TỔNG QUAN
Bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình (Familial
1.1.1 Tổng quan về bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình
Familial Hypercholesterolemia (FH) is a hereditary disorder linked to mutations on autosomal chromosomes, affecting genes involved in lipid metabolism in the blood This genetic condition leads to elevated cholesterol levels, increasing the risk of cardiovascular diseases Understanding FH is crucial for early diagnosis and management to prevent severe health complications.
Familial hypercholesterolemia is characterized by two main forms: Autosomal Dominant Hypercholesterolemia (ADH), which is a dominant trait linked to autosomes, and Autosomal Recessive Hypercholesterolemia (ARH), which is a recessive trait also associated with autosomes.
Bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình (FH) được phân loại thành hai thể: đồng hợp (Homozygous Familial Hypercholesterolemia - HoFH) và dị hợp (Heterozygous Familial Hypercholesterolemia - HeFH) Tần suất mắc bệnh FH thể đồng hợp là 1/1.000.000, trong khi thể dị hợp có tần suất dao động từ 1/200 đến 1/500 (Austin et al., 2004; Khachadurian et al., 1964; Wang et al., 2014; Akioyamen et al.).
Bệnh FH dạng ADH chủ yếu do đột biến ở các gen quan trọng liên quan đến chuyển hóa lipid, bao gồm LDLR (Receptor Lipoprotein Thấp), ApoB (Apolipoprotein B) và PCSK9 (Proprotein Convertase).
Subtilisin/Kexin 9) (Sjouke et al., 2014) Công bố khoa học của Solberg và cộng sự
Năm 1994, các nhà nghiên cứu xác định rằng nguyên nhân gây bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình là do các đột biến sai nghĩa trên gen LDLR Đồng thời, công bố khoa học của Whitfield và cộng sự vào năm 2004 đã ghi nhận sự xuất hiện của các đột biến trên gen ApoB, dẫn đến thể khiếm khuyết.
ApoB là một loại protein có chức năng bị rối loạn, không thể tương tác hiệu quả với thụ thể LDL Điều này dẫn đến việc giảm khả năng loại thải cholesterol, làm tăng nồng độ LDL-C trong máu.
Nguyên nhân gây rối loạn cholesterol trong máu, bao gồm cao cholesterol, có thể do nhiều yếu tố như giới tính, tuổi tác, môi trường sống và lối sống, bao gồm các thói quen hàng ngày.
6 sinh hoạt, chế độ dinh dưỡng,…) và một số bệnh lý khác: tiểu đường, béo phì,…, (Whitfield et al., 2004)
1.1.2 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH
Currently, patients with Familial Hypercholesterolemia (FH) are diagnosed based on criteria established by the Dutch Lipid Clinic Network (DLCN), Simon Broome, and the US Make Early Diagnoses Prevent Early Deaths Program (MEDPED) (Damgaard et al., 2005) Detailed information on the lipid concentration analysis criteria for diagnosing FH from these organizations can be found in Appendices 1.1 (Nordestgaard et al., 2013), 1.2 (Henderson et al., 2016), and 1.3 (Pecin et al., 2017).
Tổng quan gen mục tiêu
1.2.1 Gen Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR)
Gen LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor) định vị trên nhiễm sắc thể số 19:
19p13.1 - 19p13.3 (Francke et al., 1984), có kích thước là 45.000 bp, gồm 18 exon và
17 intron mã hóa cho một glycoprotein (Sudhof et al., 1985 ) (Hình 1.1)
Hình 1.1 Gen LDLR định vị trên nhiễm sắc thể 19
LDLR is a glycoprotein expressed on the surface of liver cells, which interacts with ApoB-100 protein to form a complex with LDL Composed of 843 amino acids, LDLR contains functional domains corresponding to specific sequences on the LDLR gene.
Exon 1 mã hóa các peptide tín hiệu: 21 amino acid
Exon 2 - 6 mã hóa vùng gắn phối tử: 40 amino acid
Exon 7 - 14 yếu tố tăng trưởng biểu bì: 400 amino acid
Exon 15 đính kèm với chuỗi carbohydrate O: 58 amino acid
Exon 16 và 41 bp của exon 17 vùng gắn LDLR vào màng tế bào: 22 amino acid
Phần còn lại exon 17 và exon 18 vùng tế bào chất: 50 amino acid
Gen ApoB (Apolipoprotein B) có kích thước khoảng 43 kb và bao gồm 29 exon, được định vị trên vùng cánh tay ngắn của nhiễm sắc thể số 2 tại vị trí 2p23-24 (NCBI) Gen này mã hóa cho hai loại protein là ApoB–100 và ApoB–48, đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành phức hợp giữa Low Density Lipoprotein (LDL) và thụ thể Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR) (Chen et al., 1986) Protein ApoB hoạt động như một phối tử (Ligand) gắn trực tiếp với thụ thể LDLR trong quá trình nhập bào (Vrablik et al., 2001).
