TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ PHÊ ROBUSTA
1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố
Cà phê thuộc họ Rubiaceae, chi Coffea, hiện nay cà phê đƣợc trồng phân bố rải rác khắp các vùng nhiệt đới, đại diện có 3 loài chính sau:
Cà phê chè (Coffea arabica) có nguồn gốc từ cao nguyên phía tây nam Ethiopia và đã được du nhập vào Ấn Độ Vào năm 1710, cây cà phê chè được trồng tại đảo Java, sau đó lan rộng sang vùng Caribê và Nam Mỹ Hiện nay, cà phê chè được trồng phổ biến ở nhiều khu vực như châu Mỹ La Tinh, Trung Phi, Ấn Độ, Indonesia, Philippines, Thái Lan và Việt Nam.
Cà phê vối (Coffea canephora) có nguồn gốc từ vùng rừng xích đạo châu Phi, trải dài từ Guinea đến Uganda Loại cà phê này đã được thuần hóa và trồng phổ biến ở châu Phi Đến năm 1900, cà phê vối được du nhập vào Java và sau đó lan rộng sang nhiều quốc gia khác Hiện nay, Indonesia là quốc gia trồng cà phê vối nhiều nhất, tiếp theo là Việt Nam.
Cà phê mít (Coffea liberica) có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Trung và Tây Phi, được trồng lần đầu tiên ở Liberia vào năm 1792 Từ năm 1872 đến 1875, cây cà phê này đã được du nhập vào Indonesia Hiện nay, cà phê mít được trồng ở nhiều quốc gia, bao gồm cả Việt Nam, mặc dù sản lượng vẫn còn hạn chế.
Cà phê robusta, với tên khoa học là Coffea canephora hay Coffea robusta, thường được gọi là cà phê vối, thuộc họ Thiên Thảo Đặc điểm thực vật của cây cà phê này được trình bày chi tiết trong bảng 1.1 dưới đây.
Bảng 1.1 Đặc điểm thực vật về cây caffeine
Giới (Kingdom) Plantae (Thực vật) Ngành (Division) Magnoliophyta
Cà phê là cây nhiệt đới ưa sáng, thích hợp với khí hậu nóng ẩm, có chiều cao từ 5 đến 6 mét với thân cành hình trụ và tán rộng Lá cây có hình bầu dục hoặc hình trứng, dài 10 – 15 cm và rộng 5 – 6 cm, với mặt trên xanh sẫm và mặt dưới nhạt hơn Cà phê bắt đầu ra hoa sau 3 năm sinh trưởng, hoa màu trắng mọc thành chùm ở kẽ lá, mỗi hoa có 5 cánh đều Quả cà phê có hình bầu dục hoặc tròn, đường kính từ 10 đến 13 mm, bên trong chứa hai nhân, đôi khi có một nhân dẹt, quả non màu xanh và khi chín chuyển sang màu vàng đến đỏ sẫm.
Hình 1.1: Cà phê Robusta ( Coffea canephora) 1.2 Thành phần hóa học
Hạt cà phê chứa một số chất điển hình:
Glucid: có 5 – 8% đường khử và saccharose, ít mantol, polysaccharid,… Không có tinh bột
Acid hữu cơ: oxalic acid, citric acid, malic acid
Quả cà phê tươi có tác dụng hạ sốt và lợi tiểu, trong khi hạt cà phê rang là một thức uống có khả năng kích thích Caffeine, thành phần chính trong hạt cà phê, có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, đồng thời cũng giúp lợi tiểu và làm giãn cơ trơn (Đỗ Huy Bích, 2006).
1.4 Nghiên cứu về thành phần hóa học đối với hạt cà phê
Các nghiên cứu trong nước
Nghiên cứu của Nguyễn Phương Quyên và các cộng sự năm 2015 chỉ ra rằng các hợp chất như caffeine, flavonoid, axit gallic, catechin, axit caffeic, vanillin và axit chlorogenic có tiềm năng ứng dụng trong y học.
Các nghiên cứu ngoài nước
Năm 2012 Abdul Munahb A G Nasser đã cô lập chlorogenic acid từ hạt cà phê bằng phương pháp sắt ý cột C18
Năm 2014, tác giả Nuhu AA đã tiến hành nghiên cứu để cô lập một số hợp chất tiêu biểu từ hạt cà phê, bao gồm caffeine, acid chlorogenic, diterpen và trigonelline, với ứng dụng tiềm năng trong y học.
TỔNG QUAN VỀ CAFFEINE
Caffeine, có tên IUPAC là 1,3,7-Trimethylpurine-2,6-dione và công thức hóa học C8H10N4O2, thuộc nhóm methylxanthine, tồn tại dưới dạng tinh thể không màu, không mùi và có vị đắng Chất này hòa tan trong nước và các dung môi hữu cơ như methanol và chloroform, là một chất kích thích tự nhiên có nhiều trong lá chè, hạt cà phê, hạt coca và nhiều thực vật khác Caffeine kích thích hệ thần kinh trung ương, giúp tinh thần minh mẫn, tăng cường nhận thức và kích thích hoạt động của tim, thận, phổi, và đã được ứng dụng rộng rãi trong dược phẩm.
Caffeine là một hợp chất tinh khiết có dạng tinh thể, không màu, không mùi và có vị đắng Nó có nhiệt độ nóng chảy khoảng 235 độ C và có khả năng tan một ít trong nước ở nhiệt độ bình thường, nhưng tan nhiều hơn trong nước nóng hoặc trong chloroform.
2.2 Hoạt tính sinh học Đối với hệ thần kinh trung ƣơng caffeine có tác dụng mạnh nhất trong các methylxanthine Sẽ tạo cho người dùng cảm giác ít mệt mỏi và tỉnh táo, đôi khi với liều lượng lớn có thể khiến người dùng rơi vào trạng thái bồn chồn lo lắng, mất ngủ Đối với tim mạch, caffeine có tác dụng kích thích tim làm nhịp tim nhanh hơn, huyết áp tăng nhẹ Đối với co cơ trơn, caffeine có tác dụng làm giản cơ trơn, tác dụng này ứng dụng trong y học giúp điều trị cho các bệnh nhân co thắt Đối với cơ vân, caffeine có tác dụng tăng cường khả năng làm việc của cơ bắp ở người (Đỗ Huy Bích, 2006)
Cơ chế hoạt động của caffeine đối với cơ thể:
Caffeine có tác dụng tiềm tàng ở cấp độ tế bào thông qua ba cơ chế chính: đối kháng với các thụ thể adenosine, đặc biệt trong hệ thống thần kinh trung ương; huy động canxi nội bào từ kho dự trữ; và ức chế enzyme phosphodiesterase.
Sự đối kháng của Adenosine:
Caffeine ức chế các thụ thể adenosine A1, A2A và A2B, dẫn đến việc kích thích giải phóng dopamine, noradrenalin và glutamate Mặc dù caffeine có thể làm giảm lưu lượng máu não và máu cơ tim, nhưng nó cũng hạn chế sự giãn mạch thông qua việc tác động lên các thụ thể adenosine, đặc biệt là ở vỏ não, nơi có nồng độ cao nhất của các thụ thể này.
Huy động Canxi nội bào
Caffeine kích thích giải phóng canxi từ mạng lưới sarcoplasmic và ức chế tái hấp thu, dẫn đến việc tăng khả năng co bóp trong các cơn co thắt dưới mức tối đa ở người dùng Canxi nội bào đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt nitric oxide synthase nội mô (eNOS), từ đó tăng cường sản xuất oxit nitric Những tác động của caffeine được điều hòa bởi chức năng thần kinh cơ, góp phần tăng lực co bóp trong cơ xương Tuy nhiên, caffeine cũng có tác dụng lợi tiểu, có thể gây ảnh hưởng tiêu cực đến hiệu suất của các vận động viên sức bền trong quá trình tập luyện và thi đấu kéo dài.
Tác dụng lên hệ thần kinh trung ƣơng
Caffeine không chỉ tăng cường sự tỉnh táo mà còn có thể gây lo âu, đặc biệt khi sử dụng với liều cao Ngoài ra, việc đối kháng với thụ thể A1 và A2 có thể dẫn đến co giật và co mạch máu não.
Sản phẩm có chứa caffein
Caffeine is commonly included in cold and flu medications, antipyretics, and analgesics due to its ability to enhance intestinal absorption and counteract drowsiness.
Ví dụ: thuốc Extra-strength Excedrin có chứa 250 mg acetaminophen tức hoạt chất paracetamol, 250 mg aspirin, and 65 mg caffeine
Caffeine là một thành phần phổ biến trong chế độ ăn uống, chủ yếu từ cà phê, nhưng cũng có trong các đồ uống như ca cao, nước ngọt, nước tăng lực, thuốc men và thực phẩm bổ sung thể thao Kể từ khi Red Bull ra mắt vào năm 1987 tại Áo và 1997 tại Mỹ, thị trường nước tăng lực đã phát triển mạnh mẽ với nhiều nhãn hiệu cung cấp hàm lượng caffeine từ 50 mg đến 500 mg mỗi lon hoặc chai Quy định về nước tăng lực, bao gồm ghi nhãn và mức caffeine tối đa cho phép, rất phức tạp ở nhiều quốc gia, trong đó Mỹ có quy định lỏng lẻo nhất.
