Sàng lọc in silico các hợp chất tự nhiên có tác dụng ức chế enzym her2 hướng điều trị bệnh ung thư vú

TỔNG QUAN

Tổng quan về bệnh ung thư vú

Ung thư vú là nguyên nhân thứ hai gây tử vong do ung thư ở phụ nữ, và việc ngăn ngừa căn bệnh này vẫn còn gặp nhiều thách thức Chẩn đoán sớm ung thư vú là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để giảm tỷ lệ tử vong, với tỷ lệ sống sau 5 năm ở các nước phát triển đạt trên 80% nhờ vào sự phòng ngừa kịp thời Trong thập kỷ qua, tiến bộ trong nghiên cứu ung thư vú đã giúp hiểu rõ hơn về cơ chế sinh bệnh và kháng thuốc, đặc biệt là khi phát hiện tế bào gốc ung thư vú và nhiều gen liên quan đến căn bệnh này.

Ung thư vú là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ toàn cầu, với khoảng 570.000 ca tử vong vào năm 2015 và hơn 1,5 triệu phụ nữ được chẩn đoán mỗi năm, chiếm 25% tổng số ca ung thư Tại Mỹ, ung thư vú ước tính chiếm 30% tổng số ca ung thư mới ở phụ nữ, tương đương 252.710 ca vào năm 2017 Đây là một loại ung thư có khả năng di căn đến các cơ quan xa như xương, gan, phổi và não Chẩn đoán sớm ung thư vú có thể cải thiện tiên lượng và tăng tỷ lệ sống sót.

Theo Bộ Y tế Việt Nam năm 2020, ung thư vú (UTV) là loại ung thư phổ biến nhất và là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong do ung thư ở phụ nữ toàn cầu, với khoảng 15.230 ca mới và hơn 6.100 ca tử vong mỗi năm tại Việt Nam Ung thư vú ở nam giới chiếm khoảng 1% tổng số trường hợp Đa số các ca UTV phát sinh từ tế bào biểu mô của vú, và bệnh Paget vú có thể đi kèm với UTV, do đó cần điều trị như UTV thông thường theo giai đoạn tương ứng.

Các yếu tố tiên lượng quan trọng trong ung thư bao gồm kích thước khối u nguyên phát, số lượng hạch di căn, thể mô bệnh học, độ mô học và tình trạng thụ thể nội tiết.

2 tình trạng thụ thể yếu tố phát triển biểu bì người số 2 (human epidermal growth factor receptor-HER2) [8]

Tỷ lệ sống 5 năm của bệnh nhân ung thư vú (UTV) đã có sự cải thiện đáng kể qua các năm Theo thống kê tại Hoa Kỳ trong giai đoạn 2001-2002, tỷ lệ sống cho từng giai đoạn là: giai đoạn 0 đạt 100%, giai đoạn I 88%, giai đoạn II từ 74-81%, giai đoạn III từ 41-67% và giai đoạn IV chỉ 15% Đến năm 2012, tỷ lệ này đã tăng lên, với giai đoạn 0 và I vẫn giữ 100%, giai đoạn II đạt 93%, giai đoạn III 72%, trong khi giai đoạn IV tăng lên 22%.

Theo báo cáo Globocan 2020, ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ tại Việt Nam, với 21.555 ca mới mắc, chiếm 25,8% tổng số ca ung thư ở nữ Nếu tính cả hai giới, ung thư vú đứng thứ ba, sau ung thư gan và ung thư phổi.

Tỷ lệ mới mắc ung thư vú ở nữ giới hiện nay là 34.2 trên 100.000 dân, trong khi số tử vong do bệnh này đứng thứ tư trong tổng số ca tử vong vì ung thư, với 9.345 trường hợp, chỉ sau ung thư gan, phổi và dạ dày Tỷ lệ tử vong chuẩn theo tuổi do ung thư vú là 13.8 trên 100.000 dân.

Trong 5 đến 10 năm qua, tỷ lệ bệnh nhân ung thư tại Việt Nam đến khám và điều trị ở giai đoạn muộn đã giảm xuống dưới 70% Nhờ vào sự tăng cường công tác truyền thông, đặc biệt trong Chương trình quốc gia về phòng, chống bệnh không lây nhiễm, tỷ lệ người mắc bệnh ung thư được phát hiện và điều trị ở giai đoạn sớm đã có sự cải thiện đáng kể.

1.1.2 Nguyên nhân – Các yếu tố nguy cơ

Các khối u vú thường bắt nguồn từ sự tăng sinh của ống dẫn sữa, phát triển thành khối u lành tính hoặc ung thư di căn dưới tác động của các yếu tố gây ung thư Môi trường vi mô của khối u, bao gồm mô đệm và đại thực bào, đóng vai trò quan trọng trong việc khởi phát và tiến triển ung thư vú Nghiên cứu cho thấy tuyến vú của chuột có thể hình thành u chỉ khi chất đệm tiếp xúc với chất gây ung thư, không cần đến chất nền ngoại bào hay biểu mô Đại thực bào có khả năng tạo ra vi môi trường gây viêm, thúc đẩy sự hình thành mạch và giúp tế bào ung thư trốn tránh sự từ chối của hệ miễn dịch Sự khác biệt trong methyl hóa DNA cũng đã được quan sát giữa môi trường bình thường và môi trường liên quan đến ung thư.

Những thay đổi biểu sinh trong vi môi trường khối u có thể thúc đẩy quá trình sinh ung thư, trong đó một phân lớp mới của tế bào ác tính được gọi là tế bào gốc ung thư (CSC) đã được phát hiện CSC liên quan đến sự khởi phát, thoát ra và tái phát của khối u Đây là nhóm nhỏ các tế bào có khả năng tự tái tạo, phát triển từ tế bào gốc hoặc tế bào nguyên bản trong các mô bình thường, và có khả năng kháng lại các liệu pháp điều trị truyền thống như hóa trị và xạ trị.

