Xây dựng phương pháp xác định đồng thời một số thuốc hạ huyết áp và lợi tiểu trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng hplc

TỔNG QUAN

Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu

Tên khoa học: 3-ethyl 5-methyl (4RS)-2-[(2-aminoethoxy)methyl]-4-(2- clorophenyl)-6-methyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat benzensulfonate

Tính chất: Bột màu trắng hoặc gần nhƣ trắng Dễ tan trong methanol, hơi tan trong ethanol khan, khó tan trong nước và 2-propanol [7]

Amlodipin là một dẫn chất dihydropyridin có khả năng chẹn dòng calci qua màng tế bào, ngăn chặn kênh calci loại L phụ thuộc điện thế Thuốc này tác động chủ yếu lên các cơ trơn của mạch máu và tim, giúp làm giãn cơ trơn quanh động mạch ngoại biên, từ đó có tác dụng hạ huyết áp hiệu quả, mặc dù tác động lên kênh calci của cơ tim là ít hơn.

Tác dụng không mong muốn thường gặp bao gồm phù cổ chân từ nhẹ đến trung bình, nhức đầu, chóng mặt, đỏ bừng mặt kèm theo cảm giác nóng, mệt mỏi và suy nhược.

Chỉ định : Điều trị tăng huyết áp; Điều trị đau thắt ngực

Liều dùng : 5 mg/lần ngày uống 1 lần [8]

Tên khoa học: 5-O-ethyl 3-O-methyl 4-(2,3-dichlorophenyl)-2,6-dimethyl-

Tính chất: Bột màu trắng hoặc gần như trắng Khó tan trong nước và isopropanol, tan nhiều trong methanol [7]

Tác dụng dược lý của thuốc là chất chẹn kênh calci chậm, thuộc nhóm 1,4-dihydropyridin, có tính chất chọn lọc Thuốc ức chế sự xâm nhập của calci vào tế bào cơ trơn thông qua việc tác động lên kênh calci chậm, từ đó làm giảm trương lực động mạch và gây ra tác dụng giãn mạch, giúp hạ huyết áp hiệu quả.

Chỉ định: Bệnh tăng huyết áp, dự phòng đau thắt ngực ổn định

Tác dụng không mong muốn thường gặp bao gồm đau đầu, mặt đỏ bừng, cảm giác nóng bừng, phù mạch, và nhịp tim nhanh Ngoài ra, hiện tượng phù mắt cá chân cũng có thể xảy ra do tác dụng giãn mạch.

Liều dùng: 5 mg/lần ngày uống 1 lần [8]

Tên khoa học : Dimethyl-1,4-dihydro-2,6-dimethyl-4-(2-nitrophenyl) pyridin-

Tính chất: Bột kết tinh màu vàng nhạt, không tan trong nước, tan trong ethanol, methanol, ether [6]

Thuốc chẹn kênh calci thuộc nhóm dihydropyridin có tác dụng ức chế chọn lọc dòng ion calci vào tế bào Bằng cách tương tác đặc hiệu với kênh calci ở màng tế bào, thuốc giúp giảm sức căng ở cơ trơn của tiểu động mạch, từ đó làm giảm sức cản ngoại vi và hạ huyết áp hiệu quả.

Đau thắt ngực, đặc biệt khi có yếu tố co mạch như trong đau thắt ngực kiểu Prinzmetal, là chỉ định quan trọng Điều này cũng áp dụng cho đau thắt ngực ổn định mạn tính, tăng huyết áp và hội chứng Raynaud.

Tác dụng không mong muốn thường gặp bao gồm hạ huyết áp quá mức và tim đập nhanh do phản xạ, điều này có thể dẫn đến tình trạng thiếu máu cục bộ ở cơ tim hoặc não.

Liều dùng: 10 mg/lần, ngày uống 3 lần [8]

Tên khoa học : acid 4-chloro-5-sulfamoyl -2-[(2-furanylmethyl)amino] benzoic

Furosemide is a white crystalline powder that is odorless and tasteless It is insoluble in water and has limited solubility in ether, but it dissolves well in acetone, methanol, and dimethyl formamide, as well as in dilute alkaline solutions The compound gradually changes color when exposed to light A 0.0005% solution of furosemide in 0.1M NaOH exhibits three absorption maxima in the wavelength range of 220 nm to 350 nm.

Tác dụng dược lý: Là thuốc lợi tiểu dẫn chất sulfonamid thuộc nhóm tác dụng mạnh, nhanh, phụ thuộc liều lƣợng, có tác dụng ức chế đồng vận chuyển

Na+ và K+ cùng với 2Cl- tại đoạn dày nhánh lên của quai Henle giúp tăng cường thải trừ các chất điện giải, đồng thời làm tăng bài xuất nước, mang lại tác dụng lợi tiểu nhanh chóng và mạnh mẽ.

Chỉ định sử dụng thuốc bao gồm điều trị phù do suy tim sung huyết, bệnh thận và xơ gan, hỗ trợ điều trị phù phổi cấp, và tình trạng đái ít do suy thận cấp hoặc mạn tính Thuốc cũng được chỉ định cho bệnh nhân tăng huyết áp, đặc biệt là khi nguyên nhân do suy tim sung huyết hoặc suy thận, và hỗ trợ trong các cơn tăng huyết áp Ngoài ra, thuốc còn được sử dụng để điều trị tình trạng tăng calci huyết.