Hình 1.2 Gen ApoB định vị trên nhiễm sắc thể 2
Apolipoprotein B-100 có một dạng khiếm khuyết di truyền, được gọi là Familial defective Apolipoprotein B–100 (FDB), dẫn đến nồng độ cholesterol trong máu tăng cao (Hypercholesterolemia) Nguyên nhân chủ yếu của tình trạng này là do các đột biến xảy ra trong hoặc xung quanh codon 3500 của gen Apolipoprotein (ApoB), gen này mã hóa cho protein Apolipoprotein B.
Đột biến trên gen ApoB-100 dẫn đến thay đổi cấu trúc protein ApoB-100, ngăn cản sự gắn kết của protein này với thụ thể LDLR Hệ quả là giảm hấp thu LDL vào tế bào, gây ra nồng độ cholesterol cao bất thường trong máu.
1.2.3 Gen Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin-9 (PCSK9)
According to the Genecards database, the PCSK9 gene (Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin-9) is located on chromosome 1 at position 1p32.3 and spans 3,617 base pairs, consisting of 12 exons (Abifadel et al., 2003).
Hình 1.3 Gen PCSK9 định vị trên nhiễm sắc thể số 1
(Nguồn:http://www.genecards.org/) Gen PCSK9 mã hóa protein PCSK9 hay còn gọi là NARC-1 (Benjannet et al., 2004)
Protein PCSK9 đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa cholesterol và acid béo tại gan, ruột và mô thận Nó tham gia vào cơ chế gắn kết với thụ thể LDLR, đồng thời ảnh hưởng đến sự thoái biến của protein ApoB trong lysosome (Poirier et al., 2008).
Tình hình nghiên cứu tính chất đột biến điểm trên gen LDLR, gen ApoB và
và gen PCSK9 liên quan đến bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình
Tổng số đột biến thường gặp trên gen LDLR, liên quan đến bệnh FH, ước tính khoảng 1700 đột biến, theo hệ thống dữ liệu trực tuyến LOVD.
(Hartgers et al., 2015) Nhiều công bố khoa học ghi nhận tính chất đột biến nổi trội trên gen LDLR tập trung trên exon 4 (tài liệu tham khảo)
Nghiên cứu cho thấy bệnh FH chủ yếu do các đột biến nổi trội trên exon 4 của gen LDLR, đặc biệt phổ biến trong quần thể người Đức.
(Bochmann et al., 2001) quần thể người Hàn Quốc (Han et al., 2015), trên quần thể người Trung Quốc (Fan et al., 2016) với tỷ lệ lần lượt là 2,13%, 11,59% và 10%
Đột biến nổi trội trên gen ApoB thường xảy ra ở exon 26, đặc biệt là dạng đột biến R3500Q/R3527Q, được ghi nhận trong các nghiên cứu của Chmara và cộng sự (2010), Pandey và cộng sự (2016), Sharifi và cộng sự (2017) Tỷ lệ đột biến này ở quần thể người bệnh cao cholesterol tại châu Âu là 6,61% ở Ba Lan, 40% ở Anh và 8,07% ở các khu vực khác.
Theo nghiên cứu của Henderson và cộng sự (2016), đột biến điểm trên gen PCSK9 ảnh hưởng đến chức năng của protein này, dẫn đến bệnh lý cao cholesterol trong máu Các dạng đột biến nổi trội trên gen PCSK9 đã được ghi nhận trong nghiên cứu của Burnett và Hooper.
Trong nghiên cứu năm 2008, các đột biến gen PCSK9 được xác định bao gồm S127R, D129G, F216L, D374Y, N425S và R496W Tỷ lệ xuất hiện các đột biến này trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân mắc bệnh FH được báo cáo bởi Ahmed và cộng sự (2013) là 18,18%, trong khi Mayne và cộng sự (2013) ghi nhận tỷ lệ này là 25,58%.