Tiền sử gia đình có người mắc ung thư vú (UTV), đặc biệt khi có từ hai người trở lên ở lứa tuổi trẻ, là yếu tố nguy cơ nổi bật Đột biến gen BRCA1 và BRCA2 cũng liên quan đến UTV, ung thư buồng trứng và một số loại ung thư khác Các yếu tố khác bao gồm: kinh nguyệt lần đầu sớm, mãn kinh muộn, phụ nữ độc thân, không sinh con, không cho con bú, và sinh con đầu lòng muộn Béo phì, chế độ ăn giàu chất béo và sử dụng rượu cũng làm tăng nguy cơ mắc bệnh Viêm vú trong thời kỳ sinh đẻ và một số bệnh vú lành tính cũng có thể là yếu tố nguy cơ Nguy cơ mắc UTV tăng theo tuổi tác, nhưng bệnh cũng có thể xảy ra ở những người trẻ.

1.1.3 Các liệu pháp hiện tại cho ung thư vú

Đối với khối u nguyên phát, các phương pháp phẫu thuật bao gồm cắt tuyến vú vét hạch nách, cắt tuyến vú tiết kiệm da, cắt tuyến vú bảo tồn quầng núm, và phẫu thuật bảo tồn kết hợp với kỹ thuật tái tạo.

- Đối với hạch vùng: có các hình thái phẫu thuật như nạo vét hạch nách hoặc sinh thiết hạch cửa [8]

Tạo hình và tái tạo tuyến vú cho bệnh nhân ung thư vú là nhu cầu cấp thiết và chính đáng trong những năm gần đây Các phương pháp tái tạo bao gồm sử dụng chất liệu độn (implant), vạt da cơ có cuống, và vạt da cơ tự do với kỹ thuật vi phẫu Việc chỉ định phẫu thuật cần được thực hiện bởi bác sĩ chuyên ngành ung bướu, sau khi đánh giá toàn diện về tiên lượng bệnh ung thư và chất lượng sống của bệnh nhân.

- Phẫu thuật sạch sẽ, phẫu thuật triệu chứng: đối với giai đoạn muộn [8]

1.1.3.2 Xạ trị a Xạ trị chiếu ngoài

- Xạ trị tại diện u: áp dụng với các trường hợp có khối u lớn (>5cm) hoặc u ở vị trí ngoại biên, khả năng cắt rộng bị giới hạn [8]

- Xạ trị tại hạch vùng: áp dụng cho các trường hợp có 4 hạch di căn hoặc có hạch di căn kết hợp với yếu tố nguy cơ cao [8]

- Xạ trị trong điều trị bảo tồn: đây là lựa chọn bắt buộc trong điều trị bảo tồn ung thư vú [8]

Xạ trị trong điều trị ung thư có nhiều hình thức đa dạng, bao gồm xạ trị bằng máy Cobalt truyền thống và xạ trị bằng máy gia tốc với các kỹ thuật hiện đại như lập kế hoạch và xạ trị 3D, xạ trị điều biến liều, xạ trị với suất liều thấp, xạ trị điều biến thể tích VMAT và xạ trị proton Ngoài ra, mô phỏng xạ trị được thực hiện qua các phương pháp như chụp CLVT, MRI hoặc PET/CT, PET/MRI Một phương pháp khác trong xạ trị là xạ trị áp sát.

Cấy hạt phóng xạ vào khối u được áp dụng trong các trường hợp không thể phẫu thuật triệt căn, bệnh lý kèm theo không cho phép phẫu thuật, hoặc khi bệnh nhân từ chối phẫu thuật Ngoài ra, xạ trị trong mổ (IORT) cũng là một phương pháp điều trị hiệu quả trong những tình huống này.

Tổng quan về nghiên cứu In silico

1.2.1 Mô hình in silico trong nghiên cứu phát triển thuốc mới

Phát triển thuốc mới là một quá trình phức tạp, tốn kém và kéo dài, với chi phí lên đến hàng tỷ đô la cho mỗi loại thuốc Tỷ lệ thành công từ hợp chất ban đầu đến thương mại hóa rất thấp, chỉ dưới 2% các hợp chất được nghiên cứu có đủ đặc tính sinh học để trở thành thuốc Theo nghiên cứu năm 2016 của DiMasi và cộng sự từ Trung tâm nghiên cứu và phát triển thuốc, Đại học Tufts Hoa Kỳ, trung bình cần hơn 2,5 tỷ đô la và từ 10-15 năm để đưa một loại thuốc ra thị trường, nếu dự án thành công.

Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc bao gồm nhiều bước quan trọng như xác định bệnh và đích tác dụng của thuốc, thiết lập quy trình thử nghiệm, tìm kiếm hợp chất dẫn đường và xây dựng mối quan hệ giữa hợp chất và tác dụng Các bước tiếp theo bao gồm xác định pharmacophore, tối ưu hóa dược lực học và dược động học, sàng lọc qua các cơ quan phân lập và tế bào Nghiên cứu dược lý của hợp chất, mô hình hiệu quả điều trị bệnh, và các nghiên cứu sớm về độ an toàn và độc tính cũng rất cần thiết Cuối cùng, quy trình bao gồm các nghiên cứu tiền lâm sàng, bào chế, phát triển sản xuất, đăng ký giấy tờ pháp lý và thử nghiệm lâm sàng.

Trong nghiên cứu hiện nay, thiết kế thuốc hiệu quả nhất được thực hiện thông qua kỹ thuật thiết kế thuốc hỗ trợ bởi máy tính Máy tính được áp dụng trong nhiều giai đoạn, từ việc tìm kiếm hợp chất hóa học có tác dụng sinh học, tối ưu hóa cấu trúc để tăng hoạt tính sinh học và giảm độc tính, đến việc cải thiện các tính chất dược động học Tất cả các phương pháp này được gọi là các phương pháp “in silico”.

Các phương pháp in silico nổi bật hơn so với các phương pháp thực nghiệm truyền thống nhờ khả năng thiết kế phân tử thuốc mới hiệu quả hơn Chúng không chỉ giải thích bản chất phân tử của các tương tác thuốc mà còn giúp rút ngắn thời gian thực hiện nghiên cứu.