Khi điều trị với liều cao, tác dụng không mong muốn thường gặp là mất cân bằng nước và điện giải, đặc biệt ở những người có vấn đề về gan hoặc thận Các triệu chứng của tình trạng này bao gồm đau đầu, tụt huyết áp, hoa mắt, chóng mặt, chuột rút, khô miệng, khát nước, yếu mệt, buồn ngủ, mất ngủ, tiểu ít, loạn nhịp tim và rối loạn tiêu hóa Mất cân bằng điện giải có thể dẫn đến nhiều vấn đề sức khỏe nghiêm trọng như đau đầu và rối loạn tiêu hóa.

Liều dùng: 20 mg – 40 mg / lần ngày uống 2 lần [8]

Tên khoa học: γ-lacton của acid 7α-acetylthio-17β-hydroxy-3-oxo-pregn-

Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng, mùi lợm giọng, vững bền ở ngoài không khí Không tan trong nước, dễ tan trong cloroform, tan trong ethanol

Tác dụng dược lý: Spironolacton là một steroid có cấu trúc giống aldosteron

Spironolacton là một thuốc đối kháng thụ thể mineralocorticoid không chọn lọc, có khả năng ức chế aldosteron, đồng thời cũng là một chất đối kháng thụ thể androgen và progesteron Thuốc này có tác dụng giữ lại magnesi và kali, tăng natri-niệu, lợi tiểu và hạ huyết áp thông qua cơ chế ức chế cạnh tranh tác dụng sinh lý của aldosteron tại ống lượn xa, cơ tim và hệ mạch.

Chỉ định sử dụng thuốc này là để điều trị tình trạng phù do tăng quá mức aldosteron, bao gồm phù vô căn, phù do xơ gan, hội chứng thận hư và suy tim sung huyết Thuốc thường được kết hợp với các loại thuốc lợi tiểu khác hoặc thuốc chống tăng huyết áp, vì tác dụng của nó sẽ kém hiệu quả nếu sử dụng đơn độc.

Tác dụng không mong muốn của thuốc bao gồm mệt mỏi, nhức đầu, buồn ngủ và lú lẫn Về nội tiết, có thể xảy ra tình trạng tăng prolactin, to vú ở nam giới, chảy sữa nhiều, rối loạn kinh nguyệt, mất kinh, chảy máu sau mãn kinh, liệt dương và rậm lông Ngoài ra, hệ tiêu hóa cũng bị ảnh hưởng với các triệu chứng như tiêu chảy, buồn nôn, chán ăn và đau quặn bụng.

Liều dùng: 25 mg/lần ngày uống 1 lần [8]

Tình hình nghiên cứu các thuốc hóa dƣợc hạ huyết áp, lợi tiểu trộn trái phép trong chế phẩm đông dƣợc

Chế phẩm đông dược, bao gồm các bộ phận của cây như thân, rễ, lá hoặc các tinh chất chiết xuất như tinh dầu, ngày càng được ưa chuộng do người tiêu dùng tin tưởng vào tính an toàn và hiệu quả lâu dài của chúng Tuy nhiên, nhiều nhà sản xuất vì lợi nhuận đã tự ý thêm vào các chất phụ gia không được phê duyệt và các dược chất không công bố, dẫn đến nguy cơ cho sức khỏe Các loại thuốc thường bị trộn lẫn trái phép bao gồm thuốc điều trị tiểu đường, rối loạn chức năng tình dục, và corticoid Gần đây, các nghiên cứu toàn cầu đã phát hiện ra nhiều trường hợp vi phạm liên quan đến việc bổ sung các chất điều trị huyết áp và lợi tiểu trong các chế phẩm đông dược.

Nghiên cứu của Julie Regitze Kesting và cộng sự (2009) đã phân tích ba hoạt chất amlodipin, indapamin và valsartan trong viên nang mềm Gold Night, một loại thuốc thảo dược Trung Quốc dùng để điều trị cao huyết áp Phương pháp LC–HRMS và LC–MS–SPE/NMR được sử dụng để định tính, trong khi HPLC được áp dụng để định lượng Phân tích HPLC sử dụng cột C18 (3,0 x 50mm; 1,8 µm) với pha động là acetonitril và dung dịch acid formic 0,1% theo chế độ gradient, tốc độ dòng 1,0 ml/phút Mẫu được chiết xuất bằng hỗn hợp dung môi acetonitril và nước theo tỷ lệ 1:1 Detector UV-DAD với bước sóng định lượng cho amlodipin là 360nm, indapamin 240nm và valsartan 250nm Kết quả cho thấy trong 300mg dịch chiết có chứa 0,78 ± 0,06mg amlodipin, 0,78 ± 0,02mg indapamin và 18,47 ± 1,03mg valsartan.