Phương pháp xác định tính chất đột biến điểm trên gen LDLR, gen ApoB và
Phương pháp PCR kết hợp giải trình tự (PCR - Sequencing) cho phép xác định trình tự nucleotide trên gen mục tiêu, giúp phát hiện các đột biến đã được công bố và đột biến mới liên quan đến các bệnh di truyền, đặc biệt là bệnh FH (Koivisto et al., 1995; Mahdieh et al., 2013) Nghiên cứu của Du và cộng sự (2016) đã sử dụng phương pháp này để xác định tỷ lệ đột biến trên gen LDLR và gen ApoB ở bệnh nhân FH người Trung Quốc, với kết quả lần lượt là 81,82% và 9,09% Tương tự, nghiên cứu của Yang và cộng sự (2007) tại Đài Loan ghi nhận tỷ lệ đột biến trên gen LDLR và gen ApoB là 86,4% và 13,3% bằng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự.
Năm 2017, nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đột biến R3500Q trên exon 26 của gen ApoB đạt 68% trong số 40 bệnh nhân FH người Việt Nam thông qua phương pháp PCR kết hợp giải trình tự Trong khi đó, nghiên cứu của Mayne và cộng sự (2013) phát hiện có 25,58% trường hợp đột biến trên gen PCSK9 cũng bằng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự Tương tự, Tada và cộng sự (2016) ghi nhận tỷ lệ đột biến trên gen PCSK9 là 17,5% ở nhóm người Nhật Bản.
VẬT LIỆU
Các công cụ Tin Sinh học
Các công cụ trực tuyến
NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
Google Scholar (https://scholar.google.com.vn/)
GeneCards (http://www.genecards.org/)
Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)
BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
Oligo analyzer IDT 3.1 (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer)
Bộ mẫu bệnh phẩm
Thực hiện quy trình PCR - giải trình tựphát hiện đột biến trên gen LDLR, gen ApoB–
100 và gen PCSK9 trên 4 mẫu bệnh phẩm có chỉ số cao cholesterol trong máu kí hiệu là M1, M2, M3 và M4
PHƯƠNG PHÁP
Khai thác dữ liệu (Data- mining)
Thu thập bộ dữ liệu khoa học:
Khai thác dữ liệu khoa học trên nguồn dữ liệu PubMeb, PubMeb central (PMC) thuộc NCBI và các nguồn dữ liệu trực tuyến khác (EMBL, Google, …)
Sử dụng một số từ khóa thu thập bộ dữ liệu về đặc điểm phân tử bệnh FH: LDLR,
LDLR receptor, Cholesterol, Familial Hypercholesterolemia (FH), hypercholesterolemia, Familial defective apolipoprotein B100 (FDB), Autosomal Dominant Hypercholesterolemia (ADH), PCSK9…
Tình hình mắc bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình (FH, FDB) trên thế giới và ở Việt Nam
Tình hình mắc bệnh tim mạch do mắc bệnh lý cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình (FH, FDB) trên thế giới và ở Việt Nam
Phương pháp sinh học phân tử, bao gồm PCR kết hợp với giải trình tự và AS-PCR, là công cụ hiệu quả để xác định đột biến điểm trên các gen ApoB, LDLR và PCSK9 Phương pháp này được áp dụng cho các quần thể người bệnh FH trên toàn cầu, đặc biệt là ở khu vực châu Á, Đông Nam Á và Việt Nam.
Tổng hợp và phân tích tần suất các đột biến điểm nổi trội trên gen LDLR, gen ApoB và gen PCSK9 ở người mắc bệnh FH và bệnh tim mạch, sử dụng các công cụ thống kê phù hợp để cung cấp thông tin chính xác và hữu ích.
Phân tích tổng hợp (Meta - analysis)
Phương pháp phân tích tổng hợp (meta-analysis) là kỹ thuật thống kê dùng để tổng hợp kết quả từ các nghiên cứu độc lập, được Karl Pearson thực hiện lần đầu vào năm 1904 nhằm kiểm tra hiệu quả của việc tiêm ngừa bệnh thương hàn Phương pháp này đã được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu khoa học (Field et al., 2010; Egger et al., 1997).
Phương pháp này xác định mối liên hệ giữa các đột biến trên gen ApoB, gen LDLR và gen PCSK9 với nguy cơ mắc bệnh cholesterol cao có tính chất gia đình Sự tương quan này được đánh giá thông qua các tham số định lượng, đặc biệt là chỉ số "Proportion" (PR%), giúp làm rõ mức độ ảnh hưởng của các gen này đến bệnh lý.