Các phương pháp in silico cho phép dự đoán hoạt tính sinh học của các hợp chất thông qua các mô hình toán học, nghiên cứu cơ chế tác dụng và độc tính, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí trong phát triển thuốc mới Những phương pháp này đã hỗ trợ đáng kể trong việc phát hiện các hợp chất mới có hoạt tính sinh học trước khi chúng được tổng hợp hoặc phân lập, thông qua quá trình sàng lọc ảo.

Docking phân tử là một phương pháp tiên tiến trong nghiên cứu ung thư vú, cho phép sàng lọc các chất ức chế enzym và chất chủ vận thụ thể Phần mềm chuyên dụng sử dụng mô hình phân tử ba chiều, độ phân giải cao của protein mục tiêu như thụ thể hoặc enzym để dự đoán các phối tử mới có khả năng liên kết và điều chỉnh hoạt động của chúng Cấu trúc khuôn mẫu được tạo ra thông qua mô hình tương đồng hoặc tinh thể học Trong quá trình docking phân tử, mục tiêu phân tử có thể hoạt động theo nhiều hướng khác nhau, giúp phần mềm sàng lọc cơ sở dữ liệu hỗn hợp một cách nhanh chóng và hiệu quả Các chức năng chấm điểm tích hợp dự đoán hoạt động sinh học dựa trên sự tương tác giữa phối tử và protein mục tiêu, xem xét các yếu tố như hình dạng phối tử, khả năng tương thích tĩnh điện, hiệu ứng hòa tan, năng lượng liên kết, cũng như các yếu tố entanpy và entropy, tất cả đều là những yếu tố quyết định quan trọng cho sự tương tác phối tử - thụ thể thành công.

Docking là một phương pháp tối ưu hóa nhằm xác định vị trí và cấu hình lý tưởng của một cơ chất khi gắn kết với protein Mục tiêu chính của quá trình này là tìm ra cấu hình có năng lượng tự do thấp nhất, tương ứng với cấu hình bền vững nhất sau khi liên kết giữa phối tử và protein được hình thành Để đạt được cấu hình tối ưu, cần phải liên hệ các cấu hình khác nhau.

8 không gian với các trị số đánh giá được khả năng gắn kết của cơ chất lên protein và sau đó áp dụng thuật toán tìm kiếm

Quá trình docking bao gồm ba bước chính:

Để chuẩn bị cấu tử, bạn có thể lấy cấu trúc từ các thư viện như Pubchem, Zinc hoặc sử dụng phần mềm như ChemDraw, Chemsketch để vẽ Sau khi xây dựng cấu trúc 3D, hãy sử dụng phần mềm Chimera và Avogadro để xử lý cấu tử, bao gồm chỉnh sửa điện tích, tối giản hóa năng lượng, gắn trường lực cho phân tử và tạo file dbpqt.

Chuẩn bị protein là bước quan trọng trong nghiên cứu, thường sử dụng các cấu trúc 3D có sẵn từ ngân hàng dữ liệu protein Nếu không có sẵn, chúng ta có thể xây dựng cấu trúc 3D thông qua phương pháp mô phỏng tương đồng, trong đó sắp xếp chuỗi amino acid của protein dựa trên khung cấu trúc bậc 3 có độ phân giải cao Sau khi có cấu trúc 3D, cần sử dụng phần mềm để chuẩn bị protein cho mô phỏng docking, bao gồm các bước như loại bỏ nước và các thành phần không cần thiết, thêm hydro, gắn trường lực, phân tích vùng tương tác và xây dựng file dbqpt.

Mô phỏng docking là quá trình quan trọng trong nghiên cứu tương tác giữa protein và phối tử Trước khi tiến hành, cần sử dụng phần mềm để xác định túi tương tác trên protein, thường đặt tại trung tâm hoạt động của nó Trong quá trình docking, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm cấu hình phối tử phù hợp nhất, tương ứng với năng lượng toàn hệ thấp nhất Các cấu hình và tương tác này sẽ được phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng như Chimera 1.14, Discovery Studio Visualizer 4.0 và Autodock vina 1.1.2.

1.2.3 Quy tắc Lipinski về các hợp chất giống thuốc

Hầu hết các ứng cử viên thuốc thất bại trong thử nghiệm lâm sàng do không đạt yêu cầu về hiệu quả và độc tính Năm 1997, Christopher Lipinski và các cộng sự đã đề xuất bộ quy tắc số 5 cho các hợp chất giống thuốc, cho rằng thuốc uống thường có các đặc tính hóa lý và cấu trúc trong một phạm vi nhất định Một dược chất đường uống không được vi phạm quá 2 trong 5 tiêu chí này.

- Trọng lượng phân tử: MW < 500 Dalton

- Số lượng nhóm cho liên kết hydro (Số lượng các nhóm –NH và – OH):

- Số lượng nhóm nhận liên kết hydro (Bao gồm nguyên tử O và N): HBA ≤ 10

- Hệ số phân bố octanol/nước: LogP < 5

- Hệ số khúc xạ mol trong khoảng 40-130 [24]

Các thông số hóa lý liên quan đến khả năng hòa tan trong nước và tính thấm ở ruột là những yếu tố quan trọng trong sinh khả dụng đường uống Nếu một hợp chất không đáp ứng quy tắc RO5, nó có thể gặp khó khăn khi sử dụng đường uống Tuy nhiên, việc một chất đáp ứng RO5 không đảm bảo rằng nó sẽ trở thành thuốc, vì quy tắc này không đề cập đến các đặc điểm cấu trúc hóa học cụ thể của thuốc và hợp chất không phải thuốc.

1.2.4 Dự đoán ADMET các thông số dược động học và độc tính

Trong nghiên cứu in silico, dự đoán các thông số dược động học như hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính là yếu tố quan trọng trong phát triển thuốc mới Theo thống kê từ những năm 2000, khoảng một nửa số thuốc không vượt qua thử nghiệm lâm sàng gặp vấn đề về dược động học (39%) và độc tính trên động vật (11%) Hiện nay, với sự phát triển của các kho dữ liệu hóa học khổng lồ và những tiến bộ công nghệ, việc dự đoán này ngày càng trở nên khả thi và hiệu quả hơn.

