VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Địa điểm và thời gian thực hiện nghiên cứu khoa học
Phòng Công nghệ Tế bào thuộc Khoa Công nghệ Sinh học tại Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, tọa lạc ở cơ sở 3, số 68 Lê Thị Trung, Phường Phú Lợi, Thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương.
Đối tƣợng nghiên cứu
Cây Húng chanh được trồng tại vườn thuốc Nam ở cơ sở 3, địa chỉ 68 Lê Thị Trung, Phường Phú Lợi, Thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương, sẽ là nguồn mẫu cho nghiên cứu khảo sát môi trường nhân nhanh Nghiên cứu này nhằm đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và thời gian đến việc héo nguyên liệu và hàm lượng tinh dầu của cây Húng chanh.
Điều kiện nuôi cấy in vitro cây Húng chanh
Sử dụng môi trường nuôi cấy MS cơ bản, bổ sung một số thành phần:
Chất điều hoà tăng trưởng thực vật được bổ sung tuỳ theo mục đ ch th nghiệm, bao gồm: 2,4-D, BA, IAA, kinetin với nồng độ thay đổi
Sử dụng chai thuỷ tinh 500 ml, cho vào mỗi chai 50 ml môi trường, hấp khử trùng ở 121 0 C, 1atm, trong 1giờ 15 phút
Thời gian chiếu sáng : 16 giờ/ ngày
3.3 Hoá chất dùng trong nuôi cấy mô
Các hoá chất pha môi trường nuôi cấy thực vật: MS
Các chất điều hoà tăng trưởng thực vật: (Merck KgaA, 64271 Damstadt, Germany)
Phương pháp
4.1 Ảnh hưởng của nồng độ và thành phần chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự tạo chồi in vitro từ chồi ngủ của cây Húng chanh
Mục đích của thí nghiệm này là khảo sát nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật để xác định môi trường tối ưu cho việc tạo chồi từ đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh.
Vật liệu thí nghiệm: Đoạn chồi ngủ cây Húng chanh
Môi trường MS bổ sung BA kết hợp IAA theo các nồng độ khác nhau theo bảng II.1
Môi trường MS bổ sung Kin kết hợp IAA theo các nồng độ khác nhau theo bảng II.2
Thí nghiệm được thực hiện bằng cách cấy đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh vào môi trường MS có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật Mỗi nghiệm thức bao gồm 3 bình, với mỗi bình chứa 3 mẫu Thiết kế thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.
Thời gian theo dõi: 4 tuần
Chỉ tiêu đánh giá: Số lƣợng, đặc điểm chồi tạo thành từ mẫu chồi ngủ sau 4 tuần nuôi cấy
Bảng II.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp IAA trong quá trình tạo chồi từ đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh
Tên nghiệm thức Nồng độ BA mg/l Nồng độ IAA mg/l
Bảng II.2 Ảnh hưởng của nồng độ Kin kết hợp IAA trong quá trình tạo chồi từ đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh
Tên nghiệm thức Nồng độ Kin mg/l Nồng độ IAA mg/l
4.2 Khảo sát một số yếu tố môi trường ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của chồi in vitro cây Húng chanh
4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính đến sự sinh trưởng của chồi in vitro cây Húng chanh
Mục đích của thí nghiệm là khảo sát ảnh hưởng của nồng độ khác nhau của than hoạt tính đến sự sinh trưởng của chồi in vitro từ đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh, nhằm xác định môi trường tối ưu cho quá trình này.
Vật liệu thí nghiệm: Đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh
Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS bổ sung than hoạt tính theo bảng II.3
Thí nghiệm được thực hiện bằng cách khử mẫu đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh và cấy vào bình môi trường có bổ sung than hoạt tính Mỗi nghiệm thức bao gồm 3 bình, mỗi bình chứa 3 mẫu Thiết kế thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.
Thời gian theo dõi: 4 tuần
Chỉ tiêu đánh giá: chiều cao chồi, đặc điểm chồi
Bảng II.3 Ảnh hưởng của than hoạt tính trong quá trình sinh trưởng của chồi in vitro từ đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh
Tên nghiệm thức Nồng độ than hoạt tính g/l
4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng đến sự sinh trưởng của chồi in vitro cây Húng chanh
Mục đích của thí nghiệm là khảo sát nồng độ khác nhau của khoáng đa lượng để xác định môi trường tối ưu ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chồi in vitro từ đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh.
