoạt lực tinh trùng (A)

Theo phương pháp của Milovanov (1962): sức hoạt động của tinh trùng

đ−ợc tính bằng tỷ lệ % tinh trùng có hoạt động tiến thẳng so với tổng số tinh trùng có trong vi tr−ờng quan sát.

Đánh giá theo thang điểm sau

z 1,0 0,9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0,3 0,2 0,1

% tinh trùng tiến

thẳng

100 - 95 95 - 85 85 - 75 75 - 65 65 - 55 55 - 45 45 - 35 35 - 25 25 - 15 15 - 5

Cách tiến hành:

Dùng đũa thuỷ tinh sạch lấy một giọt tinh dịch đặt lên phiến kính sạch, và có nhiệt độ (30 – 35oC). Dùng một lá kính khô, sạch đậy lên giọt tinh dịch, sao cho giọt tinh dịch đ−ợc dàn đều ra 4 cạnh của lá kính. Đặt tiêu bản lên kính hiển vi (Olympus) và xem với độ phóng đại 200 – 400 lần. Khi kiểm tra hoạt lực tinh trùng, tiêu bản đ−ợc s−ởi ấm ở 37 – 38 OC.

Tinh trùng có 3 hình thức vận động: thẳng tiến – xoay vòng – lắc l−.

3.2.1.3. Nồng độ tinh trùng(C)

Theo phương pháp của Milovanov (1962): dùng buồng đếm hồng – bạch cầu (kiểu Newbauer) và ống pha loãng hồng cầu, pha loãng tinh dịch 200 lần bằng dung dịch NaCl 3% (hút tinh dịch đến vạch 0,5 rồi hút NaCl 3%

đến vạch 101). Trộn đều tinh dịch pha loãng, bỏ 3 – 4 giọt đầu, nhỏ 1 giọt vào buồng đếm đã chuẩn bị sẵn. Đếm tinh trùng trong các ô đếm hồng cầu (4 ô trung bình ở 4 góc và 1 ô ở giữa, mỗi ô trung bình có 16 ô nhỏ, mỗi ô nhỏ có diện tích 1/400 mm2 và độ sâu 1/10 mm.

Nguyên tắc đếm:

Đếm tinh trùng theo đầu. Đếm tinh trùng theo hàng, hết hàng nọ đến hàng kia theo hình chữ chi. Những tinh trùng nằm trên cạnh ô nhỏ chỉ đếm hai cạnh (thường là cạnh trên và cạnh phải). Đếm cả hai buồng đếm rồi lấy kết

quả trung bình, nếu kết quả hai bên chênh nhau 30% thì làm lại. Nếu tinh trùng tụ thành đám thì làm lại.

Công thức tính: C = x1000 .

N 4000 . D . n

Trong đó: C: nồng độ tinh trùng n: số tinh trùng đếm đ−ợc

D: mức độ pha loãng N: số ô con đã đếm

Công thức đơn giản (nếu pha loãng 200 lần): C = n x 107 3.2.1.5. Tổng số tinh trùng tiến thẳng (V.A.C)

Theo John B. Herrick và Self [38]: tổng số tinh trùng tiến thẳng = l−ợng tinh dịch (ml) x nồng độ tinh trùng/ ml x hoạt lực tinh trùng tiến thẳng.

3.2.1.6. Tỷ lệ tinh trùng sống (LS)

Theo ph−ơng pháp của Chemineau và Cagnie [27].

Dung dịch nhuộm: eosin: 1 g; nigrosin: 2 g; tri-Na-citrate. 5,5H2O: 3,57 g;

n−íc cÊt 2 lÇn 100 ml.

(pH dung dịch nhuộm: 6,7 – 6,8, áp suất thẩm thấu 310 miliosmol).

Tiến hành:

- Dùng phiến kính sạch và để ấm ở nhiệt độ +30oC

- Nhỏ 3 giọt dung dịch nhuộm (t−ơng đ−ơng với 30à l) lên một đầu phiến kÝnh.

- Thêm một giọt tinh dịch và trộn đều với dung dịch nhuộm trong vòng 10 gi©y.

