NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Địa điểm và thời gian thực hiện
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh
Thời gian thực hiện thí nghiêm 04-2019 đến 07-2019.
Vật liệu
Bacterial Cellulose (BC) được tổng hợp từ vi khuẩn Acetobacter xylinum ở môi trường dịch vỏ trái cây phế thải
Vỏ trái cây phế thải hổn hợp để tạo môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Phương pháp sử dụng: lên men tĩnh từ dịch vỏ trái cây phế thải
Chủng vi sinh vật được sử dụng để sinh tổng hợp cellulose là chủng vi khuẩn
A xylinum được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học & Biomass trường Đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh
Chủng vi sinh vật được giữ trên thạch nghiêng ở 4℃
3.2.3 Hóa chất và thiết bị
Tủ cấy (Sanyo MCV - 710 ÁT Nhật)
Nồi hấp (Tommy - ES315 Nhật)
Máy đo pH (MP 200R - Thụy Sỹ)
Máy đo dường khử (Hach - Nhật)
Micropipet Glassco Ống nghiệm, bình tam giác, đèn cồn,
Nguồn cacbon: glucose, sacrose, acid acetic
Nguồn nitơ: (NH 4 ) 2 SO 4 , (NH 4 ) 2 HPO 4
3.2.4.1 Môi trường giữ giống (MT1)
Acid acetic: 5ml/lít (bổ sung sau khi khử trùng)
3.2.4.2 Môi trường nhân giống (MT2)
Acid acetic: 1ml/lít (bổ sung sau khi khử trùng)
3.2.4.3 Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng (MT3)
Dịch ép vỏ trái cây: 1 lít
Acid acetic: 5ml/lít (bổ sung sau khi khử trùng).
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Nguyên liệu sau khi thu hoạch được xay nhuyễn theo tỷ lệ 1:1, sau đó sử dụng ray để loại bỏ phần bã Tiếp theo, dịch được lọc thô qua màng lọc để thu được chất lỏng, vì bã có thể gây hao hụt chất khô, giảm một số chất dinh dưỡng và hàm lượng đường.
Khảo sát thời gian lên men và tỉ lệ giống
Hổn hợp vỏ trái cây phế thải
Khảo sát đặc điểm của A xylinum
Khảo sát hàm lượng ẩm; tro, đường khử
Dịch trái cây sau khi lọc được bổ sung chất dinh dưỡng gồm saccarose 40g/lít, (NH4)2SO4 8g/lít và (NH4)2HPO4 2g/lít Sau khi khuấy đều, cho 100ml môi trường vào bình 250ml và hấp khử trùng ở 121℃ trong 15 phút Sau khi môi trường nguội, thêm acid acetic vào để hoàn thiện quy trình.
Giống cấp 1 được chuẩn bị bằng cách cho 1ml vào mỗi ống nghiệm 10ml dịch lên men, sau đó hấp khử trùng và trộn giống với tỷ lệ 1:10 Sau 7 ngày, màng BC sẽ xuất hiện Tiếp theo, chuẩn bị 90ml môi trường trong bình 250ml và thêm 10ml dịch giống cấp 1 vào, lắc đều ở nhiệt độ phòng để thu giống cấp 2.
Lên men: chuẩn bị môi trường lên men cho 90ml vào bình 250ml cho 10 dịch giống cấp 2 vào, nhiệt độ phòng Sau 7 ngày màng BC xuất hiện
3.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.3.2.1 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A.xylinum trên môi trường dịch ép hổn hợp vỏ trái cây
Nuôi cấy thu nhận cllulose với chủng vi khuẩn được nhân giống cấp 2:
Cho 10ml dịch giống cấp 2 vào bình 250ml chứa 90ml môi trường dịch ép phế phẩm trái cây đã được thanh trùng ở 121℃ trong 15 phút Sau khi cấy giống, để ở nhiệt độ phòng mà không lắc đảo Vào ngày thứ 7, bắt đầu thu thập bào chế (BC) và khảo sát khối lượng BC tại các thời điểm 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21.
Khối lượng BC thu được ở các ngày 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21
3.2.2.2 Khảo sát thời gian lên men và lượng giống bổ sung thu BC của vi khuẩn A xylinum từ dịch ép phế phẩm trái cây
Khảo sát thời gian từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 21 và tỉ lệ giống bổ sung 6%, 8%, 10%, 12% đến khả năng tạo màng BC khi nuôi cấy A xylinum
Chỉ tiêu: thời gian xuất hiện màng, cân nặng, trọng lượng khô
Từ khảo sát tìm ra thời gian và tỷ lệ giống thích hợp tạo màng BC tốt nhất
3.2.2.3 Khảo sát yếu tố pH thu BC của vi khuẩn A xylinum
Nghiên cứu này nhằm đánh giá tác động của pH lên khả năng tổng hợp cellulose của chủng A xylinum Quá trình nuôi cấy cellulose được thực hiện ở các mức pH khác nhau, nhằm xác định khoảng pH tối ưu cho sự sinh tổng hợp cellulose trong môi trường MT3 với bình 250ml và tỉ lệ giống 10%, pH từ 3.5 đến 5, ở nhiệt độ phòng Sau khi hoàn tất quá trình lên men, cellulose được thu nhận và phân tích ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum.
Chỉ tiêu: dựa vào trọng lượng của BC từ đó tìm ra được pH thích hợp tạo màng
Môi trường nhân giống cấp 1 sử dụng giống vi khuẩn Acetobacter xylinum được bảo quản trong ống thạch nghiêng tại tủ lạnh Trước khi sử dụng, giống cần được hoạt hóa bằng cách lấy một khuẩn riêng lẻ cho vào 10ml môi trường MT2 trong ống nghiệm đã được hấp khử trùng ở 121℃ trong 15 phút Sau 3 ngày nuôi cấy, lớp thạch nghiêng sẽ xuất hiện, cho phép thu được giống cấp 1, sau đó tiến hành nhân giống cấp 2.
Môi trường nhân giống cấp 2 có thành phần dinh dưỡng tương tự như môi trường nhân giống cấp 1 Để chuẩn bị, cho 90ml môi trường vào bình 250ml và thêm 10ml dịch giống cấp 1, sau đó lắc đều ở nhiệt độ phòng.
Giống sau khi nhận từ phòng thí nghiệm cần được cấy trên môi trường thạch nghiêng (MT1) trong 3 đến 4 ngày Để bảo quản giống, cần giữ lạnh ở nhiệt độ 4℃ Việc cấy truyền giữ giống trên môi trường thạch nghiêng nên được thực hiện mỗi tháng một lần.
Để quan sát đại thể, pha loãng dịch ở các nồng độ từ 10^-1 đến 10^-12 Sử dụng pipet hút 50μl mẫu từ các độ pha loãng 10^-3 đến 10^-12 và nhỏ lên bề mặt môi trường thạch vô trùng trong hộp Petri, sau đó dùng que khuấy đều Ủ mẫu trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp trong 5-7 ngày Dựa vào sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc, tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trưng ra khỏi môi trường phân lập, cấy thuần và chuyển sang thạch nghiêng để bảo quản ở nhiệt độ 4°C.
Vi khuẩn A xylinum trên môi trường thạch đĩa tạo ra các khuẩn lạc với đặc điểm nhẵn hoặc xù xì, có thể có rìa bằng phẳng hoặc gợn sóng, màu sắc từ trắng đến trong suốt Các khuẩn lạc này thường bằng phẳng hoặc lồi lên và dễ dàng tách rời khỏi môi trường nuôi cấy.
