- Phịng thí nghiệm chuyên sâu, Trường Đại học Cần thơ Viện kiểm nghiệm TP HCM.
2.2.4.3. Các thử nghiệm về tính kích ứng da [102]
Thử tính kích ứng da của Thử tính kích ứng da của Thử tính kích ứng da của
Thử tính kích ứng da của ho ho ho hoạt chất tái sinh mơ và tinh dầu tràm
Dùng phương pháp thử tính kích ứng của dầu thực vật đối với da được áp dụng trong chuyên đề Các phương pháp thử nghiệm sinh học in vivo qui định trong USP 28.[102]
Dùng 3 thỏ thử nghiệm, tiêm trong da HCTSM với liều 200 µl vào mỗi vị trí, mỗi thỏ tiêm 10 vị trí. Quan sát vị trí tiêm sau 24 giờ; 48 giờ; 72 giờ, HCTSM được xem là khơng gây kích ứng phải đạt các tiêu chuẩn trên tổng số 30 vết chích ở 3 thỏ như sau:
• Ban đỏ (erythema): khơng được quá 3 vị trí. • Phù (edema): khơng được quá 6 vị trí.
Khơng được cĩ vị trí nào cĩ những phản ứng trên da rộng quá 10 mm.
Thử tính kích ứng da của màng BC tinh chế
Dùng phương pháp thử tính kích ứng của các loại màng đối với da được áp dụng trong chuyên đề Các phương pháp thử nghiệm sinh học in vivo qui định trong USP 28.[102]
Thử tính kích ứng của màng BC bằng cách tiêm trong da thỏ những mẫu dịch chiết từ màng BC. Dùng 3 dung môi chiết là nước muối sinh lý 0,9 %,
59
polyethylen glycol 400, dầu thực vật (dầu oliu đã được chứng minh không gây kích ứng).
Tiến hành
- Chuẩn bị thỏ: thỏ trắng, mắt đỏ, phái tính ngẫu nhiên. Nếu là thỏ cái thì không được mang thai. Thỏ khỏe mạnh, nặng trên 2 kg. Da thỏ không bị tổn thương và không tiếp xúc với bất kỳ hoá chất nào. Trước ngày thử nghiệm, lông thỏ được cạo sạch ở vùng lưng, hai bên cột sống của thỏ, không làm bị thương
thỏ. Thử nghiệm trên 6 thỏ.
- Chuẩn bị mẫu chiết: lấy mẫu màng BC sau khi đã tinh chế, kích thước 10 cm x10 cm, cắt thành những mảnh nhỏ kích thước 0,5 cm x 0,5 cm. Cho vào trong lọ thủy tinh trung tính 100 ml. Thêm vào khoảng 70 ml nước cất hai lần. Lắc mạnh trong khoảng 30 giây. Đổ nước ra và lập lại bước này một lần nữa. Sấy khơ mẫu. Cho mẫu vào trong lọ thủy tinh và thêm 40 ml dung mơi dùng để chiết. Chiết bằng cách dùng nhiệt ẩm trong nồi hấp autoclave ở 121 oC trong 60 phút. Chuẩn bị song song một mẫu chứng để đối chứng. Mẫu chứng là các dung mơi kể trên (khơng cĩ màng BC).
Sau đĩ để nguội đến nhiệt độ phịng, khơng để dưới 20 oC. Lắc mạnh trong vài phút. Gạn dịch chiết ngay vào một lọ sạch vơ khuẩn. Bảo quản dịch chiết trong khoảng nhiệt độ 20 oC - 30 oC. Khơng sử dụng dịch chiết này sau 24 giờ. Tiến hành tương tự với những dung mơi chiết kể trên.
- Tiêm trong da thỏ: trước khi tiêm, lắc mạnh dịch chiết để đảm bảo các thành phần trong dịch chiết được phân tán đều. Thỏ đã được cạo sạch lơng, nếu cần cĩ thể lau sạch da thỏ bằng cồn lỗng, đợi cho da thỏ khơ.
Mỗi mẫu chiết được thử trên 2 thỏ. Mỗi con được tiêm trong da một bên là mẫu chứng và một bên là mẫu thử. Mỗi bên lưng thỏđược tiêm 5 nốt, mỗi nốt 200 µl. Kiểm tra vết tiêm, theo dõi kĩ sự xuất hiện của các phản ứng kích ứng như nổi ban đỏ, phù nề hoặc hoại tử nếu cĩ. Theo dõi vết tiêm trong 72 giờ, tránh chạm vào vết tiêm và ghi lại kết quả vào các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi tiêm.
60
Ghi nhận kết quả: đọc kết quả 2 loại mức độ kích ứng theo chuyên đề này của USP.
Sau 72 giờ, mỗi mẫu sẽ cĩ 12 kết quả: 2 thỏở 3 thời điểm, lấy kết quả nhân 2 (2 loại mức độ ban và phù). Lấy kết quả trung bình của mẫu thử cũng như mẫu chứng. So sánh hai kết quả trung bình này với nhau. Kết quả được kết luận là khơng kích ứng khi hiệu số kết quả trung bình của mẫu thử so với mẫu chứng nhỏ hơn hoặc bằng 1. Nếu ở bất kỳ thời điểm nào của quá trình theo dõi, thấy nghi ngờ mẫu thử cho phản ứng kích ứng mạnh hơn mẫu chứng thì lập lại thử nghiệm trên với 3 con thỏ khác. Kết quả khơng kích ứng khi hiệu số kết quả trung bình của mẫu thử so với mẫu chứng trên 3 thỏ nhỏ hơn hoặc bằng 1.(Phụ lục 1c)
Thử tính kích ứng da của màng Acetul
Thử kích ứng trên da là một phương pháp sinh học dựa vào mức độ phản ứng của da thỏ với vật liệu thử so với phần da kế bên khơng đắp vật liệu thử. Tiến hành theo phương pháp thử kích ứng trên da áp dụng cho các sản phẩm dùng trong y tế và mỹ phẩm theo Quyết định số 3113/ 1999/ QĐ-BYT ngày 11 tháng 10 năm 1999 của Bộ Y tế.
Thú thử nghiệm và điều kiện thí nghiệm: sử dụng thỏ trắng trưởng thành, đực hoặc cái (khơng sử dụng thỏ cĩ thai hoặc đang cho con bú), khoẻ mạnh, cân nặng khơng dưới 2 kg. Thỏđược nhốt riêng từng con và nuơi dưỡng trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thử. Trước ngày thí nghiệm, làm sạch lơng thỏ ở vùng lưng đều về hai bên cột sống một khoảng đủ rộng để đặt các mẫu thử là màng Acetul (khoảng 10 cm x 15 cm). Chỉ những thỏ cĩ da khoẻ mạnh, đồng đều và lành lặn mới được dùng vào thí nghiệm. Thí nghiệm tiến hành trên 3 thỏ. Đặt màng Acetul cĩ kích thước 2,5 cm x 2,5 cm lên vùng da thỏđã được cạo lơng 24 giờ trước đĩ. Cố định miếng màng bằng băng dính khơng gây kích ứng trong 4 giờ. Sau đĩ bỏ màng và băng dính, làm sạch vùng da bằng dung mơi thích hợp khơng gây kích ứng.
61
Quan sát và ghi điểm: quan sát và ghi điểm phản ứng trên chỗ da đặt màng Acetul so với da kề bên khơng đặt màng ở các thời điểm 1 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi làm sạch mẫu thử.
Đánh giá phản ứng trên da ở các mức độ gây ban đỏ, phù nề theo quy định.
Đánh giá kết quả: trên mỗi thỏ, điểm phản ứng được tính ở 2 mức độ ban đỏ và phù nề chia cho số lần quan sát. Điểm kích ứng của mẫu thử được lấy trung bình điểm phản ứng của các thỏ đã thử. Chỉ sử dụng các điểm ở những thời gian quan sát ở 24 giờ, 48 giờ, 72 giờđể tính kết quả. Đối chiếu điểm kích ứng ở các mức độ quy định để xác định khả năng gây kích ứng trên da thỏ của mẫu thử. (Phụ lục 1b)