Công nghệ thông tin đã đóng vai trò quan trọng trong việc sàng lọc các ứng cử viên thuốc dựa trên các thông số ADMET, diễn ra trước khi tiến hành đánh giá lâm sàng Nhờ vào sự phát triển của các công cụ đánh giá ADMET, chỉ còn 8% thuốc thất bại vì không đáp ứng các thuộc tính này, qua đó tiết kiệm thời gian và chi phí, đồng thời đảm bảo tính an toàn và ổn định cho các loại thuốc được thiết kế.

Trong số nhiều công cụ dự đoán ADMET, có cả phần mềm thương mại như CASE ULTRA, DEREK, META-PC, METEOR, PASS, GUSAR và các công cụ trực tuyến phổ biến như ADMETlab, admetSAR, pkCSM, SwissADME Những công cụ này được ưa chuộng trong nghiên cứu khoa học nhờ khả năng dự đoán ADMET chính xác và thuận tiện.

Một số hợp chất có tác dụng ức chế enzym HER2

Lapatinib là một chất ức chế tyrosine kinase đường uống, nhắm vào thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) và thụ thể HER2, thường biểu hiện quá mức trong ung thư Dữ liệu tiền lâm sàng cho thấy lapatinib là một chất ức chế mạnh mẽ và có chọn lọc cho vùng tyrosine kinase của EGFR và HER2, giúp ức chế sự phát triển của các tế bào khối u biểu hiện quá mức các thụ thể này cả in vitro và in vivo.

Nghiên cứu cho thấy rằng Emodin có khả năng ức chế sự phát triển của khối u và kéo dài thời gian sống sót của chuột mang tế bào ung thư vú.

Sự kết hợp giữa emodin và paclitaxel đã chứng minh khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú biểu hiện HER-2/neu, đồng thời kéo dài thời gian sống sót ở chuột khỏe mạnh mang tế bào khối u với mức độ cao của p185 neu.

Cả phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch và phân tích Western blot đều cho thấy emodin làm giảm phosphoryl hóa tyrosine của HER-2 / neu trong mô khối u Kết quả cho thấy hoạt động tyrosine kinase của HER-2 / neu là cần thiết cho sự phát triển của khối u và tính kháng hóa học Các chất ức chế tyrosine kinase như emodin có khả năng ức chế sự phát triển của HER-2 / neu, làm tăng biểu hiện khối u ở chuột và tăng cường độ nhạy cảm của các khối u này với paclitaxel.

Lapatinib, một chất ức chế tyrosine kinase mới của HER2/EGFR, được sử dụng trong điều trị ung thư vú dương tính với HER2, nhưng tình trạng kháng thuốc đã hạn chế hiệu quả điều trị Nghiên cứu cho thấy việc ức chế autophagy có thể làm giảm khả năng tăng sinh và tổng hợp DNA của tế bào kháng lapatinib Berberine, với nhiều tác dụng sinh hóa và dược lý, đã thu hút sự chú ý trong điều trị ung thư vú, gây ra stress oxy hóa và kích hoạt con đường tự chết trong tế bào ung thư Sự kết hợp giữa berberine và lapatinib đã khắc phục tình trạng kháng thuốc, với berberine kích thích quá trình apoptosis thông qua điều chỉnh mức độ ROS Đặc biệt, lapatinib ổn định Nrf2 và duy trì mức ROS thấp ở tế bào kháng thuốc, trong khi berberine đảo ngược sự đề kháng của lapatinib bằng cách điều chỉnh giảm c-Myc Chiến lược sử dụng berberine để khắc phục tình trạng kháng thuốc lapatinib hứa hẹn mang lại hiệu quả điều trị tốt hơn.

Curcumin có khả năng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư vú khác nhau Nghiên cứu cho thấy, việc điều trị bằng curcumin làm giảm mức độ oncoprotein HER-2, phosphoryl hóa Akt, MAPK và biểu hiện của NF-κB ở cả hai dòng tế bào BT-474 và SK-BR-3.

Trong mô hình xenograft BT-474, curcumin đã chứng minh khả năng giảm kích thước khối u hiệu quả, mặc dù không mạnh mẽ như herceptin Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng curcumin có tiềm năng trở thành một phương pháp điều trị ung thư vú có biểu hiện quá mức HER-2.

Các hợp chất chống ung thư hiện nay đã chứng minh hiệu quả điều trị, nhưng tình trạng kháng thuốc đang giảm sút hiệu quả lâm sàng Do đó, cần tìm kiếm những hướng đi mới để phát hiện thêm nhiều hợp chất có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư.

Các hợp chất thiên nhiên và các dẫn xuất của chúng chiếm 50% số lượng thuốc được sử dụng trong hóa trị ung thư, cho thấy vai trò quan trọng của chúng trong việc tìm kiếm các hợp chất có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư Ngoài ra, việc nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên trong ngăn ngừa ung thư cũng đang được chú trọng.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu

Cấu trúc tinh thể của protein dùng trong nghiên cứu Docking

Cấu trúc 3D của protein được lấy từ ngân hàng dữ liệu protein và được xử lý trước khi áp dụng vào quá trình sàng lọc.

Hình 1 Cấu trúc 3D enzym HER2 được lấy từ ngân hàng dữ liệu protein

Hình 2 Cấu trúc 3D enzym HER2 sau khi sàng lọc

Thiết bị, phần mềm

Thiết bị : Sử dụng các phần mềm trên máy tính Sony Vaio – Hệ điều hành

Phần mềm: Danh sách các phần mềm sử dụng bao gồm:

- Phần mềm lưu trữ, hiệu chỉnh số liệu: Microsoft Excel 2010

- Phần mềm xây dựng cấu trúc hóa học: ChemDraw Professional bản 16.0

- Phần mềm tối ưu hóa các hợp chất : Avogadro 1.0.3

- Phần mềm mô phỏng Docking: phần mềm Autodock vina 1.1.2

- Phần mềm phân tích, đánh giá cấu dạng và biểu diễn tương tác: Chimera 1.14 và Discovery Studio Visualizer 4.0

-Phần mềm sàng lọc vùng hoạt động của enzym :MGL Autodock tools 1.5.6

The software for studying physicochemical properties and pharmacokinetics, including Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, and Toxicity (ADMET), includes tools such as Volsurf version 1.0.4 and Toxtree version 3.1.0, along with online resources like AdmetSAR version 2.0 and SwissADME.

Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu gồm :

1 Xây dựng tổ hợp các hợp chất tự nhiên có tác dụng ức chế enzym HER2 dựa trên các công bố trước đây : tối ưu hóa cấu trúc và xây dựng file pdbqt

2 Chuẩn bị cấu trúc protein

3 Thực hiện docking phân tử

4 Sàng lọc các hợp chất có tác dụng ức chế enzym HER2 tối ưu nhất

5 Phân tích các thông số và đánh giá đặc tính giống thuốc của hợp chất

Phương pháp nghiên cứu

Dựa trên các nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã tổng hợp các hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế enzym HER2 Cấu trúc 3D của các hợp chất này được trích xuất từ cơ sở dữ liệu PubChem và sau đó được tối ưu hóa bằng phần mềm Avogadro.

Enzym HER2 với ID 3RCD được truy xuất từ ngân hàng dữ liệu protein RCSB (www.rcsb.org), trong đó HER2 phức hợp với TAK-285 (ID PDB: 3RCD; độ phân giải: 3,21 Å; giá trị R: 0,294) Tiêu chí lựa chọn PDB bao gồm độ phân giải tối thiểu và cấu trúc của phối tử gắn vào giống như trong cấu trúc kết tinh sau quy trình thả lại Phức hợp 3RCD đã chứa ligand đồng kết tinh TAK-285, một chất ức chế enzym HER2.

Sau khi được tải về từ ngân hàng RCSB, phân tử ligand đồng kết tinh TAK-285 sẽ được tách ra khỏi phức hợp nhờ phần mềm Discovery Studio

Visualizer 4.0 Khi đó, ta sẽ được phân tử đồng kết tinh và enzym HER2 riêng Phân tử đồng kết tinh sau khi re-dock sẽ được dùng để so sánh với các phối tử đã được dock, xem sự tương đồng về cấu dạng và khả năng tương tác như thế nào để từ đó đánh giá kết quả Đánh giá cấu dạng và khả năng tương tác sử dụng phần mềm Chimera 1.14 và Discovery Studio Visualizer 4.0

Sau khi tách phân tử đồng kết tinh, protein sẽ loại bỏ phân tử nước và thêm các nguyên tử hydro trước khi tái lập vùng hoạt động của enzym bằng phần mềm MGL Autodock tools 1.5.6, sau đó xây dựng file pdbqt Vùng hoạt động của enzym được xác định dựa trên các amino acid quan trọng như Ala751, Leu800, Met801, Leu852 và Asp863 đã được công bố trước đây.

Thông số Grid box : dựa vào các acid amin quan trọng , thông số Grid box được xác định như sau :

2.4.3 Xác nhận giao thức docking

Trước khi tiến hành sàng lọc các hợp chất, cần re-dock phối tử đồng tinh thể vào vị trí hoạt động của mục tiêu để xác định độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) Việc đánh giá sự tương đồng về cấu dạng được thực hiện bằng phần mềm Chimera 1.14, cho thấy giá trị RMSD đạt 1.400 Å Giá trị này thỏa mãn điều kiện RMSD nhỏ hơn 1.5 Å, chứng tỏ rằng kết quả docking phân tử vào mục tiêu là đáng tin cậy.

Hình 3 Kết quả re-dock ligand TAK-285

Sử dụng phần mềm Discovery Studio Visualizer 4.0 để biểu diễn sự tương tác giữa TAK-285 và enzym HER2, được thể hiện như trong hình 2.4

Hình 4 Sự tương tác giữa TAK-285 và HER2

Năng lượng liên kết sau khi re-dock cho kết quả -10.1(kcal/mol)

2.4.4 Nghiên cứu các đặc điểm giống thuốc

Quy tắc Lipinski bao gồm 5 tiêu chí nhằm so sánh các hợp chất có đặc tính giống thuốc và không giống thuốc, dựa trên khả năng liên kết của phối tử tốt hơn lisinopril đồng kết tinh sau quá trình docking Một hợp chất được xem là có tiềm năng phát triển thành thuốc uống nếu không vi phạm quá 2 trong số các tiêu chí này.

- Trọng lượng phân tử: MW < 500 Dalton

- Số lượng nhóm cho liên kết hydro (Số lượng các nhóm –NH và – OH):

- Số lượng nhóm nhận liên kết hydro (Bao gồm nguyên tử O và N): HBA ≤ 10

- Hệ số phân bố octanol/nước: LogP < 5

- Độ khúc xạ mol trong khoảng 40-130 [34]

Công cụ trực tuyến pkCSM

Công cụ pkCSM (http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/prediction) được sử dụng để đánh giá quy tắc Lipinski 5 Các công thức SMILES của các phối tử được tải từ cơ sở dữ liệu Pubchem (www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) và được sử dụng làm dữ liệu đầu vào cho pkCSM Sau khi lựa chọn các hợp chất tương tự thuốc, quá trình phân tích các thông số dược động học và độc tính sẽ được thực hiện để đưa ra kết quả cuối cùng.

2.4.5 Nghiên cứu các đặc tình dược động học và độc tính

Công cụ trực tuyến pkCSM cho phép dự đoán các đặc tính dược động học và độc tính của hợp chất thông qua công thức SMILES Kết quả bao gồm các thông số về hấp thu như tính tan trong nước, tính thấm màng Caco2 và hấp thu ở ruột, phân bố qua hàng rào máu não và hệ thần kinh trung ương, chuyển hóa liên quan đến ức chế enzym ở gan, thải trừ qua thận và độc tính như độc tính AMES và độc tính gan Đặc biệt, tính hấp thu thuốc ở ruột người (HIA) và tính thấm là những yếu tố quan trọng trong quá trình hấp thu.

Hấp thụ qua màng Caco2 được phân loại thành ba mức độ: kém (0-20%), vừa (20-70%) và tốt (70-100%) Tính thấm qua màng Caco2 được coi là cao khi log Papp lớn hơn 0,9 cm/s Để một hợp chất có thể thấm qua hàng rào máu não, yêu cầu logBB phải lớn hơn 0,3, trong khi đó, giá trị tương ứng cho hệ thần kinh trung ương (CNS) là trên -2.