Khi miêu tả khuẩn lạc cần ghi nhận các đặc điểm sau đây:
- Hình dạng khuẩn lạc: Tròn, dạng amip, dạng rễ cây, dạng không đều
- Đặc tính quang học: Trong, bán trong, không trong, lóng lánh, đục, huỳnh quang
- Màu sắc: Ghi màu sắc khuẩn lạc và xem có tiết sắc tố vào môi trường hay không
- Bề mặt: Bóng, xù xì, gấp nếp, gồ ghề
- Cấu trúc khuẩn lạc: Đồng nhất, dạng hạt nhỏ, dạng hạt lớn
- Quan sát vi thể: làm tiêu bản cho vi khuẩn A xylinum theo phương pháp nhuộm
Gram Sau đó xem tiêu bản dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100 lần
3.2.3.2 Phương pháp hóa lý i) Xác định độ ẩm của nguyên liệu: cân 10g mẫu cho váo cốc sứ, sấy ở 105℃ đến khối lượng không đổi Sau khi sấy để vào bình hút ẩm, cân khối lượng Sấy lần 2 ở 105℃, cân lại khối lượng (khối lượng 2 lần sấy cách nhau không quá 0,0005g) Độ ẩm của nguyên liệu là 10,2% ii) Xác định hàm lượng tro của nguyên liệu: Sấy khô cốc rồi cân khối lượng Cho
Để xác định hàm lượng đường khử trong nguyên liệu, 15g nguyên liệu được nung ở nhiệt độ 900℃ trong 6 giờ, với hàm lượng tro là 0,8% Phương pháp sử dụng 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) cho phép phát hiện đường khử, khi dung dịch kiềm sẽ chuyển từ màu vàng sang màu đỏ cam do sự chuyển đổi thành acid 3-amino-5-nitrosalicylic Cường độ màu của hỗn hợp tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một khoảng nhất định.
+ Ống đối chứng: hút 1ml nước cất và 3ml dung dịch DNS
+ Hút 1ml dịch môi trường và 3ml dung dịch DNS
+ Sau đó đem đun trong 15 phút, làm lạnh rồi đo OD ở bước sóng 540nm
Cellulose ướt thu được từ bình lên men được rửa sạch dưới vòi nước và ngâm trong dung dịch NaOH 0,5M trong 30 phút Sau đó, cellulose được rửa lại nhiều lần với nước để loại bỏ các thành phần còn sót lại Tiếp theo, khối lượng cellulose ướt được cân và sau đó sấy ở nhiệt độ 105℃ để xác định khối lượng cuối cùng Cuối cùng, mẫu cellulose sẽ được phân tích bằng phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD).
Các tính chất của vật liệu liên quan chặt chẽ đến cấu trúc tinh thể của chúng, được xác định bởi cách sắp xếp các nguyên tử Nhiễu xạ tia X là một kỹ thuật phân tích không phá hủy, cung cấp dấu vân tay độc đáo thông qua phản xạ Bragg, phản ánh cấu trúc tinh thể Cấu trúc tinh thể có thể được hình dung như các lớp hoặc mặt phẳng, hoạt động như tấm gương trong suốt, nơi các tia X với bước sóng tương đương khoảng cách giữa các mặt phẳng này sẽ phản xạ theo một góc nhất định.
* Mẫu BC được đem sấy 105℃ rồi đem giả nhuyễn để đo XRD
3.2.3.3 Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
Số liệu được lấy giá trị trung bình của 3 lần lập lại
Xử lý số liệu bằng Excel.
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Kết quả khảo sát thời gian lên men và tỷ lệ giống bổ sung thu BC của vi khuẩn A xylinum từ dịch ép phế phẩm trái cây
Thời gian lên men và lượng giống bổ sung là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men cellulose vi khuẩn Nghiên cứu khả năng tạo màng của vi khuẩn A xylinum trong khoảng thời gian lên men từ 7 đến 21 ngày với tỷ lệ giống thay đổi từ 6% đến 12% Sử dụng dịch giống cấp 2 với tỷ lệ giống 8%, 10% và 12% để nuôi cấy và thu nhận cellulose trong môi trường dịch ép hỗn hợp từ vỏ trái cây phế thải, trong bình 250ml chứa 100ml dịch lên men ở nhiệt độ phòng.
Trong quá trình lên men, khảo sát hàm lượng cellulose được tổng hợp trong các khoảng thời gian khác nhau Khảo sát được lập lại 3 lần
Hình 4.6: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình tổng hợp BC
Trong những ngày đầu chuyển từ môi trường nhân giống sang môi trường lên men, số lượng tế bào chưa đủ lớn dẫn đến việc tạo thành cellulose hầu như chưa có Sau 5 ngày, những sợi cellulose mảnh bắt đầu xuất hiện lơ lửng trong môi trường và trên bề mặt hình thành lớp màng mỏng, trắng Đến ngày thứ 5, tốc độ tạo cellulose gia tăng, với một lớp màng cellulose dày hơn trên bề mặt bình lên men, mặc dù lượng cellulose vẫn còn rất ít để xác định khối lượng Từ ngày thứ 7, lượng cellulose tăng nhanh chóng.