12 tin cậy 95% (Confidence intervals - CIs), phản ánh mức độ xuất hiện đột biến trên gen
LDLR, gen ApoB và gen PCSK9 trên bộ mẫu bệnh phẩm có chỉ số cholesterol cao trong máu
Công cụ phân tích thống kê: Phần mềm Medcalc® (phiên bản v17)
Do đó, chúng tôi chọn mô hình phân tích tổng hợp ảnh hưởng bất biến hoặc ngẫu nhiên theo tiêu chí hướng dẫn của Cochrane và cộng sự (2014).
Khảo sát thực nghiệm
Nghiên cứu này xác định mối liên hệ giữa các đột biến điểm nổi trội trên các vùng exon của gen LDLR, gen ApoB và gen PCSK9 với nguy cơ mắc bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình ở người Việt Nam Thông qua các nội dung thực nghiệm, chúng tôi đã phân tích sự tương quan giữa các biến thể gen và khả năng phát triển bệnh, nhằm cung cấp cái nhìn sâu sắc về di truyền học và sức khỏe cộng đồng.
3.3.1 Tách chiết DNA bộ gen của bộ mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) bằng phương pháp Phenol/Chloroform (Chomczynski & Sacchi, 1987)
- Thu nhận 50μl mẫu bệnh phẩm vào một eppendorf (1,5 ml)
- Bổ sung 500àl dung dịch ly giải, gồm cú NaCl 0,45M, Tris HCl 10mM (pH=8,2), EDTA 1M (pH=8), SDS 10%
- Bổ sung 5μl proteinase K (20 mg/ml), trộn đều Ủ ở nhiệt độ 56 o C trong 1 giờ
- Bổ sung một thể tích dung dịch phenol: chloroform (tỉ lệ 1:1), trộn đều Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13.000 vòng/phút trong 3 phút và thu dịch nổi
- Bổ sung một thể tích Chloroform tương đương với thể tích mẫu Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13.000 vòng/ phút trong 3 phút và thu dịch nổi
- Bổ sung 0,25 lần thể tích Amonium Acetate 5M và 2,5 lần thể tích Ethanol tuyệt đối (trữ lạnh) Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 o C và thu tủa
- Bổ sung một thể tích Ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 o C
- Thu cắn, xử lý để làm khô mẫu DNA bộ gen và bảo quản trong 20 - 50 μl dung dịch Tris-EDTA (pH8), ở -20 o C
3.3.2 Xác định chất lượng DNA bộ gen bằng phương pháp đo quang phổ: Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260nm
- Độ tinh sạch của DNA đƣợc đánh giá qua tỷ lệ A260/A280 DNA thu nhận đã tinh sạch khi giá trị này dao động từ 1,8 – 2
- Công thức xác định nồng độ DNA:
C: giá trị nồng độ DNA (μg/ml) A260: độ hấp thụ của dung dịch DNA ở bước sóng 260 nm A280: độ hấp thụ cực đại của protein ở bước sóng 280 nm d: độ pha loãng (thường từ 30-50 lần)
3.3.3 Thực hiện PCR khuếch đại vùng gen mục tiêu
3.3.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%
- Chuẩn bị khuôn gel và đun gel tan
- Rót gel vào khuôn, chờ gel đông, rút lƣợc
- Đọc kết quả bằng máy đọc gel (Gel Doc XR, BioRad)
Giải trình tự sản phẩm PCR và phân tích đặc điểm phân tử của các gen mục tiêu trên mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân Việt Nam bằng các công cụ tin sinh học hiện đại Việc này giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc gen và mối liên hệ với các bệnh lý, từ đó hỗ trợ trong việc chẩn đoán và điều trị hiệu quả.
Xác định sự tương quan giữa đặc điểm phân tử (đột biến điểm nổi trội) của gen
LDLR, gen ApoB, gen PCSK9 và bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình trên người bệnh Việt Nam dựa trên kết quả phân tích giải trình tự.
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
Kết quả phân tích tổng hợp tính chất đột biến điểm trên gen mục tiêu
Dựa trên 20 công bố khoa học liên quan đến gen LDLR, 17 công bố về gen ApoB và 12 công bố về gen PCSK9, chúng tôi tiến hành phân tích tổng hợp để xác định chỉ số tỷ lệ (Proportion - PR%) phản ánh sự xuất hiện của các tính chất đột biến trên gen LDLR.
ApoB và gen PCSK9 trên người bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình
(FH, FDB) trên thế giới và ở Việt Nam.
