Ứng dụng kỹ thuật as real time pcr nhằm phát hiện một số đột biến nổi trội trên gene k ras đích nhắm trong điều trị ung thư đại trực tràng nghiên cứu khoa học

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

VẬT LIỆU

Mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong phân tích được cung cấp từ Bệnh viện Đa khoa Tây Ninh, bao gồm sinh thiết mô ung thư đại trực tràng Tiêu chuẩn chọn mẫu dựa trên hiển vi quang học, và các mẫu này được đúc trong paraffin với thời gian thu thập từ tháng 1/2007 đến tháng 5/2011 Để đảm bảo chất lượng, các mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -20°C trước khi tiến hành tách chiết DNA.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico

We conducted data mining on PubMed using keywords such as colorectal cancer, mutated K-ras gene, mutation in colorectal cancer, and molecular targeted therapy.

Khi lựa chọn bài báo để thống kê số liệu, tiêu chuẩn chính là độ tin cậy của tạp chí đăng tải và sự liên quan đến các nghiên cứu thực nghiệm về đột biến gen K-ras Các bài báo chỉ mang tính tổng quan hoặc thống kê mà không thực hiện thí nghiệm sẽ không được sử dụng.

Chúng tôi áp dụng phương pháp thống kê tần số trung bình có trọng số để loại bỏ những yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả thống kê, như phương pháp thực nghiệm khác nhau, nguồn gốc mẫu bệnh nhân khác nhau và thời gian khác nhau Đồng thời, chúng tôi sử dụng phân tích phương sai ANOVA để đánh giá mối quan hệ giữa các kiểu đột biến và yếu tố chủng tộc.

Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc gen:

Trình tự nucleotide và cấu trúc gen K-ras được lấy từ ngân hàng gen NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) thông qua mã số truy cập NC_000012.11.

Phương pháp đánh giá – thiết kế mồi:

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế mồi và mẫu dò cho phản ứng dò đột biến bằng phương pháp AS-Real-time PCR nhằm phát hiện các đột biến nổi trội trên gen K-ras Để thực hiện điều này, chúng tôi đã sử dụng một số công cụ tin sinh học để đánh giá và thiết kế các mồi.

- BatchPrimer 3 (http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/): sử dụng để thiết kế mồi phát hiện đột biến cho gen K-ras

Để thiết kế mồi hiệu quả, nucleotide cuối cùng ở đầu 3‘ của mồi cần phải nằm tại vị trí đột biến điểm hoặc nucleotide đa hình Đồng thời, mồi cũng phải đáp ứng các tiêu chí cần thiết cho phản ứng PCR, bao gồm độ dài, nhiệt độ nóng chảy (Tm) và tỷ lệ phần trăm GC.

Ta có một đoạn DNA như sau:

Trong bài viết này, nu G được in đậm và gạch dưới để chỉ vị trí có cá thể mang đột biến hoặc điểm đa hình Nu G là nu bình thường, nhưng nếu có đột biến, nu G sẽ được thay thế bằng nu khác, chẳng hạn như C Do đó, mồi sẽ được thiết kế với nu cuối cùng là G cho allele bình thường hoặc C cho allele bị đột biến hoặc SNP.

Phương pháp này tiến hành phản ứng trên nhiều mẫu khác nhau, bao gồm mẫu đột biến, bình thường và hỗn hợp, nhưng sử dụng cùng một loại mồi tùy thuộc vào mục đích phân biệt alen bình thường hay đột biến Sau khi phản ứng hoàn tất, có thể sử dụng điện di để kiểm tra và phân biệt giữa alen bình thường và đột biến.

AS-PCR có nhược điểm là cần biết trước trình tự đột biến hoặc SNP để thiết kế mồi, do đó không thể áp dụng cho các đột biến mới hoặc SNP mới Trong những trường hợp này, giải pháp thay thế là sử dụng phương pháp giải trình tự.

▪ Thiết kế mẫu dò Taqman:

Để thiết kế mẫu dò hiệu quả, vị trí bắt cặp của mồi với trình tự DNA đích nên nằm trong khoảng trình tự được khuếch đại Vị trí lý tưởng cho mồi là nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược.

- BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) với các thông số mặc định sẵn trên NCBI: nhằm xác định độ đặc hiệu của bộ mồi thiết kế

IDT analyzer (www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/) là công cụ hữu ích giúp xác định các thông số quan trọng của mồi, bao gồm kích thước, thành phần GC, nhiệt độ lai, khả năng tạo hairpin loop, primer-dimer và hetero-dimer.

- Annhyb: kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi, mẫu dò và kích thước sản phẩm

Chúng tôi sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA, trong đó màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh SDS kết hợp với sốc nhiệt Sau đó, protein sẽ được loại bỏ bằng cách biến tính với phenol/chloroform, và cuối cùng DNA bộ gen sẽ được tủa bằng ethanol lạnh.

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

SDS 10 % NaCl 5 M Tris HCl 1 M (pH=8) EDTA 0.5 M (pH=8)

Máy ly tâm lạnh Hettich

1) Cắt nhỏ mẫu bệnh phẩm cho vào ống eppendorf loại 1,5 ml

2) Thêm 1 ml xylene, vortex 1 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút (lặp lại 3 lần)

3) Thêm 1 ml Ethanol 100 %, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút (lặp lại 2 lần)

4) Thêm 1 ml Ethanol 80 %, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong

5) Thêm 1 ml Ethanol 50 %, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong

7) Thờm 700 àl dung dịch lysis buffer gồm:

13) Trộn đều các thành phần trong eppendorf bằng cách lắc nhẹ

16) Thờm 10 àl proteinase K (18.5 mg/ml), trộn đều

18) Đưa eppendorf về nhiệt độ phũng, thờm 700 àl phenol : chloroform (tỷ lệ 1:1), lắc đều

19) Ly tâm ở nhiệt độ phòng 10000 vòng/phút trong 3 phút

20) Thu dịch nổi, lặp lại 2 – 3 lần

21) Thêm cùng thể tích chloroform, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong

22) Thêm 0.2 lần thể tích NH4OAc 5 M và 2.5 lần thể tích Ethanol 100%, đảo đều, ủ lạnh ở -20 o C/20 phút

23) Ly tâm 10000 vòng/10 phút/4 o C, thu tủa

24) Rửa lại bằng Ethanol 70 %, ly tâm 13000 vòng/10 phút/4 o C

25) Bỏ dịch, để khô tự nhiên

26) Thờm 60 àl TE pH 8 hoặc nước cất 2 lõ̀n, bảo quản 4 o C

2.2 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận:

❖ Phương pháp đo quang phổ:

Hàm lượng DNA có thể xác định thông qua sự hấp thu mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm, với giá trị mật độ quang OD260nm cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch (A260nm = 1OD = 50 µg/ml DNA sợi đụi) Độ tinh sạch của DNA được đánh giá qua tỷ lệ A260/A280, và DNA được coi là tinh sạch khi giá trị này dao động từ 1,4 đến 2.

2.2.2 Thiết bị và hóa chất

Máy đo quang phổ: Bio Rad

Sau khi tách chiết, DNA được pha loãng 6 lần với nước cất vô trùng Toàn bộ dung dịch sau đó được chuyển vào cuvette để đo nồng độ DNA tại bước sóng 260 nm Độ tinh sạch của dung dịch được xác định thông qua tỷ lệ OD260/OD280.

Sau khi xác định nồng độ DNA bằng phương pháp OD, chúng tôi tiến hành thử nghiệm phản ứng PCR sử dụng cặp mồi AS PCR do nhóm thiết kế Mục tiêu của thí nghiệm là đánh giá hiệu quả của quá trình tách chiết DNA Nếu kết quả cho thấy vạch sản phẩm xuất hiện như mong đợi, điều đó chứng tỏ quy trình tách chiết đã thành công.