Trong 13 năm qua, nhằm hạn chế hiện tượng tiêu thụ đồ uống không chứa caffeine tự nhiên, các quy định đã được thiết lập với những giới hạn cụ thể cho các sản phẩm này, bao gồm cả những đồ uống được bổ sung caffeine từ nguồn tự nhiên hoặc tổng hợp.
TỔNG QUAN VỀ ACID CHLOROGENIC
Trọng lƣợng phân tử: 354,31 g/mol
Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: acid 3R-[[3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-oxo-2- propenyl]oxy]-1S,4R,5R-trihydroxy-cyclohexanecarboxylic
Chlorogenic acid là một hợp chất có dạng bột màu trắng hoặc hơi ngà vàng, có khả năng hòa tan trong nước cũng như các dung môi hữu cơ như ethanol và methanol.
Chlorogenic acid có khả năng kháng virus B trong mô hình vịt và kháng virus cúm H1N1, đồng thời có hoạt động chống HIV, kháng khuẩn và kháng nấm Phương pháp thu nhận chlorogenic acid từ hạt cà phê chủ yếu sử dụng chiết lỏng với dung môi chloroform và chiết pha rắn, nhưng một số nghiên cứu cũng áp dụng hỗn hợp dung môi ethanol và nước với tỉ lệ 1:1 (Nuhu, 2014).
Xơ vữa động mạch là nguyên nhân chính gây tử vong và là yếu tố quan trọng trong các bệnh tim mạch, trong đó rối loạn mỡ máu là yếu tố nguy cơ cao Phương pháp điều trị phổ biến hiện nay là sử dụng statin để giảm nồng độ lipid huyết tương, nhưng chỉ ngăn ngừa được 50% đến 60% rủi ro tim mạch Vì vậy, để điều trị triệt để xơ vữa động mạch, cần mở rộng ứng dụng các phương pháp khác, trong đó có chlorogenic acid, được công nhận có hoạt động chống xơ vữa.
Chlorogenic acid có khả năng chống oxy hóa và chống viêm, đồng thời có tiềm năng trong việc giảm cholesterol và ngăn ngừa xơ vữa động mạch Mặc dù các nghiên cứu về tác động của chlorogenic acid đối với chứng xơ vữa động mạch còn hạn chế, nhưng những báo cáo sơ bộ cho thấy nó có thể làm giảm sự phát triển xơ vữa động mạch ở chuột thí nghiệm được cho ăn chế độ ăn giàu cholesterol Tác dụng và tiềm năng của chlorogenic acid trong việc cải thiện sức khỏe tim mạch đang được mở rộng nghiên cứu.
TỔNG QUAN VỀ CHOLESTEROL VÀ KHẢ NĂNG GIẢM
Cholesterol là một loại chất béo steroid có mặt trong màng tế bào của tất cả các mô trong cơ thể, đặc biệt là ở các mô thần kinh, sỏi mật và thể vàng của buồng trứng Hầu hết cholesterol được tổng hợp trong cơ thể thay vì từ thực phẩm Nó được vận chuyển trong huyết tương của động vật và được đào thải qua đường ruột nhờ tác động của vi khuẩn, tạo ra coprosterol.
Hình 1.4: Công thức cấu tạo cholesterol
Cholesterol có mặt với nồng độ cao ở các mô như gan, tủy sống, não và mảng xơ vữa động mạch, đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh hóa Tuy nhiên, nồng độ cholesterol trong máu cao, hay còn gọi là mỡ máu cao, là nguyên nhân chính gây xơ vữa động mạch Các mảng xơ vữa làm hẹp động mạch cung cấp máu cho các cơ quan, bao gồm cả động mạch vành của tim Khi động mạch vành bị hẹp, lượng máu cung cấp cho cơ tim giảm, dẫn đến cơn đau thắt ngực, và nếu tình trạng thiếu máu nghiêm trọng, có thể gây ra nhồi máu cơ tim.