Y.L Lu và cộng sự (2010) đã dùng phương pháp LC-MS để phát hiện

18 thuốc điều trị tăng huyết áp nhóm lợi tiểu, chẹn kênh calci và ức chế men

Nghiên cứu sử dụng cột C18 (250 x 4,6 mm, 5µm) với pha động là hỗn hợp MeOH, ACN và dung dịch đệm amoni format 20 mM (pH 3.2) theo chế độ gradient để phân tích 9 chuyển (ACEI) Mẫu được chiết xuất bằng hỗn hợp dung môi MeOH : H2O tỷ lệ 1:1 và siêu âm trong 30 phút Phương pháp này có giới hạn phát hiện từ 6,5 – 86 àg/kg và độ thu hồi đạt từ 71 – 109 % Qua phân tích 35 mẫu thực phẩm bổ sung và thuốc cổ truyền, đã phát hiện 9 mẫu có hydrochlorothiazid, 2 mẫu có clonidin và 2 mẫu có triamteren.

Ana Paula Lanỗanova và cộng sự (2013) đã áp dụng phương pháp điện di mao quản để phát hiện các loại thuốc như lợi tiểu, nhuận tràng và chống trầm cảm trong các sản phẩm thảo dược hỗ trợ giảm cân Qua phân tích 26 mẫu, nghiên cứu phát hiện có 6 mẫu chứa hydrochlorothiazid và 2 mẫu có furosemid.

Rui Zhang và các cộng sự (2014) đã áp dụng phương pháp quang phổ cận hồng ngoại (NIR) để phân tích nifedipin, diclofenac natri và metformin trong các thực phẩm bổ sung Kết quả thực nghiệm cho thấy có 38 mẫu dương tính với nifedipin, 13 mẫu dương tính với diclofenac natri và 35 mẫu dương tính với metformin Phương pháp này đã được xác thực bằng HPLC, cho thấy không có kết quả dương tính giả (100%).

Zhu và các cộng sự (2014) đã áp dụng phương pháp TLC-SERS để phát hiện nhanh chóng bốn loại chất chống tăng huyết áp: Nicardipin.HCl, Doxazosin mesylat, Propranolol.HCl và Hydroclorothiazid với độ đặc hiệu cao, đạt giới hạn phát hiện 0,005 àg/g Trong quá trình kiểm tra 10 mẫu thuốc y học cổ truyền, họ đã phát hiện 2 mẫu dương tính với các chất này.

In 2015, Zeng and colleagues identified ten antihypertensive compounds, including chlortalidone, hydrochlorothiazide, indapamide, metoprolol, nifedipine, nimodipine, nitrendipine, reserpine, triamterene, and valsartan, using a solid-phase extraction method with carbon nanotubes combined with HPLC The analysis was performed using a C18 column with acetonitrile and buffer as the mobile phase.

KH 2 PO 4 0,03 mol/L (pH 3,0), tốc độ dòng 0,8ml/phút, nhiệt độ cột là 35 0 C,

Phát hiện bằng phương pháp này diễn ra ở bước sóng 220 nm, với LOD và LOQ lần lượt là 0,014 – 0,053 μg/mL và 0,047 – 0,178 μg/mL Độ thu hồi đạt từ 80,1% đến 98,1%, cùng với độ lệch chuẩn tương đối dưới 9,53% Kiểm tra mẫu thực tế cho thấy một mẫu rượu bổ có chứa respirine với nồng độ 56,8 ± 1,2 mg/L.

Seok Heo và cộng sự (2016) đã áp dụng phương pháp UPLC – UV để phát hiện đồng thời 25 chất điều trị cao huyết áp trong thực phẩm bổ sung, sử dụng hệ thống UPLC của Waters với cột Waters UPLC HSS C18 Pha động bao gồm dung dịch natri 1-hexanesulfonate 0,5mM và ACN theo tỷ lệ 5:95, với bước sóng phát hiện là 205 nm Mẫu được chiết siêu âm bằng MeOH trong 30 phút, với LOD và LOQ cho mẫu rắn lần lượt là 0,2 – 1,00 μg/mL và 0,6 – 3,00 μg/mL, còn mẫu lỏng là 0,3 – 1,20 μg/mL và 0,9 – 3,60 μg/mL Độ tuyến tính có hệ số tương quan lớn hơn 0,999, và độ chính xác trong ngày và giữa các ngày đạt từ 82,25 – 111,42% và 80,70 – 115,64% Trong 97 mẫu kiểm tra, đã phát hiện 2 mẫu chứa atenolol với hàm lượng 16,81 – 28,07 àg/kg.

Ana Paula Lanỗanova Moreira và cộng sự (2016) đã tiến hành phân tích 13 loại thuốc điều trị huyết áp, bao gồm thuốc lợi tiểu, β-blockers, thuốc đối kháng thụ thể angiotensin II và thuốc ức chế men chuyển angiotensin, trong các sản phẩm có nguồn gốc thảo dược bằng phương pháp UHPLC-ESI.

Phương pháp phân tích MS/MS sử dụng cột Zorbax ® SB-C18 với pha động bao gồm methanol và dung dịch acid acetic 0,1%, trong đó methanol được sử dụng làm dung môi chiết mẫu Phương pháp này có giới hạn phát hiện từ 0,02 đến 2,51 mg/L và độ chính xác đạt từ 80,56 đến 111,28% Kết quả phân tích từ 34 mẫu sản phẩm cho thấy có 3 mẫu chứa thuốc lợi tiểu hydrochlorothiazid và 2 mẫu có furosemid.

Seok Heo và cộng sự (2017) đã áp dụng phương pháp LC-MS/MS để phân tích đồng thời 35 hợp chất điều trị tăng huyết áp có trong thực phẩm bổ sung Nghiên cứu sử dụng cột Waters Atlantis C18 (150 mm) để đạt được kết quả chính xác.