35 đợi chứng tỏ trong dịch chiết thu được có chứa DNA bộ gen và có thể sử dụng DNA thu nhận này cho các bước thực nghiệm tiếp theo

Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tích 15 l với mồi AS PCR, thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR như bảng:

Master mix green 2X 7.5 K-ras F primer (10 M) 0.5 K-ras R primer (10 M) 0.5

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR với K-ras

Thời gian Số chu kỳ

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với K-ras

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

KẾT QUẢ KHAI THÁC DỮ LIỆU VÀ KHẢO SÁT IN SILICO

1 Khai thác dữ liệu - Các loại đột biến trên gen K-ras

Sử dụng các từ khóa: “Mutation”, “K-ras”, “Colorectal cancer”,… để tiến hành khai thác thông tin trên ngân hàng dữ liệu NCBI, chúng tôi đã tìm được hơn

Nghiên cứu về đột biến gen K-ras, đặc biệt trong ung thư đại trực tràng và ung thư phổi không tế bào nhỏ, đã thu hút sự chú ý toàn cầu với 20 công trình được cập nhật đến tháng 1/2013 Các nghiên cứu này đã dẫn đến việc FDA chấp thuận các liệu pháp nhắm trúng đích trong điều trị ung thư, nhờ vào việc phát hiện các đột biến trên gen K-ras Đáng chú ý, các đột biến này đã được khảo sát bằng nhiều phương pháp khác nhau và trên nhiều loại mẫu từ các chủng tộc khác nhau, dẫn đến sự khác biệt lớn trong tỷ lệ và tần suất đột biến gen K-ras Sự khác biệt này được thể hiện rõ qua bảng 3.1.

Bảng 3.1 Tỷ lệ đột biến gen K-ras trên ung thư đại trực tràng

Số mẫu ung thư có đột biến

PCR- Se- quencing Đại trưc tràng

Sequenom- Based Geno- typing Assays

Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy phương pháp phổ biến để phát hiện đột biến K-ras là PCR kết hợp với giải trình tự, được coi là chuẩn vàng trong sinh học phân tử Phương pháp này cho phép kiểm tra trực tiếp các đột biến, phát hiện cả các đột biến đã biết và mới phát sinh, đồng thời dễ dàng thiết kế mồi Ngoài ra, một số phương pháp khác như PCR, Real-Time PCR và Allele Specific Realtime PCR cũng được áp dụng.

Thống kê các bài báo khoa học cho thấy gen K-ras đóng vai trò quan trọng trong điều trị nhắm trúng đích ung thư đại trực tràng, trong khi vai trò của EGFR lại không đáng kể do tỷ lệ đột biến của nó thấp Ngược lại, trong ung thư phổi không tế bào nhỏ, tỷ lệ đột biến EGFR cao, điều này được chứng minh qua bảng 3.2.

Bảng 3.2 Tỷ lệ đột biến gen EGFR trên các loại ung thư

Gen Nghiên cứu Phương pháp

PCR- Sequencing Đại trực tràng

Chúng tôi sẽ tiến hành thực nghiệm trên mẫu mô được phẫu thuật cắt bỏ từ bệnh nhân ung thư đại trực tràng, tập trung phân tích gen K-ras dựa trên các nhận định đã nêu.

Về loại mẫu sử dụng trong các nghiên cứu, chúng tôi ghi nhận qua bảng tổng kết dưới đây (Bảng 3.3)

Bảng 3.3 Các loại mẫu được sử dụng trong các tài liệu tham khảo

Loại mẫu Số nghiên cứu sử dụng

Mô đúc paraffin 20 (Angulo B, 2010; Arcila M,

J, 2008; Jửnsson M, 2009; Morandi L, 2012; Neumann J, 2009; Tsiatis A C, 2010) (Brink

H, 2010; Malapelle U, 2012; Mao C, 2012; Ogino S, 2009; Samowitz W S, 2000; Sundstrửm M, 2010; Yunxia Z,

Không đề cập đến 01 (Heinemann V, 2008)

Dễ dàng nhận thấy rằng mẫu mô đúc paraffin được sử dụng rất phổ biến, phù hợp cho các nghiên cứu hồi cứu, tiến cứu

Trong tổng kết về các kiểu đột biến gen K-ras, chúng tôi đã xác định được 11 kiểu đột biến phổ biến, tất cả đều là đột biến điểm Trong số đó, có 7 đột biến xuất hiện với tần số rất cao, bao gồm G12D, G12V, G13D, G12S, G12C, G12A và G12R, chủ yếu tập trung tại hai codon 12.