Theo David Holmes (2004), hàm lượng glucose trong môi trường giảm nhất sau
Sau 150 giờ lên men, tác giả nhận thấy rằng sau 6 ngày, nguồn cung cacbon ban đầu đã giảm, khiến vi khuẩn chuyển sang sử dụng acid gluconic và 5-keto acid gluconic trong quá trình trao đổi chất Đến ngày thứ 6, độ kết tinh của màng đạt trạng thái tối ưu Vì vậy, tác giả quyết định bổ sung hàm lượng giống ban đầu là 10% và thu nhận màng sau thời gian lên men.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, trọng lượng cellulose thu được sau 21 ngày lên men là cao nhất, tuy nhiên sự chênh lệch so với ngày 19 không đáng kể Vì vậy, để tối ưu hóa quy trình và rút ngắn thời gian lên men, thời gian kết thúc được chọn là 19 ngày.
Hình 4.8: Màng BC sấy khô sau 21 ngày lên men Hình 4.7: Màng BC thu được sau 21 ngày lên men
Thời gian thu nhận biofilm từ môi trường lên men được xác định là 19 ngày, với điều kiện nhiệt độ phòng, nồng độ Bx từ 8,5 đến 9, và pH khoảng 5 Sau quá trình lên men, biofilm được xử lý bằng cách ngâm trong dung dịch NaOH, sau đó rửa sạch bằng nước và sấy khô ở nhiệt độ 100℃.
Tỷ lệ giống 6% không phù hợp do thời gian lên men kéo dài, sản lượng BC thấp và dễ bị nhiễm tạp Để rút ngắn thời gian lên men, cần tăng tỷ lệ giống lên 8%, 10% hoặc 12%, tương ứng với tỷ lệ giống bổ sung là 8:100, 10:100 và 12:100.
4.3.2 Tỷ lệ giống bổ sung
Hình 4.9: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến quá trình tổng hợp BC
* Nhận xét: từ kết quả trên chọn được tỷ lệ giống bổ sung tốt nhất là 12%, trong thời gian 19 ngày lên men
Tỷ lệ giống bổ sung
Hình 4.10: BC tại các tỷ lệ giống bổ sung a ) Tỷ lệ bổ sung giống 8% b ) Tỷ lệ bổ sung giống 10% c ) Tỷ lệ bổ sung giống 12% a ) b ) c )
Kết quả khảo sát yếu tố pH thu BC của vi khuẩn A xylinum
Nghiên cứu tiến hành lên men để thu nhận cellulose bằng cách nuôi cấy vi khuẩn A xylinum trên môi trường dịch ép hỗn hợp trái cây phế thải (MT3) với các điểm pH ban đầu khác nhau là 3,5; 4; 4,5; và 5 trong thời gian 7 ngày Mục tiêu là khảo sát hàm lượng cellulose thu được và đánh giá ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo cellulose của vi khuẩn, từ đó xác định pH tối ưu cho môi trường lên men.
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, lượng cellulose thu được từ A xylinum thay đổi theo các giá trị pH khác nhau, điều này chứng tỏ rằng pH có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn này.
Hình 4.11: Ảnh hưởng của pH lên men đến quá trình tổng hợp BC
Khoảng pH cho chủng A xylinum trong thí nghiệm này là khoảng từ 3.5 - 5, lượng cellulose tạo ra tại các giá trị pH khác nhau
A xylinum không chỉ tổng hợp cellulose mà còn sản xuất cellulase Khi lượng cellulase tăng cao, khả năng polymer hóa và tạo cellulose của vi khuẩn giảm, dẫn đến sản lượng cellulose thấp hơn Ở pH cao (pH>5), cellulase được sản xuất nhiều hơn, làm giảm lượng cellulose Ngược lại, ở pH thấp (pH