Phương pháp phân tích sử dụng cột 11 × 2,1 mm ID, 3 μm với pha động là dung dịch amoni acetat 0,5 mM trong nước và amoni acetat 0,5 mM trong ACN, áp dụng theo chương trình gradient Mẫu được chiết xuất 1g bằng cách siêu âm trong MeOH trong 30 phút Độ nhạy của phương pháp được xác định với LOD và LOQ lần lượt là 0,20 – 20,0 ng/g và 0,50 – 60,0 ng/g, cho thấy độ tuyến tính cao trong quá trình phân tích.

R 2 > 0,999 Độ chính xác trong ngày và khác ngày đạt 84,36 -115,82 % và 83,78 -118,69 % Độ thu hồi đạt từ 80,81-117,86%, RSD 0,99 và độ chệch trong giới hạn ± 15% và nhỏ hơn 20% ở mức nồng độ thấp nhất.

3.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) Để đánh giá LOD, LOQ của phương pháp chúng tôi dựa vào độ lệch chuẩn khi phân tích trên nền mẫu tự tạo Tạo mẫu thử cao khô hoặc cao lỏng có nồng độ cỏc chất phõn tớch trong dịch chiết mẫu khoảng 0,25 àg/mL Phõn tớch mẫu thử 10 lần lặp lại theo quy trình đã xây dựng, tính giá trị trung bình x và độ lệch chuẩn

Để tính toán LOD, sử dụng công thức LOD = 3SD và LOQ = 10SD Tính R theo công thức R = x / LOD; nếu giá trị R nằm trong khoảng 4 ≤ R ≤ 10 thì nồng độ dung dịch thử được coi là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy Kết quả về LOD và LOQ của phương pháp được trình bày trong Bảng 3.8 và 3.9.

Bảng 3.8: Kết quả thẩm định LOD, LOQ của phương pháp trên nền mẫu cao khô

Hoạt chất Thử 1 Thử 2 Thử 3 Thử 4 Thử 5 Thử 6 Thử 7 Thử 8 Thử 9 Thử 10

S thử (mAu) 97,20 98,30 100,20 99,60 100,90 105,70 100,70 103,90 102,7 104,3 Hàm lƣợng (àg/g) 5,75 5,84 5,99 5,92 5,96 6,43 6,04 6,21 6,23 6,33

Giỏ trị trung bỡnh: 6,07 àg/g; SD = 0,89; LOD: 0,03 àg/mL tương ứng với 0,66 àg/g chế phẩm

LOQ: 0,10 àg/mL tương ứng với 2,21 àg/g chế phẩm; R = 9,1

Bảng 3.8: Kết quả thẩm định LOD, LOQ của phương pháp trên nền mẫu cao khô (Tiếp)

Bảng 3.9: Kết quả thẩm định LOD, LOQ của phương pháp trên nền mẫu cao lỏng

Hoạt chất Thử 1 Thử 2 Thử 3 Thử 4 Thử 5 Thử 6 Thử 7 Thử 8 Thử 9 Thử 10

Giỏ trị trung bỡnh: 1,15 àg/mL; SD = 0,07; LOD: 0,04 àg/mL tương ứng với 0,21 àg/mL chế phẩm

LOQ: 0,14 àg/mL tương ứng với 0,69 àg/mL chế phẩm; R = 5,6

Bảng 3.9: Kết quả thẩm định LOD, LOQ của phương pháp trên nền mẫu cao lỏng (Tiếp)

Giỏ trị trung bỡnh: 1,46 àg/mL; SD = 0,08; LOD = 0,05 àg/mL tương ứng với 0,24 àg/mL chế phẩm

Giới hạn phát hiện (LOD) của các chất nghiên cứu dao động từ 0,03 đến 0,05 àg/mL, tương ứng với 0,66 đến 1,25 àg/g cho chế phẩm dạng cao khụ và 0,10 đến 0,24 àg/mL cho chế phẩm dạng cao lỏng Trong khi đó, giới hạn định lượng (LOQ) nằm trong khoảng 0,14 đến 0,17 àg/mL, tương đương với 8,86 đến 16,72 àg/g cho chế phẩm dạng cao khụ và 0,48 đến 0,80 àg/mL cho chế phẩm dạng cao lỏng Giá trị R từ 5,6 đến 9,5 cho thấy rằng LOD và LOQ của phương pháp là đáng tin cậy.

3.3.5 Độ chính xác Độ chính xác của phương pháp bao gồm độ đúng, độ lặp lại trong ngày và độ lặp lại khác ngày, đƣợc tiến hành trên 2 nền mẫu cao khô và cao lỏng, thêm chuẩn ở nồng độ thấp, trung bình và cao Kết quả xác định độ đúng đƣợc thể hiện qua % tìm lại và độ lặp lại đƣợc đánh giá thông qua giá trị RSD (%) của lô số liệu

* Độ đúng và độ lặp lại trong ngày:

Dung dịch chuẩn gốc được tạo ra bằng cách cân chính xác 11,2mg FUR, 10,7mg AML, 10,9mg NIF, 11,0mg SPI và 10,8mg FEL, sau đó cho vào bình định mức 10ml Tiếp theo, hòa tan các chất này bằng dung môi pha mẫu để tạo ra dung dịch chuẩn gốc.