13 thuộc exon 1 của gen (Bảng 3.4)

Bảng 3.4 Tỷ lệ đột biến bảy vị trí phổ biến trên gen K-ras

Vị trí đột biến ở codon 12 và

13 của gen K- ras trên ung thư đại trực tràng

Vùng khảo sát Nghiên cứu Phương pháp

(Neumann J, 2009) PCR-Sequencing 36 (Smith G, 2010) PCR-Sequencing 24.1 (Angulo B, 2010) Real-Time PCR 30.7 (Knijn N, 2011) PCR-Sequencing 34 (Malapelle U, 2012) PCR-Sequencing 29.8 Châu Mỹ

PCR-Sequencing 31.1 (Freeman D J, 2008) PCR-Sequencing 29.2

(Ogino S, 2009) PCR-Sequencing 31.5 (Tsiatis A C, 2010) PCR-Sequencing 37.1 (Arcila M, 2011) PCR-Sequencing 29 Châu Á

(Shen H, 2011) PCR-Sequencing 39 (Mao C, 2012) PCR-Sequencing 24 (Elbjerrami W M,

(Neumann J, 2009) PCR-Sequencing 21.8 (Smith G, 2010) PCR-Sequencing 20.7 (Angulo B, 2010) Real-Time PCR 21.3 (Knijn N, 2011) PCR-Sequencing 26 (Malapelle U, 2012) PCR-Sequencing 25.5

(Freeman D J, 2008) PCR-Sequencing 29.2 (Ogino S, 2009) PCR-Sequencing 17.9 (Tsiatis A C, 2010) PCR-Sequencing 20.1 (Arcila M, 2011) PCR-Sequencing 20 Châu Á

(Shen H, 2011) PCR-Sequencing 19.5 (Mao C, 2012) PCR-Sequencing 16 (Elbjerrami W M,

(Neumann J, 2009) PCR-Sequencing 18.8 (Smith G, 2010) PCR-Sequencing 20.7 (Angulo B, 2010) Real-Time PCR 17.3 (Knijn N, 2011) PCR-Sequencing 14 (Malapelle U, 2012) PCR-Sequencing 21.3

(Neumann J, 2009) PCR-Sequencing 8 (Smith G, 2010) PCR-Sequencing 6.7 (Angulo B, 2010) Real-Time PCR 8 (Knijn N, 2011) PCR-Sequencing 14 (Malapelle U, 2012) PCR-Sequencing 9,5 Châu Mỹ (Samowitz W S, PCR-Sequencing 9.5

2000) (Freeman D J, 2008) PCR-Sequencing 16.6 (Ogino S, 2009) PCR-Sequencing 11.8 (Tsiatis A C, 2010) PCR-Sequencing 1.61 (Arcila M, 2011) PCR-Sequencing 10 Châu Á

(Neumann J, 2009) PCR-Sequencing 6.5 (Smith G, 2010) PCR-Sequencing 13.8 (Angulo B, 2010) Real-Time PCR 16 (Knijn N, 2011) PCR-Sequencing 7 (Malapelle U, 2012) PCR-Sequencing 5.4

(Neumann J, 2009) PCR-Sequencing 6 (Smith G, 2010) PCR-Sequencing 10.3 (Angulo B, 2010) Real-Time PCR 6.7 (Knijn N, 2011) PCR-Sequencing 7 (Malapelle U, 2012) PCR-Sequencing 6.3

(Neumann J, 2009) PCR-Sequencing 1.3 (Smith G, 2010) PCR-Sequencing 0 (Angulo B, 2010) Real-Time PCR 0 (Knijn N, 2011) PCR-Sequencing 3

(Freeman D J, 2008) PCR-Sequencing 0 (Ogino S, 2009) PCR-Sequencing 0 (Tsiatis A C, 2010) PCR-Sequencing 3.23 (Arcila M, 2011) PCR-Sequencing 1 Châu Á

Dự đoán về kết quả công bố đột biến từ các nghiên cứu có sự khác biệt lớn do nhiều yếu tố như nguồn mẫu, kỹ thuật sử dụng, chủng tộc và kích thước mẫu Để có cái nhìn tổng quan, chúng tôi đã áp dụng phương pháp thống kê với cách tính tần số trung bình có trọng số nhằm loại bỏ sự khác biệt giữa các phương pháp nghiên cứu và các loại mẫu mô Kết quả thống kê được thể hiện trong hình 3.1.