4.1.1 Phân tích tổng hợp về tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR đối với bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình
Bộ dữ liệu khoa học gồm 20 công bố đã được phân tích để đánh giá mối tương quan giữa đột biến gen LDLR và bệnh cao cholesterol trong máu (cholesterol > 190mg/dL) (Khera et al., 2016) Kết quả cho thấy tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR có tính bất đồng nhất với I² = 98,09% (P < 0,0001) Chỉ số Proportion được xác định thông qua mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model, R), với tỷ lệ đột biến điểm trên gen LDLR ở bệnh nhân cao cholesterol toàn cầu khoảng 51,936 (khoảng tin cậy 95% CI: 35,264 - 68,389; P < 0,0001) Các kết quả chi tiết được trình bày trong Phụ lục 4.1, 4.2 và các hình ảnh, bảng liên quan.
Hình 4.1 Đồ thị “Forest plot” biểu thị tỷ lệ đột biến gen LDLR trên bộ mẫu bệnh phẩm FH
Đồ thị “Funnel plot” trong hình 4.2 được sử dụng để đánh giá tính bất đồng nhất của bộ dữ liệu đoàn hệ khi phân tích tỷ lệ đột biến gen LDLR trên mẫu bệnh phẩm bệnh nhân FH.
Mặc dù tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR ở bệnh nhân cao cholesterol trong máu đạt khoảng 51,936%, nhưng để làm rõ mối tương quan giữa tính chất đột biến này và bệnh cao cholesterol, chúng tôi đã xác định chỉ số Proportion dựa trên một số yếu tố đặc trưng như chủng tộc, phương pháp nghiên cứu và exon.
Nghiên cứu về chủng tộc của bệnh nhân mắc bệnh cao cholesterol trong máu cho thấy tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR ở các nhóm bệnh nhân châu Á, châu Âu và châu Mỹ lần lượt là 56,79% (95% CI: 35,562 - 76,787), 50,33% (95% CI: 25,026 - 75,544) và 46,231% (95% CI: 29,990 - 62,894) Kết quả này cho thấy sự khác biệt trong sự xuất hiện đột biến gen giữa các chủng tộc.
LDLR có tỷ lệ cao hơn ở nhóm bệnh nhân châu Á so với nhóm bệnh nhân châu Âu và châu Mỹ (Bảng 4.1)
Chỉ số Proportion cho thấy tính chất đột biến trên gen LDLR ở bệnh nhân cao cholesterol trong máu, được phân tích bằng phương pháp PCR - giải trình tự và các kỹ thuật sinh học phân tử khác như SSCP, RT-PCR, và Multiplex PCR Cụ thể, chỉ số Proportion lần lượt là 56,25 (95% CI: 30,374 - 80,420) và 51,19 (95% CI: 30,686 - 71,487), như trình bày trong Bảng 4.1 Điều này phản ánh tính phổ biến và khả năng áp dụng của PCR - giải trình tự trong việc phân tích tính chất đột biến trên gen LDLR.
Để sử dụng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự hiệu quả, cần xác định cụ thể các vùng exon có nhiều đột biến nổi trội liên quan đến bệnh FH trên thế giới và trong quần thể người bệnh châu Á, do 16 trải dài trên 18 exon.
Bảng 4.1 Kết quả phân tích tính chất đột biến điểm của gen LDLR từ các công trình nghiên cứu đoàn hệ
Phân tích tính bất đồng nhất Chỉ số N Chỉ số Proportion (95% CI) Mô hình P H I 2 (%) Tổng cộng 20 51,936 (95%CI:35,264-68,389) R < 0,0001 98,09
Người châu Á 6 56,79 (35,562 - 76,787) R 0,0002 79,22 Người châu Âu 10 50,33 (25,026 - 75,544) R < 0,0001 99,46 Người châu Mỹ 4 46,231(29,990 - 62,894) R 0,0007 82,39
PCR-giải trình tự 18 56,25 (30,374 - 80,420) R < 0,0001 98,64 Khác 5 51,19 (30,686 - 71,487) R < 0,0001 98,64
Chú thích: R: Random effects model (mô hình phân tích tổng hợp ngẫu nhiên); F: Fixed effects model (mô hình phân tích tổng hợp bất biến)
Xét về yếu tố đột biến nổi trội trên gen LDLR, chỉ số ―Proportion‖ trên các exon gen
LDLR thể hiện ở Bảng 4.2 Chỉ số Proportion thuộc exon 4 và 12 trên gen LDLR lần lƣợt là 8,494 (95% CI: 5,654 - 11,848; mô hình R) và 12,972 (95% CI: 5,114 - 23,727; mô hình R)
Các nghiên cứu của Bochmann và cộng sự (2001), Diakou và cộng sự (2011), Varret và cộng sự (2012) đã chỉ ra rằng exon 4 của gen LDLR có nhiều dạng đột biến điểm phổ biến, gây rối loạn chuyển hóa cholesterol trong máu Những đột biến này đã được cập nhật trong cơ sở dữ liệu UCL Nghiên cứu này nhằm phân tích các đặc điểm của những đột biến điểm trên gen LDLR ở bệnh nhân cao cholesterol trong máu tại châu Á, đặc biệt là ở Việt Nam.