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn nồng độ thấp, hút chính xác 4ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 25ml và thêm dung môi pha mẫu cho đủ Nồng độ các chất FUR, AML, NIF, SPI, FEL lần lượt được xác định là 178,20 àg/mL; 171,94 àg/mL; 173,84 àg/mL; 173,36 àg/mL và 171,49 àg/mL.

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn nồng độ trung bình, hút chính xác 5ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 20ml và thêm dung môi pha mẫu đến đủ thể tích Nồng độ các chất FUR, AML, NIF, SPI, FEL lần lượt là 278,43 àg/mL; 268,65 àg/mL; 271,63 àg/mL; 270,88 àg/mL và 267,95 àg/mL.

Ứng dụng phân tích mẫu trên thị trường

Phân tích 17 mẫu chế phẩm đông dược được thu thập, bao gồm 4 mẫu viên nén, 6 mẫu viên nang, 2 mẫu dung dịch, 2 mẫu bột cốm, 1 mẫu viên hoàn cứng và 2 mẫu trà túi lọc Trong số đó, 12 mẫu có chỉ định điều trị và hỗ trợ điều trị cao huyết áp, trong khi 5 mẫu có tác dụng mát gan và lợi tiểu.

Bài viết đề cập đến 13 mẫu sản phẩm được mua tại nhà thuốc, 2 mẫu gửi đi kiểm nghiệm, 1 mẫu mua tại phòng khám đông y ở Lãn Ông và 1 mẫu được đặt qua trang web của các công ty phân phối Tất cả các chế phẩm này đều có số đăng ký là thuốc hoặc thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

Kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 3.12 và minh họa ở Hình 3.7 và 3.8

Bảng 3.12: Kết quả ứng dụng phân tích trên nền mẫu thực

Mẫu AML FUR NIF SPI FEL

Sau khi phân tích 17 mẫu thực, đã xác định được 3 mẫu nghi ngờ dương tính với SPI và FEL Do đó, tiến hành chồng phổ các pic nghi ngờ với pic chuẩn, và kết quả được trình bày trong hình 3.7 và 3.8.

Hình 3.8: Sắc ký đồ phân tích mẫu thử THA11, TLT 1 và TLT 5

Chú thích: Đường màu xanh là phổ thử Đường màu đỏ là phổ chuẩn

Hình 3.9 Chồng phổ các pic nghi ngờ của mẫu thử THA11, TLT 1 và TLT 5

Trên 17 mẫu thực tế đƣợc phân tích, có 3 mẫu xuất hiện píc nghi ngờ Mẫu THA 11 và TLT 1 xuất hiện pic có thời gian lưu lần lượt là 24,135 và 24,106 gần giống thời gian lưu của SPI là 24,115 Mẫu TLT 5 xuất hiện pic có thời gian lưu là 30,750 gần giống thời gian lưu của pic FEL là 30,683 Để khẳng định các mẫu nghi ngờ là âm tính hay dương tính, tiến hành chồng phổ UV-VIS của các pic nghi ngờ so với pic chuẩn và kiểm tra độ tinh khiếp của pic Kết quả cho thấy các dáng phổ thử không trùng với dáng phổ chuẩn, hệ số chồng phổ match lần lƣợt là 20,28;

Các mẫu nghi ngờ THA 11, TLT1 và TLT5 đã được phân tích bằng phương pháp LC-MS/MS để xác định khả năng phát hiện chất phân tích và loại bỏ nguy cơ âm tính giả hoặc dương tính giả Kết quả cho thấy giá trị 518,37 và 692,31 đều nhỏ hơn 1000, cho thấy các mẫu này âm tính với các chất nghiên cứu Thông tin chi tiết được trình bày trong hình 3.9 và bảng 3.13.

Hình 3.9: Sắc ký đồ phân tích mẫu nghi ngờ bằng LC-MS

Bảng 3.13: Kết quả phân tích bằng LC-MS

Mẫu AML FUR NIF SPI FEL

Kết quả phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ trên các mẫu tự tạo THA 11, TLT01 và TLT05 tương đồng với kết quả phân tích bằng phương pháp HPLC đã được thiết lập Điều này cho thấy phương pháp này đã loại bỏ khả năng xảy ra kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả trong các mẫu tự tạo và mẫu thử đông dược.

BÀN LUẬN

Tạo nền mẫu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chế tạo hai dạng nền mẫu, bao gồm cao khô và cao lỏng, từ hai bài thuốc hiệu quả trong điều trị hai thể tăng huyết áp khác nhau.

Mẫu nền dạng cao khô và cao lỏng 1 được chiết xuất từ bài thuốc lục vị hoàn, bao gồm 6 vị thuốc: thục địa, hoài sơn, mẫu đơn bì, trạch tả, bạch linh, và sơn thù du Bài thuốc này có tác dụng bổ can thận, đặc biệt hiệu quả cho bệnh nhân cao huyết áp thể can thận âm hư Ngoài ra, nó còn được áp dụng trong các trường hợp tăng huyết áp kèm theo triệu chứng đau vùng ngực và đau tim.

Mẫu nền dạng cao khô và cao lỏng 2 được chiết xuất từ bài thuốc hạ áp bao gồm 7 vị dược liệu: thục địa, rễ nhàu, mã đề, hoa hòe, ngưu tất, trạch tả, và táo nhân Những thành phần này có công năng hóa đờm, trừ thấp, và được sử dụng hiệu quả trong điều trị tăng huyết áp thể đởm thấp.

Tiến hành tạo mẫu nền cao khô và cao lỏng hỗn hợp từ hai mẫu nền 1 và 2 với tỷ lệ 1:1 Mẫu nền cao hỗn hợp này đại diện cho các chế phẩm đông dược hạ huyết áp, bao gồm các vị thuốc chính như rễ nhàu để hạ áp, táo nhân để an thần, trạch tả và ngưu tất để lợi tiểu, cùng với hòe hoa giúp bền thành mạch.

So với các nghiên cứu trước đây về chất trộn trái phép trong chế phẩm đông dược hạ huyết áp và lợi tiểu, nghiên cứu này sử dụng nền mẫu khác biệt, tập trung vào cao khô và cao lỏng thay vì các dạng sản phẩm rắn như viên hoàn hay trà hòa tan Điều này bởi vì cao khô và cao lỏng là thành phần chính có tác dụng trong các chế phẩm đông dược, ảnh hưởng lớn đến kết quả phân tích, trong khi tá dược sử dụng trong bào chế các dạng chế phẩm cụ thể không có tác động đáng kể đến quá trình này Ngoài ra, thị trường còn tồn tại nhiều sản phẩm khác ngoài dạng rắn.

Có 50 dạng lỏng có tác dụng hạ huyết áp và lợi tiểu Hai dạng nền mẫu cao khô và cao lỏng này có tính đại diện rộng hơn so với các nghiên cứu trước, mà không cần đến phương pháp chế tạo nền mẫu phức tạp.

Xây dựng phương pháp phân tích

4.2.1 Lựa chọn phương pháp phân tích

Phương pháp HPLC hiện nay là phương pháp phân tích phổ biến tại Việt Nam, được áp dụng tại 100% các trung tâm kiểm nghiệm tuyến tỉnh cho các chế phẩm thuốc, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm HPLC có nhiều ưu điểm như độ đặc hiệu, độ nhạy cao và độ chính xác đảm bảo Cấu trúc hóa học của FUR, AML, NIF, SPI và FEL chứa vòng thơm và nối đôi liên hợp, cho phép hấp thụ UV, là cơ sở để thực hiện định lượng bằng HPLC với detector DAD Ngoài HPLC, một số phương pháp khác như TLC và LC-MS cũng được sử dụng, nhưng TLC có thể dẫn đến kết quả dương tính giả do tính đặc hiệu không cao, trong khi LC-MS mặc dù vượt trội về độ nhạy và đặc hiệu nhưng khó ứng dụng rộng rãi do trang thiết bị hiện tại Do đó, HPLC được lựa chọn là phương pháp phù hợp và có khả năng phổ biến rộng rãi.

4.2.2 Về phương pháp xử lý mẫu

Xử lý mẫu trong phân tích là bước quan trọng ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp phân tích Để xác định chất tân dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược, việc xử lý mẫu cần đạt yêu cầu tách và làm sạch tối ưu Lựa chọn dung môi chiết và phương pháp hòa tan phù hợp giúp phát hiện các chất tân dược trong nền mẫu phức tạp, đồng thời hạn chế hòa tan các hoạt chất trong dược liệu, nhanh chóng và tiết kiệm chi phí cho quá trình phân tích.

Kết quả khảo sát cho thấy, trong quá trình xử lý mẫu bằng các dung môi như acetonitril, methanol, methanol - nước (50:50) và acetonitril - nước (50:50), hai dung môi acetonitril và methanol không phù hợp do pic của các chất phân tích đều xấu và không cân đối Ngược lại, hai dung môi chiết còn lại là acetonitril - nước (50:50) cho kết quả khả quan hơn.

50) và methanol - nước (50 : 50) đều cho sắc ký đồ đẹp, cân đối Dịch chiết thu đƣợc sạch, hiệu suất chiết khá cao với nền mẫu dạng cao khô (94,2 - 97,5% và 91,1

- 95,8%) Tuy nhiên trên nền mẫu dạng cao lỏng, dung môi acetonitril - nước (50 :

50) cho hiệu xuất chiết cao hơn (89,8 - 101,6 % so với 87,7 - 91,7%) Do vậy, việc lựa chọn dung môi acetonitril - nước (50 : 50) làm dung môi chiết là phù hợp Với quy trình chiết suất đơn giản là lắc siêu âm mẫu thử với dung môi chiết acetonitril – nước ( 50 : 50) trong 15 phút, thời gian chiết ngắn hơn so với nghiên cứu của Trần Lệ Hoa [9] là sử dụng dung môi chiết MeOH lắc siêu âm trong 30 phút nhưng thu đươc hiệu xuất chiết trên nền mẫu rắn đồng đều giữa các hoạt chất hơn hơn (94,2 – 97,5% so với 83,47 – 105,51%) Quy trình chiết suất đạt hiệu suất chiết tương tự trong nghiên cứu của Trần Thị Hoài Ân [2] là sử dụng dung môi chiết MeOH – nước (70 : 30) lắc siêu âm trong 15 phút (94,2 – 97,5% so với 93,11 – 97, 52%)

