3.1. Thẩm định phương pháp định lượng thuốc tiêm ginkgo biloba 3.1.1. Khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký
Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn cú nồng độ quercetin khoảng 100 àg/ml như sau:
cân chính xác 10,0 mg quercetin dihydrat chuẩn vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml methanol, 5 ml acid hydroclorid 25% và 5 ml nước, siêu âm, bổ sung methanol đến đủ 100 ml. Lọc dung dịch chuẩn qua màng lọc 0,45 àm.
Tiêm mẫu 6 lần qua cột sắc ký với các điều kiện ghi ở mục 2.4.2.3. Kết quả diện tích pic (Spic), thời gian lưu (tR), được ghi trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra tính thích hợp của hệ thống sắc ký (n = 6) STT Spic (mAU.s) tR (phút)
1 6450 15,65
2 6475 15,74
3 6413 15,82
4 6426 15,70
5 6435 15,57
6 6491 15,58
X 6415 15,682
SD 29,8641 0,1068
RSD (%) 0,46 0,68
Nhận xét:
Điều kiện HPLC cho độ lặp lại tốt về thời gian lưu và diện tích pic, độ lệch chuẩn tương đối RSD < 2%, do vậy hệ thống sắc ký trên đảm bảo được tính thích hợp với qui trình định lượng ginkgo biloba trong chế phẩm thuốc.
3.1.2. Thẩm định quy trình định lượng 3.1.2.1. Tính đặc hiệu
35
Pha dung dịch mẫu chuẩn quercetin cú nồng độ khoảng 100 àg/ml như trờn.
Pha dung dịch mẫu thử như sau: Cân chính xác 0,200 gam nguyên liệu ginkgo biloba vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml methanol, 5 ml acid hydroclorid 25%, 5 ml nước, đem siêu âm đến tan hoàn toàn. Hỗn hợp được đun sôi cách thủy 30 phút, để nguội về nhiệt độ phòng. Bổ sung methanol cho đủ 100 ml được dung dịch có nồng độ khoảng 2000 àg cao/ml (tương ứng nồng độ quercetin khoảng 200 àg/ml). Lọc qua màng lọc 0,45 àm.
Pha mẫu trắng: 5 ml acid hydroclorid 25%, 5 ml nước, methanol vừa đủ 100 ml.
Tiêm mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử qua cột sắc ký với các điều kiện ghi ở mục 2.4.2.3 thu được sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử (phụ lục 1, 2, 3).
Kết quả:
Đối với mẫu trắng, trên sắc ký đồ không có pic nào xuất hiện trong các khoảng thời gian lưu của các chất trong cao ginkgo biloba (phụ lục 1).
Đối với mẫu chuẩn, trên sắc ký đồ cho 1 pic cân xứng với thời gian lưu 15,82 phút, là pic của quercetin (phụ lục 2).
Đối với mẫu thử, trên sắc ký đồ cho 3 pic cân xứng với thời gian lưu 15,6; 26,6 và 29,7 phút lần lượt là pic của quercetin, kaempferol và isorhamnetin (phụ lục 3).
Nhận xét:
Phương pháp có tính đặc hiệu tốt, quercetin có 1 pic ở tR= 15,6 phút, kaempferol có 1 pic ở tR= 22,6 phút, isorhamnetin có 1 pic ở tR= 29,7 phút. Do đó có thể định lượng flavonoid toàn phần trong chế phẩm thu được dựa vào tổng diện tích 3 pic quercetin, kaempferol và isorhamnetin.
3.1.2.2. Tính tuyến tính
Pha dãy dung dịch chuẩn có hàm lượng quercetin là 20, 40, 60, 80, 100, 200 àg/ml, định lượng cỏc dung dịch này bằng phương phỏp HPLC với cỏc điều kiện sắc ký ghi ở mục 2.4.2.3, kết quả diện tích pic được ghi trong bảng 3.7.
36
Bảng 3.7. Mối tương quan giữa nồng độ quercetin và Spic STT Nồng độ (àg/ ml) Spic (mAU.s)
1 20 1207
2 40 2534
3 60 3894
4 80 1741
5 100 6450
6 200 12211
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ quercetin và Spic Nhận xét:
Kết quả trên cho thấy giữa diện tích pic và nồng độ quercetin có sự phụ thuộc tuyến tớnh với nhau trong khoảng nồng độ từ 20 đến 100 àg/ml, hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1.
3.1.2.3. Độ lặp lại
Định lượng 6 lần mẫu chế phẩm thuốc tiêm Nerfiline trên thị trường.
37
Pha mẫu: Hút chính xác 5 ml chế phẩm Nerfiline cho vào bình định mức 25 ml, thêm 5 ml methanol, 5 ml acid hydroclorid 25%, 5 ml nước, siêu âm 10 phút rồi đun cách thủy sôi 30 phút thấy dung dịch chuyển màu vàng sậm. Bổ sung thêm methanol đủ 25 ml. Lọc dung dịch mẫu thử qua màng lọc 0,45 àm.
Với mỗi mẫu chế phẩm, tiến hành định lượng với 3 lần tiêm mẫu thu được sắc ký đồ của chế phẩm Nerfiline. Tổng diện tích 3 pic quercetin, kaempferol, isorhamnetin gọi là diện tích pic flavonoid glycosid (Sflavonoid glycosid ) của mỗi lần tiêm mẫu. Kết quả trong bảng 3.8 là giá trị diện tích pic flavonoid glycosid tính trung bình thu được từ 3 lần tiêm mẫu.
Bảng 3.8. Bảng kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp (n = 6)
STT Sflavonoid glycosid trung bình
(mAU.s)
1 4289
2 4354
3 4333
4 4297
5 4400
6 4376
X 4341,5
SD 43,76643
RSD (%) 1,01%
Nhận xét:Phương pháp cho độ lặp lại tốt với độ lệch chuẩn tương đối RSD < 2%.
3.1.2.4. Độ đúng
Dùng 9 mẫu thử có nồng độ quercetin đã xác định ở phần độ lặp lại, thêm vào chất chuẩn quercetin dihydrat: 3 mẫu đầu thêm 80%, 3 mẫu tiếp theo thêm 100%, 3 mẫu còn lại thêm 120% so với nồng độ đã có trong mẫu thử. Tiến hành tiêm mẫu vào hệ thống HPLC với các điều kiện ghi ở mục 2.4.2.3. Từ diện tích pic, xác định hàm
38
lượng quercetin, tính tỷ lệ thu hồi (% lượng chất chuẩn tìm thấy được sau khi thêm vào dung dịch thử). Kết quả được thể hiện trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Bảng kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp (n=3)
Tỷ lệ chuẩn
thêm
Hàm lƣợng quercetin trong mẫu
(àg/ml)
Lƣợng chất chuẩn
thờm (àg/ml) Tỷ lệ thu hồi (%)
Trung bình (%) Thêm Tìm thấy
80%
36,54 29,23 29,12 100,30
99,63
36,54 29,23 29,07 100,18
36,54 29,23 29,18 100,45
100%
36,54 36,54 36,62 101,24
100,10
36,54 36,54 36,53 101,06
36,54 36,54 36,58 101,16
120%
36,54 43,85 43,61 99,35
99,57
36,54 43,85 43,71 99,52
36,54 43,85 43,66 99,43
Nhận xét:
Phương pháp cho độ lặp lại tốt RSD < 2%. Kết quả thu được cho thấy tỷ lệ % tìm lại chất chuẩn đều nằm trong giới hạn cho phép (98 – 102%)