Nội dung nghiên cứu

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3. Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng phương pháp định lượng các thành phần chính flavonoid glycosid của cao Ginkgo biloba trong chế phẩm.

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong xây dựng công thức thuốc tiêm ginkgo biloba.

- Tối ưu hóa công thức thuốc tiêm ginkgo biloba.

28

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình bào chế thuốc tiêm ginkgo biloba với công thức tối ưu.

- Dự thảo tiêu chuẩn thành phẩm thuốc tiêm ginkgo biloba.

- Theo dõi độ ổn định của thuốc tiêm pha theo công thức tối ưu và dự đoán tuổi thọ của thuốc.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp bào chế thuốc tiêm ginkgo biloba Các mẫu thuốc tiêm được pha theo các bước sau:

- Hòa tan cao ginkgo bilobavà các tá dược trong dung môi.

- Điều chỉnh pH (nếu cần thiết).

- Thêm nước vừa đủ.

- Thêm nước đến đủ thể tích cần pha. Khuấy đều.

- Lọc qua màng lọc 0,45àm hoặc 0,2 àm.

- Đóng lọ thủy tinh không màu 10 ml, đậy nút cao su, xiết nắp nhômhoặc đóng ống thủy tinh 2 ml* bằng máy đóng ống ROTA(có hoặc không sục nitrogen).

* Do điều kiện thực nghiệm không có ống thủy tinh 5 ml nên đề tài tiến hành đóng trên ống thủy tinh màu hổ phách 2 ml.

2.4.2. Phương pháp đánh giá chất lượng thuốc tiêm ginkgo biloba 2.4.2.1. Đánh giá cảm quan

Phương pháp đánh giá cảm quan: đưa ống/lọ thuốc tiêm lên soi dưới ánh đèn trắng để kiểm tra độ trong và màu sắc của dung dịch thuốc tiêm vừa pha.

2.4.2.2. Đánh giá pH

Đo pH của dung dịch thuốc tiêm ginkgo biloba bằng máy đo pH. Chênh lệch giá trị pH được kí hiệu là ΔpH, là hiệu của giá trị pH ban đầu trừ giá trị pH sau bảo quản, trong đó:

- Giá trị pH ban đầu: là giá trị pH của dung dịch thuốc tiêm ban đầu ngay sau khi pha.

29

- Giá trị pH sau bảo quản: là giá trị pH của dung dịch thuốc tiêm sau khoảng thời gian bảo quản và điều kiện bảo quản nhất định.

2.4.2.3. Phương pháp định lượng flavonoid glycosid

Định lượng thành phần flavonoid glycosid của caoginkgo biloba trong thuốc tiêm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), cụ thể nhưsau:

Dung dịch thử: Hút chính xác 20 ml dung dịch thuốc tiêm ginkgo biloba, cho vào bình định mức100 ml. Thêm 20 ml methanol, 15 ml dung dịch acid hydrocloric loãng và 5 ml nước, đóng nút kín và đun cách thủy trong 60 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm methanol vừa đủ thể tích 100ml.

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 10,0 mg quercetin dihydrat trong 20 ml methanol trong bình định mức 100 ml, thêm 15 ml acid hydrocloric loãng và 5 ml nước, bổ sung methanol đến đủ thể tích 100 ml.

Tiến hành sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC với điều kiện như sau:

- Cột C18 (chiều dài 0,125 m, đường kớnh 4 mm), kớch thước hạt nhồi 5 àm;

- Chạy sắc ký với hệ dung môi pha động là Methanol: Acid phosphoric 0,5%

(52:48)

- Tốc độ dòng 1,0 ml/phút; detector UV 370 nm.

- Thể tớch tiờm mẫu thử và mẫu chuẩn 20 àl.

Công thức tính hàm lượng flavonoid trong cao Ginkgo biloba:

t c c t

C S

p C

ml S mg

X 





  2 , 514 )

/ (

Trong đó:

 Sc: Diện tích pic Quercetin dung dịch chuẩn

 St: Tổng diện tích pic Quercetin, kaempferol, isorhamnetin.

 Cc: Nồng độ dung dịch chuẩn (mg/ml).

 Ct: Nồng độ dung dịch thử (mg/ml).

 p: hàm lượng quercetin trong quercetin dihydrat

 2,514: Hệ số chuyển đổi từ Quercetin sang flavonoid glycosid

30

2.4.3. Phương pháp khảo sát khả năng hòa tan cao ginkgo biloba trong dung môi

Do hạn chế về điều kiện định lượng cao ginkgo biloba (tốn kém dung môi, thời gian định lượng kéo dài) nên nghiên cứu xác định sơ bộ khả năng hòa tan của dung môi và độ ổn định của cao ginkgo biloba trong một số dung môi nghiên cứu gồm nước cất pha tiêm, ethanol, PG, PEG 400, glycerin, 2-pyrolidon và hỗn hợp các dung môi ở nồng độ thuốc tiêm 0,35% cao ginkgo biloba.

Trong dung môi:

- Cân chính xác 0,35 gam cao ginkgo biloba cho vào bình nón, thêm 100 ml dung môi nghiên cứu.

- Đem siêu âm 15 phút.

- Lọc qua màng lọc 0,45 àm.