Bảng 4.2 Kết quả phân tích tính chất đột biến điểm của một số exon thuộc gen
Phân tích ảnh hưởng Tính bất đồng nhất Exon Chỉ số Proportion (95% CI) Mô hình P H I 2 (%)
Chú thích: R: Random effects model (mô hình phân tích tổng hợp ngẫu nhiên); F: Fixed effects model (mô hình phân tích tổng hợp bất biến)
4.1.2 Phân tích tổng hợp về tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen ApoB đối với bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình
Dựa trên 17 công bố khoa học, nghiên cứu phân tích mối tương quan giữa đột biến gen ApoB và bệnh cao cholesterol trong máu, với mức cholesterol vượt quá 190mg/dL (Khera et al., 2016) Kết quả cho thấy tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen ApoB có tính bất đồng nhất cao (I² = 97,12%, P < 0,0001) Chỉ số Proportion được xác định thông qua mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên, với tỷ lệ đột biến trên gen ApoB ở bệnh nhân cao cholesterol toàn cầu khoảng 14,785 (khoảng tin cậy 95% CI: 9,636 – 20,812; P < 0,0001) Các kết quả chi tiết được trình bày trong Phụ lục 4.5, 4.6, Hình 4.3, Hình 4.4 và Bảng 4.2.
Hình 4.3 Đồ thị “Forest plot” biểu thị tỷ lệ đột biến gen ApoB trên bộ mẫu bệnh phẩm FH
Đồ thị "Funnel plot" là công cụ hữu ích để đánh giá tính bất đồng nhất của dữ liệu trong nghiên cứu tỷ lệ đột biến gen ApoB trên mẫu bệnh phẩm FH Việc phân tích này giúp xác định sự đồng nhất trong các nghiên cứu và cung cấp cái nhìn sâu sắc về các biến thể gen trong quần thể nghiên cứu.
Mặc dù tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen ApoB ở bệnh nhân cao cholesterol trong máu đạt khoảng 14,785, nghiên cứu này nhằm làm rõ mối tương quan giữa đột biến gen ApoB và bệnh lý này Chúng tôi xác định chỉ số Proportion dựa trên các yếu tố đặc trưng như phương pháp nghiên cứu, dạng đột biến và chủng tộc, để hiểu rõ hơn về tính chất của đột biến gen ApoB liên quan đến bệnh cao cholesterol.
Nghiên cứu về tính chất đột biến trên gen ApoB ở bệnh nhân cao cholesterol trong máu cho thấy tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm là 10,64 (95% CI: 6,462 - 15,708; mô hình R) và 35,427 (95% CI: 10,912 - 65,063; mô hình R) thông qua phương pháp PCR - giải trình tự Kết quả này khẳng định PCR - giải trình tự là một trong những phương pháp phổ biến để phân tích đột biến gen ApoB.
Nghiên cứu về chủng tộc của bệnh nhân mắc bệnh cao cholesterol trong máu cho thấy tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen ApoB ở các nhóm châu Á, châu Âu và châu Mỹ lần lượt là 23,697 (95% CI: 0,351 – 66,877; mô hình R), 13,544 (95% CI: 7,822 - 20,534; mô hình R) và 7,182 (95% CI: 2,928 - 13,132; mô hình F) Kết quả này cho thấy sự khác biệt đáng kể trong tỷ lệ đột biến gen ApoB giữa các chủng tộc.
ApoB có tỷ lệ cao hơn ở nhóm bệnh nhân châu Á so với nhóm bệnh nhân châu Âu và châu Mỹ (Bảng 4.3)
Một số dạng đột biến nổi bật trên gen ApoB đã được nghiên cứu và công bố trong các tài liệu khoa học của Kalina và cộng sự (2001), Tosi và cộng sự (2006), Yang và cộng sự (2007), Al-Allaf và cộng sự (2017), Tichý và cộng sự (2012), Du và cộng sự (2016), và Pecin và cộng sự Các nghiên cứu này cung cấp cái nhìn sâu sắc về vai trò của gen ApoB trong các bệnh lý liên quan đến lipid máu và sức khỏe tim mạch.
