Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập từ hoa cây gạo

Trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài ''Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ hoa cây Gạo”, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫ

TRƯÒTVG ĐẠI HỌC • • Dược • HÀ NỘI•

NGUYