2.4.2.1. Tỏch chiết ADN
Sinh phẩm, Húa chất:
QIAamp ADN mini kit (QIAGEN) Cồn 100º
Dụng cụ:
Ống eppendoff 1,5ml và 2 ml vụ trựng Bồn nước núng điều chỉnh được nhiệt độ
Mỏy ly tõm Mỏy vortex
Chuẩn bị:
Bật bồn nước núng, để ở nhiệt độ 56ºC, lấy cỏc ống eppendoff 1,5ml, số lượng ống tương ứng với số lượng mẫu cần tỏch. Đỏnh số thứ tự
Bệnh phẩm đó được bảo quản trong dung dịch đệm A, làm tan bằng cỏch đểở nhiệt độ phũng trong 30 phỳt.
Cỏc bước tiến hành:
Bước 1: Lấy 180àl bệnh phẩm được bảo quản trong dung dịch A cho vào mỗi
ống eppendoff 1,5ml.
Bước 2: Hũa tan protein cú trong bệnh phẩm bằng cỏch cho 20àl QIAGIEN proteinase (protein K), trộn đều nhờ vortex trong 15 giõy.
Bước 3: Ủ trong bồn nước núng 56ºC trong 10 phỳt.
Sau khi ủ, ly tõm nhanh (spindown) nhằm đưa cỏc phần dớnh trờn nắp
ống xuống phớa dưới ống.
Bước 4: Thờm 200 μl đệm AL vào ống, trộn nhờ mỏy vortex trong vũng 15 giõy.
Bước 5: Ủ ở 700C trong 10 phỳt. Sau khi ủ ly tõm nhanh ống để loại bỏ dịch bỏm trờn nắp.
Bước 6: Thờm 200 μl ethanol 100º vào ống và trộn đều nhờ mỏy vortex trong vũng 15 giõy. Sau khi trộn ly tõm nhanh ống để loại bỏ dịch bỏm trờn nắp ống.
Bước 7: Chuyển toàn bộ hỗn hợp sang ống eppendoff cú cột (column spin).
Bước 8: Đúng nắp kớn, ly tõm ở tốc độ 8000 vũng/1 phỳt, trong 1 phỳt
Bước 9: Chuyển cột sang tube 2ml mới.
Bước 10: Cho thờm vào 500àl đệm AW1, ly tõm ở tốc độ 8000 vũng /1 trong 1 phỳt.
Bước 11: Chuyển cột sang tube 2ml mới.
Bước 12: Cho thờm vào 500àl đệm AW2, ly tõm ở tốc độ 8000 vũng trong 1 phỳt.
Bước 13: Chuyển cột sang tube 1,5ml mới.
Bước 14: Thu hồi ADN bằng 200àl đệm AE, để ở nhiệt độ phũng trong 1 phỳt sau đú ly tõm ở 8000 vũng trong 1 phỳt.
Bước 15: Bảo quản mẫu ADN tách triết đ−ợcở -20ºC cho tới khi phân tích.
2.4.2.2. Phản ứng PCR kiểm tra chất lượng mẫu ADN
Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi sử dụng kỹ thuật PCR để phỏt hiện HPV.
Đõy là kỹ thuật mang lại kết quả cú độ tin cậy cao. Kỹ thuật đũi hỏi người thực hiện phải tuõn thủ một qui trỡnh xột nghiệm chặt chẽ ngay từ khõu lấy bệnh phẩm.
Bệnh phẩm sau khi lấy được bảo quản trong mụi trường bảo quản tế bào (SDS 2%; Tris-HCL; 100 mM EDTA 10 mM). Chỳng tụi sử dụng sinh phẩm QIAamp ADN Mini Kit để tỏch chiết ADN. Để đỏnh giỏ hiệu quả tỏch chiết ADN, toàn bộ cỏc mẫu ADN được kiểm tra bằng phản ứng PCR khuếch đại gien beta-globin với cặp mồi PCO3/PCO5. Cặp mồi PCO3/PCO5 cú trỡnh tự
như sau:
PCO3: 5’-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3’ PCO5: 5’-GAAACCCAAGAGTCTTCTCT-3’
Cỏc mẫu ADN cú gien beta-globin được khuếch đại sẽ được phõn tớch
để xỏc định sự cú mặt của HPV ADN, cỏc mẫu khụng cho sản phẩm gien beta-globin sẽ phải tỏch triết lại.