Nghiên cứu của Xiang và cộng sự (2017) cùng với Bertolini và cộng sự (2013) chỉ ra rằng các đột biến R3500Q, R3527Q, R3500W, R3527W, R3531C và R3558C thường gặp ở bệnh nhân có mức cholesterol cao Đặc biệt, chỉ số "Proportion" cho thấy tỷ lệ xuất hiện của đột biến R3527Q/R3500Q trên exon 26 của gen ApoB đạt 14,926 (95% CI).
9,485 - 21,345; mô hình R), mô tả ở Bảng 4.3 và Phụ lục 4.8
Bảng 4.3 Kết quả phân tích sự tương quan giữa tỷ lệ đột biến trên gen ApoB và bệnh FH từ các công bố khoa học đoàn hệ
Phân tích tính bất đồng nhất Chỉ số N Chỉ số Proportion (95% CI) Mô hình P H I 2 (%) Tổng cộng 17 14,785(9.636 - 20.812) R < 0,0001 96,52%
Người châu Á 3 23,697 (0,351 - 66,877) R < 0,0001 97,28 Người châu Âu 11 13,544 (7,822 - 20,534) R < 0,0001 97,31 Người châu Mỹ 2 7,182 (2,928 - 13,132) F = 0,9775 0,00
Người châu Phi NA NA NA NA NA
Chú thích: R: Random effects model (mô hình phân tích tổng hợp ngẫu nhiên); F: Fixed effects model (mô hình phân tích tổng hợp bất biến)
4.1.3 Phân tích tổng hợp về tỷ lệ xuất hiện đột biến điểm trên gen PCSK9 đối với bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình
Kết quả khảo sát thực nghiệm phân tích tính chất đột biến điểm trên gen LDLR, gen ApoB và gen PCSK9
4.2.1 Kết quả tách chiết DNA
Mẫu bệnh phẩm máu của bệnh nhân có mức cholesterol cao đã được thu thập từ một số bệnh viện tại Thành phố Hồ Chí Minh Các mẫu này được xử lý và tách chiết DNA bộ gen bằng phương pháp phenol/chloroform theo nghiên cứu của Chomczynski & Sacchi.
Exon Phân tích ảnh hưởng Tính bất đồng nhất
1987) Chất lượng DNA bộ gen được kiểm tra theo phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 260nm và 280nm Các mẫu bệnh phẩm cho chỉ số OD 260/280 trong khoảng 1,8
- 2 sẽ đƣợc đƣa vào phản ứng PCR khuếch đại vùng gen mục tiêu: LDLR, ApoB, PCSK9
4.2.2 Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng gen mục tiêu: LDLR, ApoB, PCSK9
Bảng 4.6 Thông tin bộ mồi khuếch đại vùng gen mục tiêu: LDLR, ApoB, PCSK9
Tài liệu tham khảo Trình tự
Kích thước sản phẩm (bp)
- Phản ứng PCR khuếch đại trình tự exon 4 gen LDLR
Theo nghiên cứu của Gudnason và cộng sự (1993), phản ứng PCR sử dụng cặp mồi F1-R1 được thực hiện ở nhiệt độ lai 59°C để khuếch đại trình tự exon 4 của gen LDLR từ các mẫu bệnh phẩm M1, M2, M3 và M4 Kết quả PCR sau đó được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%, với các giếng 1, 2, 3 và 4 tương ứng với các mẫu M1, M2, M3 và M4.
Sản phẩm khuếch đại trình tự exon 4 gen LDLR của mẫu M1 hiển thị băng sáng, rõ ràng với kích thước dự kiến 405 bp, do đó chúng tôi đã gửi giải trình tự sản phẩm PCR của mẫu M1.
Sản phẩm khuếch đại exon 4 gen LDLR từ mẫu M3 và M4 cho thấy băng kí sinh lớn hơn 405 bp, trong khi mẫu M2 không có tín hiệu sản phẩm Do đó, cần thực hiện lại phản ứng PCR trên DNA bộ gen của mẫu bệnh phẩm này trong điều kiện tối ưu, bao gồm cả lượng và chất lượng DNA bản mẫu.
- Phản ứng PCR khuếch đại trình tự exon 26 gen ApoB
Theo nghiên cứu của Truong và cộng sự (2017), phản ứng PCR sử dụng cặp mồi F2-R2 đã được thực hiện ở nhiệt độ lai 54 o C để khuếch đại trình tự exon 26 của gen ApoB từ các mẫu bệnh phẩm M1, M2, M3 và M4 Kết quả của quá trình PCR đã được phân tích chi tiết.