Có hai loại cholesterol là LDL và HDL Hai loại này chỉ phân biệt đƣợc nhờ tỉ trọng khác nhau
- LDL (Low Density Lipoprotein) xuất phát từ gan, vận chuyển cholesterol đến tế bào để tạo năng lƣợng (là cholesterol xấu)
- HDL (High Density Lipoprotein) có chức năng ngƣợc lại, vận chuyển cholesterol từ tế bào vào gan để tái biến dƣỡng (là cholesterol tốt)
Cơ chế điều hòa lƣợng cholesterol trong máu:
Gan có các thụ thể giúp điều chỉnh lượng cholesterol trong máu bằng cách nhận biết nồng độ cholesterol từ máu và thực phẩm Khi lượng cholesterol từ thực phẩm đủ, cơ thể sẽ ngừng sản xuất cholesterol Ngược lại, nếu nồng độ cholesterol trong máu cao, quá trình chuyển hóa và đào thải cholesterol sẽ gia tăng.
Khi mức cholesterol trong cơ thể tăng cao, gan sẽ sản xuất nhiều thụ thể hơn để tiếp nhận lipoprotein nặng (HDL), giúp vận chuyển cholesterol từ các cơ quan về gan Ngược lại, khi cholesterol thiếu hụt, gan sẽ gia tăng sản xuất lipoprotein nhẹ để đưa cholesterol đến các cơ quan cần thiết.
Lượng cholesterol thừa trong máu sẽ bị các thực bào macrocyte trên thành động mạch bắt giữ, dẫn đến sự hình thành xơ vữa Hậu quả của quá trình này là gây ra các vấn đề về sức khỏe tim mạch.
• Xơ vữa động mạch tim dẫn đến cơn đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim
• Xơ vữa động mạch não dẫn đến tai biến mạch máu não
Chlorogenic acid có khả năng ức chế sự hình thành huyết khối động mạch.
TỔNG QUAN VỀ TRỰC KHUẨN ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH
Trực khuẩn Escherichia Coli: Vi khuẩn E.coli thuộc nhóm vi trùng đường ruột
Enterobacteriaceae, có nhiều trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc
Trong đường ruột, chúng hiện diện nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng
Vi khuẩn E.coli nhiễm vào đất, nước… từ phân của động vật Chúng trở nên gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của chúng
Vi khuẩn gram âm có hình dạng trực khuẩn, di động nhờ tiêm mao xung quanh tế bào và không tạo bào tử Những loại vi khuẩn có độc lực thường có capsul, trong khi những loại không có độc lực thì không có capsul Kích thước trung bình của chúng khoảng 0,5 x 1-3 micromet, với hai đầu tròn Một số dòng vi khuẩn còn có lông bám (pili) để tăng cường khả năng bám dính.
- Đặc điểm nuôi cấy và sinh hóa: Là loại hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp 370C nhƣng có thể mọc trên 400C, pH 7,4
+ Trên môi trường thạch dinh dưỡng NA , Trên thạch máu, Trên môi trường chẩn đoán chuyên biệt EMB (Eozin Methyl Blue) ,Trên môi trường
Rapid’ E.coli,Trên môi trường Macconkey, Endo,Trên các môi trường đường
- Các phản ứng sinh hóa: Indol dương tính, Methyl Red (phản ứng
MR) dương tính, Voges-Proskauer (phản ứng VP) âm tính và Citrat âm tính, H2S âm tính, hoàn nguyên nitrat thành nitrit, Lysine decarboxylaza dương tính
- Đặc điểm kháng nguyên và độc tố :
Gồm 4 loại kháng nguyên: O, K, H, F và nội độc tố gây tiêu chảy, ngoại độc tố gây tan huyết và phù thủng Độc tố của E.coli: Loại E.coli có giáp mô (kháng nguyên K) gây ngộ độ mạnh hơn loại không giáp mô
Nội độc tố đường ruột được chia thành hai loại: chịu nhiệt (ST) và không chịu nhiệt (LT), cả hai đều gây ra triệu chứng tiêu chảy Các dòng E.coli sản sinh độc tố này được gọi là ETEC.
Ngộ độc thực phẩm xảy ra khi cơ thể tiếp xúc với một lượng lớn vi khuẩn và độc tố của chúng Vi khuẩn E.coli là nguyên nhân phổ biến gây tiêu chảy, thường gặp ở nhiều nhóm người.
- Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli), Nhóm ETEC
- Những dòng E.coli có cả 2 loại nội độc tố LT và ST sẽ gây ra tiêu chảy trầm trọng và kéo dài
- Gần đây người ta phát hiện chủng E.coli mới ký hiệu là E.coli O157:H7
Chủng này đã gây ra những vụ ngộ độc lớn trên thế giới trong những năm gần đây
Năm 1982, lần đầu tiên người ta ghi nhận được nguồn bệnh do E.coli
- Năm 1985, người ta nhận thấy triệu chứng hoại huyết có liên quan đến chủng O157:H7 Năm 1990, bùng nổ trận dịch từ nguồn nước nhiễm chủng
E.coli O157:H7 Năm 1996, xảy ra trận dịch khá phức tạp ở Nhật Bản do uống nước táo chưa diệt khuẩn
Escherichia coli có thể sống ở điều kiện ngoại cảnh từ vài tuần đến vài tháng, có khả năng chịu đƣợc các yếu tố lý hóa khắc nghiệt
Hóa học: các chất sát khuẩn thông thường như nước Javen 1/200, phenol 1/200 giết chết vi khuẩn sau 2-4 phút
Vật lý: Escherichia coli nhạy cảm với nhiệt độ cao Nhiệt độ 55 0 C giết vi khuẩn sau 1 giờ và 60 0 C sau 30 phút Môi trường lạnh
Escherichia coli bị phá hủy trong 2 giờ
6 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chất lượng của dược liệu phụ thuộc chủ yếu vào hàm lượng hoạt chất có trong dược liệu Hàm lượng này có thể thay đổi do nhiều yếu tố, bao gồm di truyền, điều kiện địa lý, khí hậu, cũng như quy trình trồng trọt, thu hái, phơi sấy và bảo quản.
18 xem xét vấn để thu hái Nếu thu hái dúng nguyên tắc thì hàm lƣợng hoạt chất ta mong muốn có trong dƣợc liệu sẽ đạt đƣợc tối đa
Quả cà phê robusta được thu hái trực tiếp tại rẫy, với kích thước hạt khoảng 1,2 cm, màu đỏ chín hoặc hơi ươm, cùng với mức độ trưởng thành được kiểm tra kỹ lưỡng trước khi thu hoạch Sau khi thu hoạch, quả cà phê tươi được phơi khô tự nhiên dưới ánh nắng mặt trời và sau đó tách vỏ để thu lấy hạt thô.
Khi dung môi tiếp xúc với nguyên liệu, nó thấm vào và hòa tan các chất trong tế bào, sau đó khuếch tán ra ngoài Quá trình tách chiết diễn ra qua các hiện tượng như khuếch tán, thẩm thấu và thẩm tích Trong thực nghiệm, phương pháp chiết rắn-lỏng được sử dụng phổ biến như ngấm kiệt, ngâm dầm và chiết bằng máy Soxhlet Chiết bằng cách nấu nguyên liệu với nước được gọi là nước sắc, bên cạnh đó còn có các phương pháp chiết khác như lôi cuốn bằng hơi nước và sử dụng chất lỏng siêu tới hạn.
Có nhiều phương pháp để chiết xuất hợp chất hữu cơ từ cây cỏ, chủ yếu tập trung vào hai kỹ thuật: chiết lỏng-lỏng và chiết rắn-lỏng Quá trình chiết tách sử dụng dung môi hữu cơ phù hợp, có khả năng hòa tan và tinh chế các chất cần tách, nhằm cô lập hợp chất mong muốn một cách hiệu quả.
6.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết nguyên liệu
Lựa chọn dung môi để tách chiết
Để nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái nước, thường sử dụng phương pháp chiết xuất bằng các dung môi phân cực tăng dần hoặc chiết bằng dung môi vạn năng methanol, giúp thu được hầu hết các hợp chất trong mẫu cây (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Nguyên tắc của sự tách chiết dựa trên tính chất của dung môi, trong đó dung môi không phân cực như eter dầu hỏa, hexan, heptan, benzen và toluen có khả năng hòa tan tốt các hợp chất không phân cực như alcol béo và ester béo Đồng thời, dung môi phân cực trung bình như diethyl ether và chloroform lại hiệu quả trong việc hòa tan các hợp chất có tính phân cực trung bình, bao gồm các hợp chất chứa nhóm chức eter –O–, aldehyde –CH=O, cetone –CO– và ester –COO–.
19 môi phân cực mạnh (ví dụ: metanol, ethanol,…) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh ( các hợp chất có chứa nhóm chức –OH, –COOH…) (Selvam V, 2007)
Để chiết xuất hợp chất từ cây cỏ, việc lựa chọn dung môi phù hợp là rất quan trọng Các kỹ thuật chiết tách như ngâm dầm hoặc sử dụng máy chiết Soxhlet có thể được áp dụng Sau khi quá trình chiết hoàn tất, phần bã cây cần được lọc bỏ, và dung môi có thể được thu hồi bằng bộ thu hồi dung môi hoặc máy cô quay chân không.