4.2.3 Về xây dựng phương pháp HPLC Điều kiện sắc ký đƣợc tối ƣu hóa dựa trên sự chọn lựa giữa thành phần, tỷ lệ pha động và sự lựa chọn cột thích hợp Các thành phần đƣợc thay đổi trong pha động gồm methanol, acetonitrile đƣợc thay đổi tỷ lệ thành phần với các dung dịch H3PO4 0,1%; đệm phosphate 0,05M (pH 3,0) Qua quá trình khảo sát 1 số hệ pha động, lựa chọn pha động 3 gồm acetonitrile và dung dịch

H3PO4 0,1% được sử dụng để duy trì áp suất thấp nhất qua cột, nhằm ngăn ngừa áp suất cao trong hệ thống HPLC Sự chênh lệch áp suất qua cột giữa ba pha động xuất phát từ thành phần và tỷ lệ khác nhau của chúng, dẫn đến độ nhớt của các pha động cũng khác nhau, ảnh hưởng đến khả năng di chuyển của chúng qua cột pha tĩnh.

Quá trình phân tích bằng pha động 3 cho sắc ký đồ đẹp và cân đối Tuy nhiên, việc chạy đẳng dòng có thể kéo dài thời gian lưu của FEL Do đó, thiết lập chế độ gradient giúp giảm thời gian phân tích và làm sạch cột hiệu quả hơn.

Bước sóng phân tích được chọn là 238 nm vì nó gần với bước sóng hấp thu cực đại của cả 5 chất, đồng thời là cực đại hấp thụ của FEL, chất có độ hấp thụ UV thấp nhất trong nhóm Lựa chọn này tương đồng với một số nghiên cứu quốc tế về thuốc chống tăng huyết áp và lợi tiểu, như nghiên cứu của Mariusz Stolarczyk sử dụng HPLC-DAD với bước sóng 230 nm và nghiên cứu của D.Jothieswari áp dụng RP-HPLC với bước sóng 239 nm.

Tiến hành thẩm định phương pháp HPLC theo hướng dẫn của AOAC 2016, đánh giá các chỉ tiêu như độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính, độ đúng và độ chính xác trên cả mẫu tự tạo dạng rắn và lỏng Độ đặc hiệu được kiểm tra thông qua mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn Kết quả cho thấy sắc ký đồ của dung dịch trắng không có pic với chất phân tích, trong khi mẫu trắng thêm chuẩn cho pic trùng với chất chuẩn, với các pic cân đối và hệ số phân giải tốt Hệ số chồng phổ giữa chuẩn và thử nghiệm nằm trong khoảng 999,951 – 999,998, và hệ số tinh khiết pic đạt từ 998,7 – 999,9.

Khoảng tuyến tính của các chất nghiên cứu được xây dựng trong phạm vi nồng độ từ 0,2 – 20 àg/mL, với sự tương quan tuyến tính cao (R² > 0,997) Độ thu hồi theo đường chuẩn tại từng điểm đạt từ 81,6 – 108,9% Với khoảng tuyến tính này, các hoạt chất nghiên cứu có thể được phát hiện ngay cả khi tỷ lệ được trộn rất nhỏ trong mẫu.

Trong phương pháp xây dựng, các chất phân tích có giới hạn phát hiện (LOD) từ 0,03 - 0,05 àg/mL và giới hạn định lượng (LOQ) từ 0,10 – 0,17 àg/mL Cụ thể, LOD tương đương với 0,66 đến 1,25 àg/g cho chế phẩm dạng rắn và 0,14 – 0,24 àg/mL cho chế phẩm dạng lỏng LOQ tương ứng là 2,21 đến 4,18 àg/g cho chế phẩm dạng cao khụ và 0,48 – 0,80 àg/mL cho chế phẩm dạng lỏng Phương pháp này có LOD và LOQ cao hơn so với phương pháp UPLC của Seok Heo.

[21] với LOD và LOQ của mẫu rắn là 0,20 – 1,00 và 0,60 – 3,00 μg/mL, của mẫu lỏng là 0,3 – 1,20 và 0,9 – 3,60 μg/mL

So với nghiên cứu của Trần Lệ Hoa [9] về phát hiện 4 chất chống tăng huyết áp (amlodipin, felodipin, nifedipin và valsartan) bằng phương pháp HPLC, nghiên cứu này đã cải tiến bằng cách thực hiện trên ắ chất (NIF, FEL, AML và 2 thuốc lợi tiểu) với tốc độ dòng 1,0 mL/phút và thời gian phân tích 38 phút, giúp tiết kiệm thời gian và lượng dung môi Quá trình tách các chất đạt độ phân giải tốt hơn, trong khi nghiên cứu [9] gặp vấn đề dâng nền khi phân tích FEL LOD của phương pháp này thấp hơn, với AML và NIF khoảng 0,5 µg/mL và FEL khoảng 0,25 µg/mL, nhờ vào bước sóng 238 nm có độ hấp thụ UV-VIS cao hơn 360 nm và thể tích tiêm 50 µL Phương pháp cũng có tính bao quát hơn khi phân tích cả nền mẫu rắn và mẫu lỏng Độ thu hồi của phương pháp đạt từ 96,4 – 107,9% và RSD từ 0,42 – 3,27% trên nền mẫu cao khô và cao lỏng, tương đương với các nghiên cứu gần đây trong nước về nhóm chất chống tăng huyết áp và lợi tiểu [2], [9].

