Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Phương pháp đánh giá nhũ tương kép vitamin C
Loại nhũ tương được ác định bằng cách pha loãng nhũ tương vừa bào chế với dầu Parafin hoặc nước.
2.3.2.1. Phương pháp đánh giá sơ bộ độ ổn định
Quan sát sự tách pha, sự biến đổi màu (nếu có) c a nhũ tương kép nhiệt độ phòng.
Theo dõi sự thay đổi pH c a mẫu nhũ tương kép nhiệt độ phòng.
Xác định phần trăm tách pha (B)
Chỉ số B được ác định như sau: ho 20ml nhũ tương mới bào chế vào ống đong th y tinh có vạch 25ml, bảo quản nhiệt độ phòng; khi có quá trình tách pha, đo thể tích pha nước bị tách sau thời gian nhất định.
Chỉ số cho biết phần trăm lượng pha nước bị tách so với tổng pha nước trong nhũ tương kép. B càng lớn hệ càng kém ổn định.
Công thức tính:
Vsep/20 B = 100
(V1 + V2)/(V1 + V2 + V0) Trong đ : V1 là thể tích pha nước nội.
V2 là thể tích pha nước ngoại.
V0 là thể tích pha dầu.
Vsep là thể tích pha nước bị tách.
2.3.2.2. Phương pháp ác định cấu trúc nhũ tương kép
Mẫu nhũ tương kép sau khi bào chế được pha loãng 2500 lần bằng nước cất sau đ quan sát bằng kính hiển vi.
Sử d ng vật kính 40x và 100x.
2.3.2.3. Phương pháp ác định kích thước giọt và phân bố kích thước giọt nhũ tương kép
- Đo kích thước tiểu phân sử d ng kính hiển vi và thị kính 10x, vật kính 40x.:
+ Xác định giá trị mỗi khoảng c a thước đo thị kính với độ ph ng đại 40
Cách tiến hành: đặt thước đo vật kính lên bàn kính, điều chỉnh bàn kính sao cho một vạch c a 2 thước này trùng khít lên nhau và tìm chỗ trùng khít c a vạch thứ 2.
Khoảng cách giữa 2 vạch liên tiếp c a thước đo thị kính được ác định bằng công thức:
bvk
a = ctk
Trong đ : a (μm) là khoảng cách giữa 2 vạch liên tiếp c a thước đo thị kính.
bvk (μm) là khoảng cách giữa vạch thứ 1 và vạch thứ 2 c a thước đo vật kính bị trùng với 2 vạch c a thước đo thị kính.
ctk là số khoảng chia nằm giữa 2 vạch c a thước đo thị kính bị trùng với 2 vạch c a thước đo vật kính.
+ Mẫu nhũ tương kép pha loãng 2000 lần bằng nước cất trước khi đem đo.
Đặt tiêu bản nhũ tương kép lên bàn kính. Điều chỉnh bàn kính sao cho giọt nhũ tương cần đo nằm dọc thước đo thị kính. Đếm số khoảng mà giọt nhũ tương chiếm chỗ. Kích thước một giọt nhũ tương được tính theo công thức:
d = a.mnt
Trong đ : d là đường kính c a giọt nhũ tương kép cần đo.
a (μm) là khoảng cách giữa 2 vạch liên tiếp c a thước đo thị kính.
mnt là số khoảng thước đo thị kính giọt nhũ tương kép choán chỗ.
Kích thước trung bình c a mẫu nhũ tương kép:
d = ( i)/n
Trong đ : d (μm) là kích thước giọt trung bình c a mẫu nhũ tương kép.
di (μm) là kích thước giọt thứ i.
n là số giọt nhũ tương kép đếm được trên tiêu bản.
- Đo kích thước giọt và phân bố kích thước giọt bằng máy Zetasizer Nano ZS90:
+ Chuẩn bị mẫu đo: mẫu nhũ tương kép sau khi bào chế được pha loãng 4000 lần bằng nước cất; mẫu nhũ tương đơn sau khi bào chế được pha loãng 150 lần bằng dầu Parafin, khuấy từ trong 3 phút.
+ Đo góc tán xạ 90˚ nhiệt độ đo 25 ± 2˚ . 2.3.2.4. Phương pháp ác định thời gian tách pha
Thời gian tách pha là số phút hoặc ngày tính từ khi mẫu bào chế cho đến khi bắt đầu quan sát thấy hiện tượng tách pha. Công thức tính:
TGTP (ngày) = Số giờ từ khi bào chế đến khi bắt đầu quan sát tách pha/24.