Khi chọn dung môi cho quá trình chiết tách, cần ưu tiên những loại dung môi có tính trung tính, không độc hại và không dễ cháy, đồng thời có khả năng hòa tan các hợp chất cần khảo sát Sau khi hoàn tất quá trình chiết tách, dung môi nên dễ dàng loại bỏ Cần tránh sử dụng các dung môi độc hại như benzen hoặc những loại dễ cháy với nhiệt độ sôi thấp như diethyl ether và cacbon tetraclorur.
Khi nhiệt độ tăng, độ nhớt của dung môi giảm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tách chiết Tuy nhiên, nhiệt độ cao có thể gây bất lợi cho các hợp chất bền nhiệt như alkaloid, vitamin và glycosid, dẫn đến biến đổi hoặc mất tính chất hóa học Ngoài ra, nhiệt độ cao làm tăng độ tan của cả hoạt chất và tạp chất, khiến dịch chiết thu được chứa nhiều tạp chất như gôm và chất nhầy Sự tăng nhiệt cũng làm cho một số chất trong nguyên liệu bị trương nở, tinh bột bị hồ hóa, từ đó làm tăng độ nhớt của dịch chiết và gây khó khăn cho quá trình chiết Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp, nhiệt độ cao có thể dẫn đến hao hụt dung môi và nguy cơ cháy nổ, do đó cần sử dụng thiết bị kín và có bộ phận hồi lưu dung môi.
Khi chiết xuất, các chất có phân tử lượng nhỏ như hoạt chất sẽ hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các phân tử lớn hơn như tạp chất Thời gian chiết quá ngắn sẽ không thu được hết hoạt chất, trong khi thời gian quá dài sẽ làm dịch chiết lẫn nhiều tạp chất, gây khó khăn cho quá trình tinh chế và bảo quản.
Độ mịn của nguyên liệu
Kích thước nguyên liệu cây thô ảnh hưởng đến khả năng thấm và chiết hoạt chất vào dung môi Khi nguyên liệu quá thô, dung môi khó thấm và thời gian chiết sẽ kéo dài Ngược lại, nếu nguyên liệu mịn, bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi tăng lên, làm tăng lượng chất khuếch tán và rút ngắn thời gian chiết.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU
Hạt cà phê robusta, hay còn gọi là Coffea canephora, thuộc chi Coffea và họ Rubiaceae, được thu hái tại xã Hòa Xuân, TP.BMT, tỉnh Đăk Lắk Sau khi thu hoạch, nguyên liệu này được phơi khô và xay thành bột để sử dụng.
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa – Môi Trường thuộc Khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, địa chỉ 68 Lê Thị.
Trung, Phú Lợi, Thủ Dầu Một, Bình Dương
1.3 Hóa chất và thiết bị thí nghiệm
Acid acetic (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Trung Quốc)
Chloroform (VN Chemsol Co., Việt Nam)
Methanol (VN Chemsol Co., Việt Nam) n-Butanol (Xilong Scientific Co., Trung Quốc)
NH 3 (Xilong Scientific Co., Trung Quốc)
Petroleum ether (VN Chemsol Co., Việt Nam)
Acetone (VN Chemsol Co., Việt Nam)
Amoniac đậm đặc (Xilong Scientific Co., Trung Quốc)
Becher 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml
Bể ổn nhiệt Memmert WB7
Bộ đun khuấy từ hồi lưu Isolab (bình cầu đáy bằng 1000 ml nhám 24/29, ống sinh hàn nhám 24/29, bếp khuấy từ)
Bộ thu hồi dung môi (bình cầu đáy tròn 1000 ml, ống sinh hàn thẳng, nhiệt kế, đầu chƣng cất, nhánh thu dung môi)
Cân kỹ thuật OHAUS GS 3000g
Bản nhôm 20x20 cm tráng sẵn silica gel 60 F 254 (Merck KgaA – Frankfurter Strasse 250, Darmstadt, Germany) Đèn UV Vilber Lourmat VL – 6LC
Máy khuấy từ gia nhiệt Velp ARE
Tủ sấy đối lưu ALM400 (Đức).