Vật liệu thí nghiệm: Đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh
Môi trường MS có nồng độ đa lượng thay đổi theo bảng II.4
Môi trường MS có nồng độ đa lượng thay đổi và bổ sung than hoạt tính theo bảng II.5
Trong thí nghiệm này, đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh được khử mẫu và cấy vào bình môi trường với các nồng độ đa lượng khác nhau Mỗi nghiệm thức bao gồm 3 bình, với mỗi bình chứa 3 mẫu Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.
Thời gian theo dõi: 4 tuần
Chỉ tiêu đánh giá: Chiều cao chồi, số lá trên một chồi
Bảng II.4 Ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng đến sự sinh trưởng của chồi in vitro từ đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh
Tên nghiệm thức Nồng độ đa lƣợng
Nồng độ khoáng đa lượng bổ sung than hoạt tính có ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng của chồi in vitro từ đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh Việc điều chỉnh nồng độ khoáng này có thể tối ưu hóa quá trình phát triển và tăng cường khả năng sinh trưởng của chồi, từ đó nâng cao hiệu quả nhân giống cây trồng.
Tên nghiệm thức Nồng độ đa lƣợng Nồng độ than hoạt tính g/l
4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự sinh trưởng chồi in vitro cây Húng chanh
Mục đích của thí nghiệm này là khảo sát nồng độ đường khác nhau để xác định môi trường tối ưu ảnh hưởng đến sự phát triển của chồi in vitro từ đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh.
Vật liệu thí nghiệm: Đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh
Môi trường MS bổ sung nồng độ đường thay đổi theo bảng II.6
Môi trường MS có nồng độ đường thay đổi và bổ sung than hoạt tính theo bảng II.7
Trong thí nghiệm này, đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh được khử mẫu và cấy vào các bình môi trường có bổ sung đường với nồng độ khác nhau Mỗi nghiệm thức bao gồm 3 bình, mỗi bình chứa 3 mẫu Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của kết quả.
Thời gian theo dõi: 4 tuần
Chỉ tiêu đánh giá: Chiều cao chồi, đặc điểm hình thái chồi
Bảng II.6 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự sinh trưởng chồi in vitro từ đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh
Tên nghiệm thức Khối lượng đường g/l
Bảng II.7 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự sinh trưởng chồi in vitro từ đoạn chồi ngủ của cây Húng chanh
Tên nghiệm thức Khối lượng đường g/l Nồng độ than hoạt tính g/l
4.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian để héo nguyên liệu lên hàm lượng tinh dầu Húng chanh
Mục đích thí nghiệm: Khảo sát thời gian để héo nguyên liệu tối ƣu để thu đƣợc hàm lƣợng tinh dầu Húng chanh nhiều nhất
Quy trình thực hiện chung:
Thu hái và xử lí nguyên liệu
Cân nguyên liệu (300 g tươi/ lần chưng cất)
Thời gian để héo: 0 ngày, 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày
Lượng nước: 500 ml/ lần chưng cất
Thời gian chƣng cất: 2,5 giờ
Thu nhận tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước
Xác định khối lƣợng tinh dầu thu nhận đƣợc
Hàm lƣợng tinh dầu đƣợc tính theo công thức:
Làm khan bằng Na 2 SO 4
Xay nhuyễn nguyên liệu Nguyên liệug
Chưng cất bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước
Hỗn hợp tinh dầu + nước
Hình II.1 Quy trình ly trích tinh dầu
Bảng II.8 Ảnh hưởng thời gian để héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Húng chanh
Nghiệm thức Thời gian để héo ( ngày)
Thể tích dung môi (ml)
Khối lƣợng tươi ly tr ch (g)
Thời gian ly trích (giờ)
Chỉ tiêu đánh giá: khối lƣợng tinh dầu thu đƣợc (g)
Hình II.2 Bộ chưng cất tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước
Th nghiệm đƣợc bố tr lặp lại 3 lần
Kết quả thí nghiệm được phân tích bằng phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0, với sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 95% được biểu thị qua các chữ cái kèm theo theo phương pháp phân hạng DUNCAN.