[34, 35] Các hợp chất cũng được lựa chọn dựa trên tính không có độc tính của chúng

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Sàng lọc chất ức chế enzym HER2 trong tự nhiên

Sau khi chuẩn bị các phối tử, chúng tôi đã tiến hành docking 46 hợp chất tự nhiên được tổng hợp từ các nghiên cứu trước đây với enzym HER2 để sàng lọc các phân tử có khả năng ức chế HER2 Kết quả thu được được trình bày trong bảng dưới đây.

Bảng 1: Kết quả docking các phân tử vào mục tiêu tác động với mức năng lượng liên kết tương ứng

Tên Năng lượng liên kết

E ) -4-hydroxy-3-metylbut-2-enyl] axit benzoic

3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-5,7- dihydroxy-2,3-dihydrochromen-4- on)

(hydroxymetyl) oxan-2-yl] oxyphenyl] prop-2-enoyl] axit oxypropanoic)

(4-hydroxy-3-[€-7-hydroxy-3,7- dimethyl-4-oxooct-5-enyl]-5-[E-4- hydroxy-3-methylbut-2- enyl]benzoic acid)

2-[3-[2-(1,3-benzodioxol-5-yl)-7- methoxy-1-benzofuran-5-yl]-3- hydroxypropoxy]-6-

(hydroxymethyl)oxolan-2- yl]oxymethyl]-3,4,5- trihydroxyoxan-2-yl]oxy-6- methoxychromen-4-ol

3-[3-[(2S,3R,4S,5R)-3,4- dihydroxy-5-(6-oxo-1H-purin-9- yl)oxolan-2-yl]propanoyl]benzoic acid

1,6-dihydroxycyclohex-2-ene-1- carbonyl]oxymethyl]phenoxy]-

[(2R,3S,4S,5R,6S)-6-[2,3- dihydroxy-4-E-3-(4- hydroxyphenyl)prop-2- enoyl]phenoxy]-3,4,5- trihydroxyoxan-2-yl]methyl E-3-

[3-hydroxy-5-[E-2-(4- hydroxyphenyl)ethenyl]phenyl] hydrogen sulfate

Phân tử đồng kết tinh TAK-285 -10.1 11620908

TAK-285 đã chứng minh hoạt tính ức chế chống lại các kinase HER2 và EGFR với giá trị IC 50 đối với HER2 và EGFR lần lượt là 17 nmol / L (95%

CI 12-24) và 23 nmol / L (95% CI 18-30) Trong một nhóm các kinase ở người,

TAK-285 cho thấy sự ức chế yếu (0‒50%) đối với 88 trong số 96 kinase được thử nghiệm, ức chế vừa phải (50-80%) đối với EGFR (L858R) và phosphatase kiềm, và ức chế mạnh (80‒100%) đối với các kinase họ HER, bao gồm EGFR (L861Q), cũng như CDK3/cyclin E và Flt3.

Từ kết quả ở bảng 1, ta thấy được có 4 phân tử cho kết quả tối ưu so với TAK-285 đó là Diplacone (2-(3,4-dihydroxyphenyl)-6-[(2E)-3,7- dimethylocta-2,6-dienyl]-5,7-dihydroxy-2,3-dihydrochromen-4-on)

The compounds difluoromethoxybenzoate (4853197), Mono-O-acetylbisdemethoxycurcumin (52944954), and Berberine (2353) exhibit binding energies of -10.5 kcal/mol, -10.4 kcal/mol, and -10.3 kcal/mol, respectively All of these compounds demonstrate strong inhibitory effects on the HER2 enzyme, with Diplacone showcasing the lowest binding energy at -10.5 kcal/mol.

Bảng 2 Bảng tương tác của các chất với các amin axit trong vùng trung tâm hoạt động

Tên hợp chất Acid Amin tạo liên kết

Diplacone Cys805, Ala751, Phe864, Ser728

Berberin Ala751, Thr862, Asp863, Cys805,

TAK-285 Leu726, Val734, Ala751, Glu770,

Met774, Leu796, Met801, Leu852, Thr862, Asp863

Hình 5.Tương tác của Diplancone với enzyme HER2

Hình 6.Tương tác của [2-(naphthalen-2-ylamino)-2-oxoethyl] 3-

(difluoromethoxy)benzoate với enzyme HER2

Hình 7.Tương tác của Mono-O-acetylbisdemethoxycurcumin với enzyme

Hình 8 Tương tác của Berberin với enzyme HER2

Kết quả phân tích các thông số Lipinski

Nghiên cứu cho thấy cả bốn hợp chất đều có khả năng ức chế cao hơn TAK-285, trong đó Diplacone là hợp chất tối ưu nhất với mức năng lượng thấp nhất.

Các phân tích và đánh giá cho thấy các thông số Lipinski cùng với các đặc tính ADMET của bốn hợp chất được trình bày chi tiết trong bảng 2 và bảng 3 dưới đây.

Bảng 3 Các thông số Lipinski

Tên hợp chất Khối lượng phân tử

Liên kết hydro được chấp nhận

LOGP Độ khúc xạ mol

Mono -O-acetyl bis demethoxy curcumin

- Mass là khối lượng phân tử

- Hydrogen bond donor là số liên kết hydro

- Hydrogen bond acceptors là số liên kết hydro được chấp nhận

- LOGP là tính ưa mỡ, được biểu thị bằng logP

- Molar Refractivity là độ khúc xạ mol Đối chiếu với Quy tắc Lipinski:

- Khối lượng phân tử nhỏ hơn 500 Dalton

- Tính ưa mỡ cao (được biểu thị bằng LogP nhỏ hơn 5)

- Ít hơn 5 liên kết hydro

- Ít hơn 10 chất nhận liên kết hydro

- Độ khúc xạ mol phải nằm trong khoảng 40-130

Ta thấy, Diplacone đáp ứng 4/5 tiêu chí của quy tắc Lipinski , trong khi

3 hợp chất còn lại đáp ứng đủ cả 5/5 tiêu chí.