Hình 3.1 Tỷ lệ đột biến của bảy vị trí phổ biến trên gen K-ras đã qua áp dụng cách thống kê, tính tần số trung bình có trọng số

Biểu đồ ở hình 3.1 chỉ ra rằng có 7 đột biến xuất hiện với tần suất cao, trong đó G12D chiếm tỉ lệ cao nhất, vượt quá 30% Tần suất các đột biến này giảm dần, với G12V chiếm trên 20%, G13D khoảng 10%, và G12S cùng G12A có tần suất tương đương trên 5% Cuối cùng, G12R có tần suất từ 2-3% Để thuận tiện theo dõi, bảng 3.5 trình bày các đột biến cùng với mức thay đổi hiển thị bằng các nucleotide của 7 đột biến này.

Bảng 3.5 Sự thay đổi nu (nu được gạch dưới) ở codon 12 và 13 dẫn đến các đột biến

Chúng tôi tiến hành phân tích tần số các đột biến K-ras nổi trội (7 kiểu đột biến) trên ung thư đại trực tràng ở các châu lục, sử dụng phân tích ANOVA để kiểm tra sự khác biệt về tình trạng các đột biến này Với thông số P=0.05, chúng tôi thực hiện kiểm định ANOVA đơn yếu tố Nếu P ≤ 0.05 và F > F crit, điều này cho thấy tỷ lệ đột biến ở các châu lục khác nhau và có ý nghĩa thống kê, phản ánh sự khác biệt về tần suất xuất hiện các đột biến liên quan đến yếu tố dân tộc Ngược lại, nếu không đạt yêu cầu này, tỷ lệ đột biến và yếu tố dân tộc sẽ không có ý nghĩa thống kê Kết quả phân tích và thông số ANOVA được trình bày trong bảng 3.6.

Bảng 3.6 Phân tích ANOVA trên các khác biệt về cỡ mẫu ở các châu khác nhau về 7 kiểu đột biến nổi trội trên gen K-ras

Bảy đột biến K-ras phổ biến ở ung thư đại trực tràng Tổng mẫu đột biến K- ras

Khác biệt không có ý nghĩa thống kê

Kết quả phân tích cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về sự xuất hiện của các đột biến giữa các chủng tộc thuộc các châu lục đã được công bố.

Trong phần tiếp theo của nghiên cứu, chúng tôi thực hiện các khảo sát in silico với trình tự gen K-ras từ ngân hàng gen nhằm giải thích sự xuất hiện của các đột biến nổi bật, bao gồm 7 đột biến đã nêu Mục tiêu của chúng tôi là tìm ra cơ sở phân tử để thiết kế và đánh giá các bộ mồi, cũng như mồi/mẫu dò cho các phương pháp kỹ thuật thực nghiệm sẽ được áp dụng trên bệnh phẩm sau này.

2 Kết quả khảo sát in silico

2.1 Thu nhận trình tự gen, định vị các vị trí đột biến đã công bố:

Chúng tôi đã sử dụng cơ sở dữ liệu GenBank để thu nhận trình tự vùng exon 1 của gen K-ras (Accession number: NC_000012.11) và xác định vị trí các đột biến, như minh họa trong hình 3.2 Vùng exon 1 của gen K-ras dài 111 nucleotide, với các đột biến chủ yếu tập trung tại codon 12 và 13 Đặc biệt, 7 đột biến nổi bật nằm trong vùng cấu thành “P-loop” thuộc tiểu vùng domain 1.

Hình 3.2 Mô hình cấu trúc domain của protein K-ras (A) và vị trí các đột biến trên gen (B)

Trong đó: Domain G: vùng chức năng của protein K-ras, “Switch” 1 và 2: vùng giữ chức năng “bật” và “tắt” hoạt động protein K-ras

Các đột biến nổi trội tập trung tại vùng quan trọng của protein K-ras, ảnh hưởng đến hoạt tính GTPase và con đường truyền tín hiệu nội bào liên quan đến thụ thể EGFR qua trục Ras/Raf/MAPK Những đột biến này làm suy giảm hoặc ngừng hoạt động GTPase của K-ras, dẫn đến việc GTP không được chuyển đổi thành GDP Kết quả là, protein K-ras không thể trở về trạng thái không hoạt động, khiến tín hiệu kích hoạt tiếp tục được truyền đi Điều này giải thích các lưu ý lâm sàng trong việc sử dụng liệu pháp nhắm trúng đích cho ung thư đại trực tràng.