- Quan sát hiện tượng dưới ánh đèn và kết luận sơ bộ khả năng tan của cao ginkgo biloba trong các dung môi.

Trong hỗn hợp dung môi:

- Tiến hành tương tự như trên, thay dung môi đơn lẻ bằng hỗn hợp dung môi với các tỷ lệ cần khảo sát.

- Theo dõi cảm quan và tiến hành định lượng hàm lượng flavonoid glycosid còn lại sau thời gian bảo quản để rút ra kết luận.

2.4.4. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong xây dựng công thức và phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình bào chế thuốc tiêm ginkgo biloba.

2.4.4.1. Nguyên tắc chung

- Pha các mẫu có thành phần là cao ginkgo biloba 0,35% và các thành phần khác - Đặt mẫu trong các điều kiện môi trường cần theo dõi bao gồm:

 Đun sôi 8 giờ: luộc sôi mẫu trong 8 giờ

31

 Ánh sáng: đặt mẫu trong điều kiện thực, không tránh ánh sáng hoặc phơi ngoài nắng trong thời gian cần theo dõi.

 Điều kiện lão hóa cấp tốc: nhiệt độ 40±2oC, độ ẩm 75%, thời gian 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng ...

 Điều kiện thực: đặt mẫu trong điều kiện phòng, không cố định nhiệt độ và độ ẩm, không tránh sáng, không phơi ngoài nắng.

- Đánh giá mẫu sau thời gian bảo quản ở các điều kiện khác nhau nhờ chỉ tiêu:

 Cảm quan: độ trong, màu sắc.

 Độ biến thiên pH (kí hiệu ΔpH).

 Định lượng hàm lượng flavonoid sau thời gian bảo quản.

- Từ các kết quả so sánh rút ra kết luận về việc sử dụng thành phần tá dược trong công thức và lựa chọn các yếu tố đầu vào để tối ưu hóa.

2.4.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng trong xây dựng công thức - Ảnh hưởng của dung môi và hệ dung môi.

- Ảnh hưởng của giá trị pH và loại hệ đệm.

- Ảnh hưởng của chất chống oxy hóa.

- Ảnh hưởng của các loại đường.

2.4.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình bào chế thuốc tiêm - Ảnh hưởng của bao bì.

- Ảnh hưởng của sục khí nitrogen.

- Ảnh hưởng của chất bảo quản.

- Ảnh hưởng của phương pháp tiệt khuẩn.

2.4.5. Phương pháp thiết kế công thức

Dùng phần mềm MODDE 9.0 để thiết kế thí nghiệm phục vụ mục tiêu xây dựng và tối ưu hóa công thức.

32 Các biến đầu ra:

STT Biến Ký hiệu Đơn vị Mục tiêu

1 Hàm lượng flavonoid Y1 % Max

2 ΔpH Y2 Min

Các biến đầu vào: Dựa vào kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong xây dựng công thức thuốc tiêm ginkgo biloba, lựa chọn 4 yếu tố đầu ra để thiết kế thí nghiệm tối ưu. Các biến đầu vào có thể có: dung môi pha thuốc tiêm, giá trị pH, hệ đệm, nồng độ đệm, chất chống oxy hóa, nồng độ chất chống oxy hóa, loại đường làm tăng độ ổn định, nồng độ đường sử dụng ...

2.4.6. Phương pháp phân tích, xử lý số liệu

- Sử dụng phương pháp thiết kế mặt hợp tử tại tâm với sự trợ giúp của phần mềm MODDE 9.0 để thiết kế thí nghiệm.

- Tối ưu hóa công thức dựa trên mạng thần kinh nhân tạo với sự trợ giúp của phần mềm FormRules v2.0, INForm v3.1.

- Các thông số được phân tích là độ biến thiên ΔpH và hàm lượng flavonoid glycosid còn lại. Sử dụng công cụ Excel để tính toán các thông số này.

2.4.7. Phương pháp nghiên cứu độ ổn định và dự đoán tuổi thọ của dung dịch thuốc tiêm ginkgo biloba

 Mẫu nghiên cứu

Thuốc tiêm pha theo công thức tối ưu, đóng ống thủy tinh màu hổ phách và theo dõi độ ổn định trong các điều kiện bảo quản khác nhau.

 Điều kiện bảo quản

- Điều kiện thực: nhiệt độ phòng, không tránh ánh sáng.

- Điều kiện lão hóa cấp tốc:

 Trong tủ vi khí hậu duy trì nhiệt độ 40 ± 2oC.

 Trong tủ sấy duy trì nhiệt độ 50 ± 2oC.

 Phương pháp phân tích

33

Đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm nghiên cứu dựa trên các tiêu chí sau:

- Tính chất: Độ trong và màu sắc dung dịch.

- pH dung dịch: xác định pH của dung dịch sau khi pha chế và dung dịch sau thời gian bảo quản bằng máy đo pH.

- Hàm lượng dược chất: xác định hàm lượng dược chất trong dung dịch mới pha (coi hàm lượng ban đầu là 100%), hàm lượng dược chất còn lại (%) trong các mẫu nghiên cứu sau thời gian bảo quản được xác định theo công thức:

X x 100%

X: hàm lượng dược chất còn lại (%).

: hàm lượng dược chất khi mới pha chế.

: hàm lượng dược chất sau thời gian bảo quản.

34