Đánh giá các đặc tính ADMET

Các đặc tính ADMET của bốn hợp chất được thể hiện rõ ở bảng 4

Bảng 4 Các đặc tính ADMET (hấp thu, phân bố, chuyển hóa, bài tiết và độc tính)

33 oxoethyl] 3- (difluorometho xy)benzoate demethoxy curcumin

Khả năng hòa tan trong nước

Hấp thụ đường ruột (con người)

Khả năng thẩm thấu qua da

Chất ức chế P- glycoprotei n II

Phân bố Phân số không bị ràng buộc (con người)

Tính thấm của thần kinh trung ương

Bài tiết Tổng bài tiết

Chất nền OCT2 trong thận

Không Không Không Không Độc tính AMES độc tính

Tối đa liều lượng dung nạp

Chất ức chế hERG II

Có Có Có Không Độc tính cấp tính cho chuột bằng miệng (LD50)

2.328 2.06 1.841 2.571 Độc tính mãn tính ở chuột bằng miệng (LOAEL)

Không Không Không Không Độc tính của T.Pyriformi s

Một trong những thách thức lớn nhất mà ứng viên thuốc phải đối mặt là sở hữu các đặc tính ADMET phù hợp Việc xác định các đặc tính này trong giai đoạn phát hiện thuốc sớm là rất quan trọng để giảm thiểu các vấn đề ADMET trong quá trình phát triển thuốc Nghiên cứu này đã phân tích các đặc tính ADMET và cho thấy rằng hợp chất tự nhiên trong nghiên cứu có các đặc tính ADMET thuận lợi.

BÀN LUẬN

Về kết quả

Nghiên cứu này đã sàng lọc 46 hợp chất tự nhiên từ thư viện hóa học Pubchem, trong đó nhiều hợp chất cho thấy khả năng gắn kết tốt hơn chất đối chứng TAK-285 Điều này được giải thích bởi sự hiện diện của các vòng thơm tạo ra tương tác π-π ổn định cùng với nhiều nhóm hydroxy cần thiết cho hoạt động ức chế HER2.

Có 4 hợp chất có năng lượng liên kết tối ưu hơn TAK-285 là Diplacone (2-(3,4- dihydroxyphenyl)-6-[(2E)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-5,7-dihydroxy-2,3- dihydrochromen-4-on) , [2-(naphthalen-2-ylamino)-2-oxoethyl] 3- (difluoromethoxy)benzoate , Mono-O-acetylbisdemethoxycurcumin , Berberin

Diplacone cho thấy khả năng liên kết tốt với HER2 với điểm số docking là -10,5 kcal/mol và khả năng hấp thu qua ruột đạt 82,56% Tuy nhiên, tính thấm qua hàng rào máu não và hệ thần kinh trung ương của nó thấp do tính ưa lipid kém (LOGP>5) Mặc dù diplacone không gây hại cho hệ thần kinh và thận, hiện chưa có nghiên cứu thực nghiệm nào về tác dụng ức chế HER2 của nó Do đó, cần tiến hành nghiên cứu sâu hơn để đánh giá tác động của diplacone đối với cơ thể người.

4.1.2 [2-(naphthalen-2-ylamino)-2-oxoethyl] 3- (difluoromethoxy)benzoate (ID:4853197)

Hợp chất [2-(naphthalen-2-ylamino)-2-oxoethyl] 3-(difluoromethoxy)benzoate có điểm số docking ấn tượng là -10,4 kcal/mol, cho thấy khả năng liên kết tốt Nó đáp ứng đầy đủ 5 tiêu chí của quy tắc Lipinski, với khả năng hấp thu qua đường ruột đạt 89,534% và thấm tốt qua hệ thần kinh trung ương cũng như hàng rào máu não Tuy nhiên, cần lưu ý rằng hợp chất này có thể gây độc cho gan và ức chế hầu hết các enzym chuyển hóa.

Vì vậy, cần có những nghiên cứu sâu hơn chứng minh các yếu tố nguy cơ của

[2-(naphthalen-2-ylamino)-2-oxoethyl] 3-(difluoromethoxy)benzoate đối với cơ thể

Hợp chất Mono-O-acetylbisdemethoxycurcumin, được chiết xuất từ củ nghệ vàng, cho thấy khả năng liên kết tốt với enzym HER2 và có mức độ hấp thu cao (92,768 qua ruột, tính thấm màng Caco2: 1,075) Hợp chất này đáp ứng đầy đủ cả 5 tiêu chí Lipinski, tuy nhiên, cần lưu ý rằng nó có thể gây độc cho gan và ức chế các chất chuyển hóa.

Hợp chất Berberin, có màu vàng, thường được sử dụng để điều trị nhiễm trùng đường tiêu hóa nhờ khả năng hấp thu tốt (97.147% qua ruột, tính thấm qua màng Caco2 là 1.734) Hợp chất này đáp ứng đầy đủ cả 5 tiêu chí của quy tắc Lipinski, tuy nhiên, cần lưu ý rằng nó có độc tính trên gan và các tác hại khác đối với cơ thể.

Về phương pháp

Việc ứng dụng kỹ thuật sàng lọc ảo in silico trong nghiên cứu và phát triển thuốc đang trở thành xu thế toàn cầu trong ngành dược phẩm nhờ vào nhiều lợi ích so với phương pháp tổng hợp hóa học truyền thống Hiện nay, với sự phát triển của các cơ sở dữ liệu lớn về hợp chất tự nhiên và tổng hợp, việc dự đoán các tính chất dược lý và dược động học trở nên dễ dàng hơn Sàng lọc trên máy tính cho phép xử lý một lượng lớn hợp chất trong cơ sở dữ liệu, từ đó tiết kiệm thời gian, công sức và chi phí nghiên cứu.

Sàng lọc ảo, mặc dù mang lại nhiều lợi ích, nhưng cũng gặp phải một số nhược điểm như việc sử dụng nhiều phễu lọc và phần mềm khác nhau có thể dẫn đến sai số trong quá trình Thêm vào đó, việc xác định chính xác cấu trúc 3D của protein đích và sự khác biệt giữa mô hình và thực tế trong cơ thể người làm cho sàng lọc ảo trở nên khó khăn hơn Do đó, việc phối hợp các kỹ thuật in silico là rất cần thiết trong nghiên cứu và phát triển thuốc.