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp chiết là kỹ thuật tách chất từ nguyên liệu dựa vào tính chất của chất và dung môi Khi nguyên liệu dược liệu tiếp xúc với dung môi, dung môi sẽ thấm vào và hòa tan các chất trong tế bào, sau đó khuếch tán ra ngoài Trong thực nghiệm, chiết rắn - lỏng thường được áp dụng qua các phương pháp như ngấm kiệt, ngâm dầm, và chiết Soxhlet Ngoài ra, còn có các phương pháp hiện đại như chiết CO2 siêu tới hạn, chiết dưới áp suất cao, và chiết hỗ trợ bằng lò vi sóng Mặc dù có nhiều phương pháp tiên tiến, chúng yêu cầu kỹ thuật cao và khó thực hiện Một số nghiên cứu đã công bố phương pháp tách caffeine bằng các dung môi như benzene, chloroform và nước nóng, nhưng dung môi clo hóa có thể gây ung thư Do đó, phương pháp chiết truyền thống bằng nước nóng vẫn được coi là hiệu quả nhất.
2.1 Quy trình thực hiện chiết xuất caffeine trong hạt cà phê robusta
Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và chiết thô
Cân 30g bột hạt cà phê cho vào bình cầu đáy 1000 ml, đặt trên máy đun khuấy hồi lưu với nước trong thời gian tối ưu Sau khi chiết thô, loại bỏ bã và cô cạn dịch chiết còn 200 ml Tiếp theo, để dịch chiết nguội ở nhiệt độ phòng và thực hiện chiết lỏng-lỏng bằng dung môi chloroform để thu được dịch chloroform.
Bước 2: Thu hồi dung môi
Dịch chiết chloroform được cho vào bình cầu 1000 ml, thêm 2 viên đá bọt nhỏ và tiến hành thu hồi dung môi bằng bộ thu hồi dung môi ở nhiệt độ 61-63 độ C.
Bước 3: Thăng hoa thu tinh thể
Dịch chiết chloroform chứa caffeine được cô cạn và sau đó thăng hoa ở nhiệt độ khoảng 200°C để thu được tinh thể caffeine Sau đó, tiến hành cân và tính toán hiệu suất của quá trình trích ly này.
Các bước thực hiện được thể hiện trong hình 2.3 bên dưới
Hình 2.3: Sơ đồ quy trình chiết xuất caffeine trong hạt cà phê robusta
Khảo sát thời gian chiết thô
Cân 30 gam bột hạt cà phê cho vào bình cầu 1000 ml và đặt trên bếp để đun khuấy từ hồi lưu Tiến hành quá trình này trong các khoảng thời gian khảo sát là 3 giờ, 6 giờ và 9 giờ Dịch chiết thu được từ mỗi thí nghiệm sẽ được tinh chế để thu tinh thể caffeine theo quy trình chung Sản phẩm cuối cùng là tinh thể caffeine.
27 được đem cân chính xác tính hiệu suất và kiểm tra độ tinh khiết sơ bộ bằng phương pháp sắc ký bản mỏng
Thời gian chiết tối ƣu nhất từ thí nghiệm trên sẽ đƣợc sử dụng cho các khảo sát tiếp theo
Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát thời gian chiết tối ƣu
Khảo sát lƣợng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết
Cân chính xác 30 gam bột hạt cà phê và cho vào bình cầu 1000 ml Đặt bình cầu lên bếp và tiến hành đun khuấy từ hồi lưu Thực hiện quá trình này với thời gian tối ưu đã khảo sát, sử dụng các lượng nước khác nhau, cụ thể là 150 ml.
Trong các thí nghiệm, tỷ lệ nguyên liệu và nước được sử dụng là 1:5, 1:10, 1:15 và 1:20 với thể tích 300 ml và 450 ml Dịch chiết thu được từ mỗi thí nghiệm sẽ được tinh chế để thu được tinh thể caffeine theo quy trình chuẩn Sau khi thu được sản phẩm tinh thể caffeine, chúng sẽ được cân chính xác để tính toán hiệu suất và kiểm tra độ tinh khiết sơ bộ bằng phương pháp sắc ký bản mỏng.
Lƣợng dung môi chiết tối ƣu nhất từ thí nghiệm trên sẽ đƣợc sử dụng cho các khảo sát tiếp theo
Hình 2.5: Sơ đồ khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết tối ƣu
Hình 2.6: Hệ thống đun khuấy từ hồi lưu (bên trái), chiết lỏng lỏng (bên phải)
2.2 Xây dựng quy trình chiết xuất chlorogenic acid trong hạt cà phê robusta
Quy trình chiết chlorogenic acid trong hạt cà phê robusta ban đầu đƣợc xây dựng nhƣ sau:
Bước 1: Hạt cà phê được xay thành bột và chiết Soxhlet với dung môi petroleum ether 8 – 10 giờ để loại thành phần béo trong hạt cà phê
Bước 2: Bột cà phê sau khi đã loại béo tiếp tục chiết bằng hệ thống chiết Soxhlet với dung môi methanol trong 12 giờ
Bước 3: Cô cạn dịch chiết methanol và hòa tan với nước, sau đó tiến hành chiết lỏng - lỏng bằng dung môi chloroform để tách caffeine khỏi dịch chiết nước.