Liệu pháp 47 có hiệu quả khi gen K-ras không có đột biến Tuy nhiên, khi gen K-ras đã bị đột biến, việc áp dụng liệu pháp này thường dẫn đến kết quả không như mong đợi.

2.2 Thiết kế và đánh giá mồi cho phản ứng PCR-Giải trình tự, AS-PCR

Khi bắt đầu một nghiên cứu, phương pháp an toàn và hiệu quả nhất để phát hiện các đột biến mới là sử dụng PCR kết hợp với giải trình tự Do đó, bước đầu tiên trong thiết kế và đánh giá mồi là tham khảo các trình tự mồi đã được công bố trên toàn cầu, tiến hành đánh giá và so sánh, và nếu cần, thiết kế lại mồi mới để khuếch đại các vùng exon 1 của gen K-ras cùng với các vùng exon 18, 19, 20 và 21.

Chúng tôi đã thiết kế lại các mồi để khuếch đại đoạn trình tự dài hơn các exon mong muốn, dựa trên phân tích và đánh giá dữ liệu Sau khi thực hiện giải trình tự, các nucleotide dư sẽ được loại bỏ thông qua quá trình hiệu chỉnh trình tự mà không ảnh hưởng đến toàn bộ đoạn khảo sát.

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

1 Tách chiết DNA và kiểm tra DNA bộ gen sau tách chiết:

Theo các tài liệu đã thu thập, bước tách chiết DNA nguyên vẹn từ mẫu mô đúc paraffin được xác định là khó khăn và quan trọng nhất trong việc tìm kiếm đột biến gen K-ras Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết quả tách chiết DNA, bao gồm quy trình xử lý paraffin, lượng mẫu sử dụng, độ mịn của mẫu, cũng như các điều kiện như nồng độ, nhiệt độ và thời gian ủ với enzyme proteinase K Cuối cùng, chất lượng DNA tách được cần phải đảm bảo nguyên vẹn và có độ đứt gãy thấp để đảm bảo thành công trong quá trình khuếch đại bằng PCR.

Các mẫu mô đúc paraffin mà chúng tôi thu được có thời gian lưu giữ ở nhiệt độ lạnh sâu lâu dài và có sự khác biệt rõ rệt từ năm 2007 đến 2011 Quá trình thử nghiệm tách chiết này không chỉ giúp chúng tôi lưu ý đến chỉ tiêu về thời gian lưu trữ mà còn cung cấp cơ sở để rút ra kết luận cho các thực nghiệm sau này.

Trong thực nghiệm đầu tiên, chúng tôi đã áp dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết trên ba mẫu mô đúc trong paraffin, được đánh số thứ tự 5 (sinh thiết tháng 7/2007), 16 (sinh thiết tháng 1/2008), và 37 (sinh thiết tháng 12/2009) từ bộ mẫu sinh thiết của các bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Bệnh viện Đa khoa.

Tây Ninh) Mẫu sau tách được đánh giá bằng chỉ số OD qua phương pháp đo mật độ quang Kết quả được thể hiện ở bảng 3.9:

Bảng 3.9 Chỉ số OD của 3 mẫu 5, 16, 17

Nồng độ DNA trong các mẫu có sự chênh lệch lớn, có thể do số lượng tế bào trong các mẫu cạo vào eppendorf khác nhau Với giá trị OD khoảng 1.4, chúng tôi đánh giá mẫu bị nhiễm protein Mặc dù vậy, các mẫu DNA này vẫn được thử nghiệm PCR, nhưng kết quả không như mong đợi; mặc dù có kết quả dương tính xuất hiện, tính lập lại của thực nghiệm lại không ổn định.

Kết quả PCR không ổn định có thể chỉ ra rằng quy trình tách chiết DNA của chúng tôi chưa đạt yêu cầu Có thể trong quá trình ly trích, DNA của mẫu đã bị đứt gãy, dẫn đến việc PCR không tạo ra sản phẩm Ngoài ra, sự hiện diện của tạp chất trong sản phẩm sau tách chiết có thể gây ức chế phản ứng PCR Hơn nữa, nồng độ DNA cao, như mẫu số 5 với 893ng, cũng có thể là nguyên nhân làm giảm hiệu suất của phản ứng PCR.