Docking là một kỹ thuật sàng lọc ảo phổ biến, mô phỏng tương tác giữa protein và phối tử, giúp tìm ra hợp chất tiềm năng và thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc Phân tích năng lượng liên kết và các tương tác từ kết quả docking cho phép xác định sơ bộ hoạt tính ức chế protein của các chất Kỹ thuật này giúp thu hẹp cơ sở dữ liệu, loại bỏ hợp chất không có hoạt tính và lựa chọn các hợp chất có hoạt tính cho các thử nghiệm tiếp theo.

Kết quả docking phụ thuộc vào độ chính xác của phần mềm, và nghiên cứu này đã sử dụng Autodock Vina, một phần mềm học thuật nổi bật với khả năng lấy mẫu và đánh giá điểm chính xác cao hơn so với các phần mềm thương mại Để tăng độ tin cậy của quá trình, mỗi chất được dock ba lần và kết quả trung bình được tính toán.

Về dự đoán đặc tính hóa lý và các thông số ADMET

Việc kết hợp dự đoán tính giống thuốc với các thông số dược động học và độc tính thông qua kỹ thuật docking giúp xác định khả năng trở thành thuốc của các hợp chất, đồng thời giảm bớt gánh nặng cho nghiên cứu thực nghiệm Công cụ pkCSM dự đoán các đặc điểm ADMET dựa trên cấu trúc hóa học, trong đó tính thấm qua tế bào Caco2 là tiêu chuẩn quan trọng cho dược chất đường uống, được FDA khuyến cáo Theo mô hình PkCSM, hợp chất có tính thấm Caco2 cao nếu giá trị dự đoán > 0,9, trong khi phân tử có độ hấp thu dưới 30% được coi là thuốc kém hấp thu Các hợp chất trong nghiên cứu cho thấy khả năng hấp thu tốt qua ruột non, với tỷ lệ hấp thu trên 50%, và một số đạt trên 90% Khối lượng phân phối cao đồng nghĩa với lượng thuốc đến mô nhiều, với giá trị log VDss < -0,15 cho thấy khối lượng phân phối thấp và > 0,45 cho thấy cao.

Giá trị 39 không (BBB) là một chỉ số quan trọng về tính thẩm thấu của hợp chất và khả năng thâm nhập vào hệ thần kinh trung ương (CNS), liên quan đến tính an toàn của dược chất Một hợp chất được xem là không thấm qua hàng rào máu não khi giá trị BBB < -1, trong khi có thể vượt qua nếu giá trị > 0.3 Nếu log PS > -2, hợp chất có khả năng đi vào hệ thần kinh trung ương, ngược lại, nếu giá trị < -3, thì không thể Bên cạnh đó, do hầu hết các loại thuốc được chuyển hóa bởi enzym cytochrom P450, việc xác định khả năng ức chế hệ enzym này là cần thiết để đánh giá ảnh hưởng của chất đó đến dược động học của thuốc dùng kèm.

Chất vận chuyển cation hữu cơ 2 (OCT2) đóng vai trò quan trọng trong việc thải trừ các ion hóa của thuốc và hợp chất nội sinh ở thận, giúp vận chuyển các chất từ máu vào tế bào ống thận Việc xác định liệu một hợp chất có phải là chất nền của OCT2 hay không rất có giá trị trong việc dự đoán kiểu loại bỏ của nó Đánh giá độc tính của các hợp chất là cần thiết để nhận diện nguy cơ và xác định liều lượng an toàn Độc tính AMES được sử dụng để kiểm tra khả năng gây đột biến DNA, có thể dẫn đến ung thư Sự ức chế kênh kali hERG ở tim có thể gây hội chứng QT dài và nguy cơ đột tử, vì vậy cần tránh các chất ức chế hERG Liều gây chết cấp tính (LD50) ở chuột, với liều > 2 mol/kg được coi là an toàn, giúp xác định các hợp chất đáp ứng tiêu chí an toàn này.

Những hạn chế và thách thức trong mô hình nghiên cứu In silico

Nghiên cứu bằng mô hình in silico mang lại lợi ích lớn trong việc tiết kiệm thời gian cho quá trình phát triển thuốc mới Tuy nhiên, vẫn tồn tại những hạn chế nhất định trong phương pháp nghiên cứu này.

Sử dụng nhiều phần mềm yêu cầu hệ điều hành máy tính phải đáp ứng các tiêu chuẩn kỹ thuật Một lỗi nhỏ trong nhập liệu có thể dẫn đến sai lệch trong kết quả nghiên cứu Mô hình in silico cần có cơ sở dữ liệu lớn để hoạt động hiệu quả.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra và có một số kết luận chính như sau:

1 Xây dựng tổ hợp các hợp chất tự nhiên và sang lọc được 4 hợp chất có tác dụng ức chế enzym HER2 bằng kĩ thuật docking phân tử

2 Phân tích đặc tính giống thuốc và đánh giá các thông số ADMET Đã sàng lọc được 4 hợp chất tiềm năng : Diplacone (2-(3,4- dihydroxyphenyl)-6-[(2E)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-5,7-dihydroxy-2,3- dihydrochromen-4-on) (14539948) , [2-(naphthalen-2-ylamino)-2-oxoethyl] 3-

(difluoromethoxy)benzoate (4853197) , Mono-O- acetylbisdemethoxycurcumin (52944954 ) , Berberin (2353) từ 46 hợp chất thiên nhiên gợi ý cho quá trình nghiên cứu thực nghiệm và phát triển thuốc trong tương lai

Để phát triển và nâng cao tính ứng dụng của các kết quả nghiên cứu từ khóa luận, tôi xin đưa ra một số đề xuất quan trọng nhằm tiếp tục khai thác hiệu quả những thành tựu đã đạt được.

1 Cần tiến hành các nghiên cứu sâu hơn để phát triển các hợp chất này thành thuốc điều trị bệnh ung thư vú

2 Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm hoạt tính trên đích của các hợp chất đã sang lọc được trên mô hình in vivo thực tế