25 phương pháp điện di trên gel agarose 1,5% (Hình 4.7-B) ở các giếng 5,6,7 và 8 tương ứng với mẫu M1, M2, M3 và M4
Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 26 gen ApoB trên mẫu M2 cho tín hiệu mờ hơn so với các mẫu M1, M3 và M4 Điều này tương đồng với kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 4 gen LDLR của mẫu M2 Mặc dù vậy, tất cả bốn mẫu (M1, M2, M3 và M4) đều cho băng sản phẩm có kích thước như dự kiến.
(334 bp) Do đó, chúng tôi tiến hành gửi giải trình tự 4 sản phẩm PCR này
- Phản ứng PCR khuếch đại trình tự exon 2 gen PCSK9
Theo công bố khoa học của Leren và cộng sự (2004), phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi F3-R3 ở nhiệt độ lai 58 °C nhằm khuếch đại trình tự exon 2 của gen PCSK9 từ các mẫu bệnh phẩm M1, M2, M3 và M4 Kết quả PCR được phân tích qua phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%, với các giếng 9, 10, 11 và 12 tương ứng với các mẫu M1, M2, M3 và M4.
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy các mẫu M1, M2, M3 và M4 đều cho băng sản phẩm có kích thước như dự kiến là 477 bp, tương ứng với exon 4 gen LDLR và exon 26 gen ApoB Tuy nhiên, mẫu M2 cho tín hiệu mờ ở exon 2 gen PCSK9 Do đó, chúng tôi đã tiến hành gửi giải trình tự cho 4 sản phẩm PCR của các mẫu này.
Hình 4.7 Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng gen LDLR- hình 4.7-A, gen
ApoB -hình 4.7-B, gen PCSK9 -hình 4.7-C
Chú thích: thể hiện ở phụ lục 4.10
4.2.3 Kết quả giải trình tự
Do hạn chế về thời gian hoàn thành nghiên cứu khoa học, chúng tôi vẫn chưa nhận được kết quả giải trình tự cho sản phẩm khuếch đại exon 4 của gen.
Mẫu M1 cho thấy sự hạn chế trong nghiên cứu về gen LDLR Nếu có điều kiện, chúng tôi sẽ tiến hành phân tích đồng thời tính chất đột biến trên các gen LDLR, ApoB và PCSK9 trong bộ mẫu này để có cái nhìn toàn diện hơn.
Nghiên cứu tại Việt Nam sẽ tiến hành phân tích 26 bệnh phẩm, dự kiến thu thập từ 4-10 mẫu, nhằm làm rõ mối liên hệ giữa các đột biến điểm trong trình tự gen mục tiêu và bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình ở bệnh nhân người Việt Nam.
Chúng tôi đã sử dụng công cụ tin sinh học Chromas phiên bản 2.6.5 và CLC Main Workbench phiên bản 8.0.1 để xác định các biến thể trên trình tự exon 26 của gen ApoB và exon 2 của gen PCSK9 Kết quả phân tích được trình bày trong bảng 4.7.
Bảng 4.7 Kết quả xác định các vị trí biến thể xuất hiện trên một số mẫu bệnh phẩm
Vị trí trên trình tự tham chiếu
Vị trí trên sản phẩm giải trình tự
Trong nghiên cứu về gen ApoB, mẫu M4 ghi nhận mất một nucleotide C, trong khi các mẫu M2 và M3 không có biến thể/đột biến nào trên exon 26 Tất cả bốn mẫu bệnh phẩm đều cho thấy sự xuất hiện của các biến thể mất nucleotide, thay thế nucleotide hoặc chèn thêm nucleotide trong vùng intron giữa exon 1 và exon 2, nhưng chưa phát hiện biến thể nào trên exon 2 Cụ thể, mẫu M1 có biến thể c.10610delA và c.10652delA trên exon 26, trong khi mẫu M4 ghi nhận biến thể c.10608^10607insT, theo trình tự tham chiếu NM_000384.2, với kết quả chi tiết được thể hiện trong phụ lục 4.11 và 4.12.
Chúng tôi đã ghi nhận biến thể ở mẫu M1, cụ thể là vị trí c.9264delC và c.19512delG, dựa trên trình tự tham chiếu NG_009061.1, tập trung vào exon 2 và vùng intron giữa exon 1 và exon 2.
Mẫu M2 có các biến thể c.9264delC, c.9270delA và c.9290^929insA, trong khi mẫu M3 và M4 đều có biến thể c.9264delC Các kết quả chi tiết được trình bày trong phụ lục 4.13 - 4.16.