2.4.2.3. Phản ứng PCR phỏt hiện HPV
Một phản ứng PCR tối ưu giỳp phỏt hiện và định type HPV cần phải ỏp dụng được với nhiều loại bệnh phẩm, cặp mồi phải được lựa chọn sao cho phản ứng PCR khuyếch đại được vựng gien đớch cú mặt trong genome của tất cả cỏc type HPV và vựng nằm giữa 2 mồi phải cú dao động đủ lớn để thiết kế đầu dũ đặc hiệu với từng type HPV phục vụ việc xỏc định type. Hai gien L1 và E1 là ổn định nhất trong cỏc type HPV, vỡ vậy cỏc phương phỏp phỏt hiện và định type HPV dựa trờn phản ứng PCR thường tập trung vào 2 gien này. Toàn bộ 300 mẫu quệt cổ tử cung đó được kiểm tra phỏt hiện HPV bằng phản ứng PCR với cặp mồi GP5+/GP6+ khuếch đại một đoạn trỡnh tự dài 150
, gien này khụng bị loại bỏ khi genome của
bp trờn gien L1 HPV gắn vào
genome của tế bào vật chủ. Trong phản ứng PCR này chỳng tụi đó sử dụng thờm cặp mồi PCO3/PCO5 khuếch đại trỡnh tự dài 209 bp của gien Beta globin, để kiểm tra hiệu quả việc tỏch triết ADN. Kết quả phản ứng PCR chỉ được cụng nhận khi cú sản phẩm đặc hiệu dài 209 bp, mẫu bệnh phẩm dương tớnh với HPV sẽ cho sản phẩm PCR dài 150 bp, được phỏt hiện bằng điện di và nhuộm với Ethidium Bromide, mẫu õm tớnh khụng cú sản phẩm này.
Cỏc mồi GP5+/GP6+ cú trỡnh tự như sau:
GP5 + 5’-TTTGTTACTGTGGTAGTACTAC -3’
GP6+5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3'
Cặp mồi này cho sản phẩm PCR cú độ dài 150 bp,
E6 E7 E1 E2 E5 L2 L1 E 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 GP5+/6+ 150bp 321 bp MY09/11 450bp HP18F/18R 561bp E6F/E6R Hỡnh 2.1: Sơđồ genome của HPV và vị trớ cỏc mồi sử dụng cho phản ứng PCR phỏt hiện HPV. Cặp mồi GP5+/GP6+ giỳp phỏt hiện cỏc type HPV, cặp mồi E6F/E6R và
Thành phần phản ứng Chu trỡnh gia nhiệt ADN 5μl 10XPCR Buffer 2μl dNTP 1.6μl PC03/05 1μl cho mỗi mồi GP5+/6+ 1μl cho mỗi mồi H2O 10μl Taq polymelase 0.4μl MgCl2 2μl Tổng thể tớch phản ứng 25μl 940C 5 phỳt Tổng hợp Beta-Globin 940C 1 phỳt 58 0C 30 giõy x 25 chu kỳ 720C 1 phỳt Tổng hợp giene L1 940C 1 phỳt 450C 30 giõy x 35 chu kỳ 720C 1 phỳt 40C giữ nhiệt 2.4.2.4. Phản ứng PCR xỏc định HPV 16 và HPV 18 bằng cặp mồi đặc hiệu
HPV type 16 và HPV type 18 là hai type nguy cơ cao gõy nờn ung thư
cổ tử cung gặp ở khắp nơi trờn toàn cầu. Vỡ vậy, việc phỏt hiện nhiễm HPV type 16 và HPV type 18 là rất quan trọng. Chỳng tụi đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu E6F/R thiết kế nhằm khuếch đại gien đớch cú kớch thước 321bp để phỏt hiện HPV type 16 và cặp mồi HPV 18F/R thiết kế nhằm khuếch đại gien
đớch(L1) cú kớch thước 561bp để phỏt hiện HPV type 18. Sau khi chạy PCR,
điện di sản phẩm trờn gel agarose 1.5%, nhuộm EtBr và chụp UV.
Hai type HPV cú nguy cơ cao với UTCTC là HPV 16 và HPV 18 được xỏc định bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bởi nhúm nghiờn cứu của Viện Cụng nghệ sinh học.