Bước 4: Tiến hành kiểm tra sơ bộ các hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết nước bằng phương pháp sắc ký bản mỏng Sau đó, thiết lập hệ dung môi cho cột sắc ký nhằm tách các hợp chất hữu cơ còn lại trong dịch chiết.
Các bước thực hiện quy trình chiết xuất chlorogenic acid trong hạt cà phê robusta đƣợc mô tả ở hình sau:
Hình 2.8: Sơ đồ thực hiện quy trình chiết xuất chlorogenic acid trong hạt cà phê
Hình 2.8: Bộ chiết Soxhlet bột cà phê
2.3 Định tính và xác định cấu trúc sản phẩm thu đƣợc
Loại bản mỏng: Bản nhôm đã tráng sẵn silica gel 60 F 254 Độ dài 10 cm Hoạt hóa bản mỏng ở 105 o C trong 30 phút
Để chuẩn bị ly sắc ký, hãy sử dụng ly thủy tinh có đường kính lớn hơn bề ngang của bản mỏng Cắt giấy lọc hình thang vừa vặn vào ly sắc ký, đảm bảo có khoảng trống để quan sát đường chạy của dung môi Thêm khoảng 10 ml dung môi vào ly, sao cho mực dung môi cao từ 0,5-0,7 cm và thấp hơn vị trí vết chấm của chất Cuối cùng, để yên cho dung môi trong ly sắc ký bão hòa.
Hệ dung môi chạy sắc kí: Sử dụng các loại dung môi từ từ phân cực đến không phân cực
Sản phẩm được hòa tan trong methanol và sau đó chấm lên bản nhôm đã được tráng silica gel 60 F 254 bằng ống vi quản Chiều dài mẫu chạy là 8 cm Việc khảo sát hiện hình được thực hiện bằng đèn UV ở bước sóng 254 nm, và Rf của mẫu được ghi nhận trên bản.
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Kết quả phân tích được thực hiện tại phòng cộng hưởng từ, Viện Hóa học (nhà A18, số 18, Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, thành phố Hà Nội)
Phương pháp đo điểm nóng chảy
Sử dụng ống vi quản để lấy lượng mẫu thử vừa đủ và đặt ống vào vị trí chính xác, đảm bảo đầu ống nằm giữa thị kính để dễ quan sát Điều chỉnh nhiệt độ đến mức tối đa và chờ đến khi đạt 60% điểm nóng chảy dự kiến Sau đó, giảm nhiệt độ với tốc độ 10°C/phút cho đến khi cách điểm nóng chảy 15°C, sau đó tiếp tục giảm nhiệt độ với tốc độ 1°C/phút cho đến khi đạt điểm nóng chảy.
Hình 2.9: Máy thực hiện đo nhiệt độ nóng chảy
Quan sát quá trình chất nóng chảy qua thị kính và ghi lại nhiệt độ trên nhiệt kế từ thời điểm chất bắt đầu chảy cho đến khi nó hoàn toàn hóa lỏng.
Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn
Cách tiến hành: Phương pháp kháng khuẩn đượng biểu diễn trên sơ đồ sau
Hình 2.10: Sơ đồ nghiên cứu khả năng kháng khuẩn
Chủng vi khuẩn Escherichia coli được hoạt hóa trên môi trường dinh dưỡng thích hợp ở 37 o C/24 giờ Dịch vi khuẩn Escherichia coli đƣợc đƣa về nồng độ 1-2 x
Dịch khuẩn Escherichia coli được trải trên môi trường MHA và đục những giếng cú đường kớnh 7 mm Bơm 70 àL dịch chiết đó chuẩn bị vào mỗi giếng và ủ ở
Để các chất lỏng khuếch tán hiệu quả trong thạch, cần bảo quản ở nhiệt độ 4 độ C trong 30 phút Sau đó, các đĩa được ủ trong điều kiện 37 độ C trong 24 giờ Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết được xác định bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn quanh mỗi giếng, sử dụng môi trường thạch MHA.
Tran vi khuẩn trên đĩa petri Đục lỗ 2mm
Bơm dung dịch mẫu vào giếng (àl) Ủ ở 37 O c/ 24 giờ