2.3.2.5. Phương pháp ác định hiệu suất nạp thuốc
Xác định hiệu suất nạp thuốc (EE) bằng phương pháp thẩm tích. Điều kiện thẩm tích:
- Màng thẩm tích 12 – 14 kDalton.
- Môi trường thẩm tích: 100ml nước tinh khiết được điều chỉnh đến pH 2,5 bằng Acid orthophosphoric.
- Mẫu thẩm tích: 1ml nhũ tương kép mới bào chế.
- ác bước tiến hành:
• Cho túi thẩm tích chứa mẫu thẩm tích vào môi trường.
• Sau 45 phút, hút 5ml môi trường, đem đi định lượng Acid ascorbic. Thu được n ng độ Acid ascorbic tự do, Ctd.
Bổ sung đ lượng thể tích môi trường đã lấy.
• Sau 20 giờ, hút 5ml môi trường, đem đi định lượng Acid ascorbic. Thu được n ng độ Acid ascorbic toàn phần, Ctp.
- Kết quả được tính theo công thức:
Ctd
EE = ( 1 – ) 100 Ctp
Trong đó: EE là hiệu suất nạp thuốc (%)
Ctp là n ng độ toàn phần c a Acid ascorbic trong nhũ tương, bao g m lượng bị bẫy trong pha nước nội và lượng tự do nằm pha nước ngoại.
Ctd là n ng độ tự do c a acid ascorbic nằm pha nước ngoại.
2.3.2.6. Phương pháp định lượng Vitamin C
Acid ascorbic được định lượng bằng phương pháp HPLC với điều kiện như sau:
- Pha tĩnh: ột Eclipse XDB – C8 5μm, kích thước 4,6 mm 150 mm.
- Pha động: hỗn hợp Methanol : dung dịch Dinatri phosphat 80mM - được điều chỉnh đến pH 7,8 bằng dung dịch natri hydroxyd 10% hoặc acid orthophosphoric (nếu cần), lọc qua màng Cellulose acetat 0,45μm, siêu âm 15 phút, với tỷ lệ 3 : 7.
- Tốc độ dòng: 1ml/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 20μl.
- Detector tử ngoại, λ = 278nm.
- Dung dịch pha loãng mẫu: nước tinh khiết được điều chỉnh đến pH 2,5 bằng Acid orthophosphoric (nếu cần).
- Mẫu chuẩn: Cân chính xác một lượng Vitamin C khoảng 100mg, hòa tan hoàn toàn bằng dung dịch pha loãng trong bình định mức 100ml, bổ sung vừa đ thể tích, thu được dung dịch gốc n ng độ 1mg/mL.
Tiếp t c pha loãng dung dịch gốc 200 lần bằng dung dịch pha loãng để thu được mẫu chuẩn có n ng độ khoảng 5μg/ml.
Lọc qua màng lọc Cellulose acetat 0,45μm.
- Mẫu thử: 1ml môi trường thẩm tích pha loãng 10 lần bằng dung dịch pha loãng.
Lọc qua màng Cellulose acetat, kích thước lỗ lọc 0,45μm.
- Công thức tính:
• N ng độ Vitamin C trong mẫu thử được tính theo công thức sau:
St mc 1 Ct =
Sc 100 200
Trong đ : Ct là n ng độ Vitamin C trong mẫu thử (mg/ml)
mc là khối lượng Vitamin cân ban đầu để pha mẫu chuẩn (mg) St là diện tích pic chính c a mẫu thử (mAU.giây)
Sc là diện tích pic c a mẫu chuẩn (mAU.giây)
• Công thức tính n ng độ Vitamin trong nhũ tương kép:
C = Ct 103
Trong đ : t là n ng độ Vitamin C trong mẫu thử (mg/ml).
C là n ng độ Vitamin trong nhũ tương kép (mg/ml).
2.3.2.7. Phương pháp ử lý số liệu
Nghiên cứu được xử lý bằng phép thống kê toán học có sự hỗ trợ c a phần mềm Microsoft Excel 2007. Kết quả được biểu di n dưới dạng GTTB ± SD (giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn) với mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.