• Phỏt hiện HPV 16
- Mồi E6F/E6R, khuếch đại gien E7, cho sản phẩm PCR dài 321 bp - Điều kiện PCR
Thành phần phản ứng ADN 5 àl 10XPCR Buffer 2àl dNTP 2.5 mM 1.6àl E6F/E6R 1àl cho mỗi mồi H2O 12àl Taq polymelase 0.4àl MgCl2 2àl Tổng thể tớch phản ứng 25àl Chu trỡnh nhiệt 940C 5 phỳt 940C 1 phỳt 450C 30 giõy x 40 chu kỳ 720C 1 phỳt 40C giữ nhiệt • Phỏt hiện HPV 18
- Mồi HP18F/18R, khuếch đại gien L1, cho sản phẩm PCR dài 561 bp - Điều kiện PCR Thành phần phản ứng ADN 5 àl 10XPCR Buffer 2àl dNTP 2.5 mM 1.6àl HPV18F/18R 1àl cho mỗi mồi H2O 12àl Taq polymelase 0.4àl MgCl2 2àl Tổng thể tớch phản ứng 25àl
Chu trỡnh nhiệt 940C 5 phỳt 940C 1 phỳt 450C 30 giõy x 40 chu kỳ 720C 1 phỳt 40C giữ nhiệt 2.4.2.5. Điện di phỏt hiện sản phẩm PCR
Phương phỏp này dựng để phõn tớch định tớnh và bỏn định lượng trong việc thu nhận mẫu ADN.
Nguyờn tắc: dựa vào đặc tớnh của ADN là cỏc đại phõn tử tớch điện õm
đồng đều trờn khắp bề mặt nờn khi chịu tỏc động của điện trường cỏc phõn tử
này sẽ chuyển động từ cực õm sang cực dương. Quóng đường đi của ADN trong trường điện một chiều này phụ thuộc vào 2 chỉ tiờu là khối lượng phõn tử của đoạn ADN khuếch đại (tỷ lệ thuận so với số lượng nucleotide) và nồng
độ gel chạy.
Cỏc bước tiến hành:
Bước 1: Làm gel Agarose 1.5%
• Chuẩn bị thành phần để làm gel gồm: 160 ml dung dịch đệm TAE1X hoà với 2.4 g bột gel agarose.
• Đun trong lũ vi súng cho đến khi agarose tan hoàn toàn (khoảng 12 phỳt), sau đú để nguội xuống khoảng 500C.
• Đổ thạch vào khay điện di đó cài sẵn răng lược. Sau khi gel đó đụng khoảng 30 phỳt, gỡ lược ra, nếu sử dụng ngay thỡ đặt vào bểđiện di cũn
nếu chưa sử dụng ngay thỡ bao kớn bằng giấy búng và cho vào tủ lạnh bảo quản ở ngăn 40C.
Bước 2: Đổ dung dịch đệm TAE1X vào bồn điện di cho tới khi ngập bản gel
độ khoảng 1-2 mm. Khi pha gel bằng đệm TAE1X thỡ khi chạy điện di cũng nờn chạy ở đệm TAE 1X đểđảm bảo thu được kết quả tốt.
Bước 3: Chuẩn bị bồn chứa EtBr bằng cỏch đổ 300 ml TAE1X vào hộp nhựa màu tối sau đú cho thờm 15àl EtBr 10 mg/ml, đảo đều nhờ lắc nhẹ.
Bước 4: Nhỏ mẫu ADN vào cỏc giếng của bản gel
Lấy 7 àl sản phẩm PCR trộn với 1 àl đệm màu 6X (hợp chất này vừa cú tỏc dụng tạo màu để quan sỏt quóng đường lớn nhất ADN đó đi vừa cú tỏc dụng làm nặng ADN khiến ADN lắng xuống đỏy giếng, khụng bị trụi lờn mặt và nhiễm sang cỏc giếng khỏc). Dựng pipet man trộn đều và đưa vào cỏc giếng nhỏ trong gel. Chọn một giếng thớch hợp để cho ADN thang. Chạy điện di ở hiệu diện thế 100V trong vũng 30 phỳt. Chỳ ý chiều đặt thạch là hàng giếng phải đặt quay về phớa cực õm. Quan sỏt sự di chuyển của màu bromophenol để biết khi nào nờn dừng điện di.
Lấy bản gel ra cho vào bồn chứa EtBr đó chuẩn bị, ngõm trong đú 10 phỳt, EtBr sẽ bỏm vào giữa hai mạch ADN.
Lấy bản gel ra cho vào bồn chứa nước sạch độ 2 phỳt rồi chụp ảnh dưới ỏnh sỏng của tia UV của mỏy chụp gel. Tia UV kớch thớch EtBr phỏt ra ỏnh sỏng ghi lại được.