Sau khi tiến hành điện di kiểm tra DNA, giả thuyết số 1 về việc DNA đứt gãy đã bị loại bỏ do không phát hiện được sự xuất hiện của smear nhiều.

Thí nghiệm tiếp theo đã bổ sung CTAB vào quy trình tách chiết nhằm loại bỏ các acid hữu cơ và phức hợp khó phân hủy Thực nghiệm được thực hiện trên hai mẫu mô đại trực tràng: mẫu cũ (mẫu số 16) và mẫu mới (ký hiệu 0702) Tuy nhiên, cả hai mẫu đều không cho ra sản phẩm nào sau khi tách chiết bằng CTAB, cho thấy rằng việc thêm CTAB không giải quyết được vấn đề trong quy trình tách chiết Hơn nữa, yếu tố thời gian lưu trữ mẫu vẫn chưa được làm rõ liệu có ảnh hưởng đến khả năng tách chiết DNA từ các mẫu này hay không.

Bước cải tiến trong quy trình tách chiết DNA bằng phenol/chloroform được thực hiện trên các mẫu sinh thiết mô ung thư đại trực tràng, bao gồm 3 mẫu cũ (5, 16, 37) và 3 mẫu mới (mẫu số 9 từ tháng 10/2007, mẫu số 36 từ tháng 11/2009).

Trong quá trình tách chiết DNA từ sinh thiết mô đúc paraffin, có một số lưu ý quan trọng cần ghi nhớ: (1) giảm thể tích mẫu, (2) rửa xylene bằng ethanol với nồng độ giảm dần từ 100%, 80%, đến 50% để loại bỏ xylene và phục hồi mô, (3) sau khi thêm các thành phần lysis buffer ngoại trừ proteinase K, ủ ở 90°C trong 30 phút và làm lạnh đột ngột để gây sốc nhiệt, giúp phá vỡ tế bào và tăng cường khả năng xâm nhập của hóa chất.

Sử dụng 8 μl đến 10 μl proteinase K với nồng độ 18.5 mg/ml giúp phân hủy hoàn toàn protein trong mẫu, giải phóng DNA và rút ngắn thời gian ly trích hiệu quả.

Trong tất cả các giai đoạn sử dụng vortex, chúng tôi đã thay thế bằng cách xoay ống để giảm số vòng ly tâm xuống còn 10.000 vòng/3 phút Điều này giúp giảm lực xé (shearing force), đảm bảo rằng DNA không bị đứt gãy trong quá trình ly tâm.

Kết quả đo mật độ quang của các dịch sau khi tách chiết được trình bày trong bảng 3.10, nhằm minh họa cho một trong những cải tiến trong quy trình tách chiết DNA đã đề cập.

Bảng 3.10 Kết quả đo mật độ quang của lô mẫu thử nghiệm phương pháp tách chiết mới

Kết quả kiểm tra nồng độ DNA cho thấy sự chênh lệch giữa các mẫu, với tỉ lệ OD260/280 dao động từ 1.4 đến 1.6.

Toàn bộ DNA được sử dụng trong phản ứng PCR với thể tích đồng nhất cho các mẫu, cụ thể là khoảng 280 ng DNA mỗi mẫu cho phản ứng 25 µl Các cặp mồi đã được áp dụng và tín hiệu khuếch đại đã được ghi nhận ở tất cả các mẫu.

Dựa trên kết quả xây dựng quy trình tách chiết DNA, chúng tôi đã xác định quy trình ly trích DNA tối ưu cho mẫu mô ung thư đại trực tràng được đúc trong paraffin.

Quy trình tách chiết được tóm tắt theo sơ đồ:

2 Thử nghiệm các điều kiện phản ứng cho PCR – giải trình tự:

Phản ứng PCR với cặp mồi K-ras cho 2 mẫu 9 và 16 với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt trình bày như phần vật liệu và phương pháp

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi K-ras trên 2 mẫu bệnh phẩm 9 và 16 Thang chuẩn 100 bp

Định dạng
Số trang	89
Dung lượng	1,94 MB