Ứng dụng của phương pháp

Thu thập mẫu thử: Tiến hành thu thập 17 mẫu thử gồm các dạng bào chế rắn:

4 mẫu viên nén, 6 mẫu viên nang, 2 mẫu bột cốm, 1 mẫu viên hoàn cứng và 2 mẫu trà túi lọc và dạng bào chế lỏng: 2 mẫu dung dịch

Kết quả phân tích 17 mẫu thử thu đƣợc có 3 mẫu nghi ngờ là THA11 và TLT

Dựa trên kết quả chồng phổ UV-VIS và độ tinh khiết của các pic nghi ngờ, có thể khẳng định rằng các mẫu nghi ngờ trộn SPI, TLT và FEL đều âm tính với các chất nghiên cứu.

Phân tích các mẫu tự tạo và mẫu thử nghi ngờ bằng sắc ký lỏng khối phổ cho kết quả tương tự như phương pháp đã xây dựng, điều này chứng minh rằng đã loại bỏ khả năng dương tính giả và âm tính giả trên các nền mẫu đông dược.

Các mẫu thử được chọn đều có số đăng ký là thuốc hoặc thực phẩm bảo vệ sức khỏe, với nguy cơ thấp chứa chất cấm Nghiên cứu chưa phân tích các mẫu có nguy cơ cao như mẫu không rõ nguồn gốc, không có số đăng ký, không có nhãn tiếng Việt nhưng được quảng cáo là có tác dụng phòng ngừa tăng huyết áp, đột quỵ, cải thiện tuần hoàn máu não với giá thành cao như sản phẩm an cung ngưu hoàng Việc thu thập mẫu thuốc y học cổ truyền điều trị huyết áp gặp khó khăn do yêu cầu khám bệnh mới có thể kê đơn thuốc, dẫn đến việc thu thập chỉ hạn chế ở một số sản phẩm hỗ trợ trên thị trường, chưa tiếp cận được nhiều với các sản phẩm "thuốc đông y gia truyền".

Trong thời gian tới, cần tiếp tục nghiên cứu để đánh giá khách quan tình trạng trộn lẫn trái phép thuốc hóa dược trong các sản phẩm đông dược điều trị và hỗ trợ điều trị cao huyết áp, nhằm bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

Từ các kết quả thu đƣợc chúng tôi có những kết luận sau:

1 Đã xây dựng được phương pháp xác định Amlodipin Besylat, Felodipin Furosemid, Nifedipin, Spironolacton trộn lẫn trong chế phẩm đông dƣợc điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh tăng huyết áp, lợi tiểu trên nền mẫu rắn và lỏng bằng HPLC Phương pháp xử lý mẫu nhanh, đơn giản, mẫu thử được chiết siêu âm bằng hỗn hợp acetonitril- nước tỷ lệ (50:50) trong thời gian 15 phút Điều kiện sắc ký thụng thường với Cột Apollo – C18 (4,6mm ì 25cm; 5àm), pha động gồm acetonitril và dung dịch acid phosphoric 0,1% chạy theo chương trình gradient Chất phân tích được phát hiện bằng detector UV-VIS tại bước sóng 238 nm Cả 5 chất nghiên cứu đƣợc tách riêng biệt, pic cân xứng, đạt độ phân giải đường nền trong thời gian 38 phút

2 Đã thẩm định phương pháp phân tích xây dựng theo hướng dẫn của AOAC

Phương pháp phân tích được thực hiện trên hai nền mẫu dạng cao khô và cao lỏng, với khoảng tuyến tính từ 0,20 – 20 µg/mL và hệ số tương quan R² > 0,997 Phương pháp này thể hiện độ nhạy cao với giới hạn phát hiện (LOD) từ 0,03 – 0,05 µg/mL Độ chính xác và độ đúng của phương pháp đạt yêu cầu theo quy định, với tỷ lệ thu hồi từ 96,4 – 107,9% và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) từ 0,42 – 3,77% Các kết quả này đáp ứng các tiêu chí thẩm định phương pháp phân tích theo tiêu chuẩn AOAC.

3 Đã ứng dụng phương pháp phân tích trên 17 mẫu đông dược có chỉ định cho người cao huyết áp, bí tiểu thu thập trên thị trường Kết quả chưa phát hiện trường hợp trộn lẫn 5 chất phân tích trong chế phẩm

Đề xuất áp dụng phương pháp nghiên cứu nhằm phát hiện các chất cấm trong sản phẩm đông dược đang lưu hành trên thị trường Điều này giúp đánh giá một cách khách quan tình trạng trộn lẫn thuốc hóa dược trái phép trong các sản phẩm đông dược được sử dụng để điều trị và hỗ trợ điều trị cao huyết áp.

Phát triển phương pháp HPLC cho các thuốc hạ huyết áp và lợi tiểu trong chế phẩm đông dược nhằm kiểm soát tính an toàn của sản phẩm trên thị trường, đảm bảo lợi ích tốt nhất cho người tiêu dùng.

Định dạng
Số trang	155
Dung lượng	4 MB