- Sau khi pha trộn để 50 giây.

- Dùng phiến kính thứ 2, nhẹ nhàng san đều hỗn hợp đã nhuộm.

- Viết số hiệu con đực và ngày lấy tinh lên tiêu bản.

- Đếm tổng số không dưới 150 tinh trùng, đều ở các vùng. Tinh trùng sống không bắt màu.

- Tính tỷ lệ %.

Số tinh trùng sống LS(%) =

Tổng số tinh trùng đếm đ−ợc x100

3.2.1.7. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K)

Theo ph−ơng pháp của William (1921) kết hợp với ph−ơng pháp của Chemineau và Cagnie [27].

* Làm tiêu bản:

Phết kính: phết một lớp mỏng, đều tinh dịch lên phiến kính, hong khô

tiêu bản trong không khí. Nhuộm màu tinh trùng, nhuộm đơn trong vòng 5 – 10 phút với các loại thuốc nhuộm (xanh methylen, đỏ fucsin, hỗn hợp eosin và nigrosin...). Rửa tiêu bản bằng sức loang của giọt n−ớc cất.

* Quan sát trên kính hiển vi Olympus với độ phóng đại 200; 400; 1000 lần.

* Đếm: lấy ngẫu nhiên, đếm lần l−ợt 300 – 500 tinh trùng bất kỳ, cả

tinh trùng bình th−ờng và tinh trùng kỳ hình.

* TÝnh: K% = N

n x 100 Trong đó: K%: tỷ lệ tinh trùng kỳ hình

n: số tinh trùng kỳ hình các loại

N: tổng số tinh trùng kỳ hình và tinh trùng bình th−ờng

đếm đ−ợc(N = 300 – 500)

3.2.1.8. Sức kháng của tinh trùng (R)

Theo ph−ơng pháp dây truyền của Milovanov (1962) kết hợp với công thức do Nguyễn Tấn Anh cải tiến (1993) [9].

- Dùng 3 lọ sạch, dung tích mỗi lọ 10 ml, đánh số thứ tự I, II, III.

- Rót dung dịch NaCl 1% vào lọ I: 5 ml; lọ II: 1 ml; lọ III: 0,5 ml.

- Dùng ống hút vi l−ợng hút 0,01 ml dung dịch nhỏ vào lọ I, lắc nhẹ, trộn đều, tinh dịch pha loãng 500 lần (5: 0,01).

- Hút 0,1 ml từ hỗn hợp trong lọ I vào lọ II, lắc nhẹ, trộn đều (tinh dịch

đ−ợc pha loãng 1000 lần).

- Dùng ống hút khác hút 0.5 ml hỗn hợp trong lọ II nhỏ vào lọ III, tinh dịch đ−ợc pha loãng 2000 lần (1000 x 2).

- Dùng đũa thuỷ tinh lấy 1 giọt hỗn hợp trong lọ III, đặt lên phiến kính

để kiểm tra sức hoạt động của tinh trùng. Nếu thấy có tinh trùng tiến thẳng, thì

thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% vào lọ III. Mức pha loãng là 2200 lần (1,1 x 2000). Sau đó lại kiểm tra hoạt lực tinh trùng. Nếu có tinh trùng tiến thẳng thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1%. Công việc đ−ợc tiến hành đến khi tinh trùng ngừng tiến thẳng.

Sức kháng đ−ợc tính theo công thức của Milovanov (1933) R = v

V (1)

Trong đó:

R: sức kháng của tinh trùng

V: l−ợng dung dịch NaCl 1% đã sử dụng v: l−ợng tinh dịch đã dùng để kiểm tra Công thức do Nguyễn Tấn Anh cải tiến

R = ro + r.n

Trong đó:

R: sức kháng của tinh trùng

ro: mức pha loãng tinh trùng ở thời điểm lúc đầu (ro = 2000 lần) r: mức pha loãng mỗi lần thêm dung dịch NaCl 1% về sau (r = 200) n: số lần thêm dung dịch NaCl 1% về sau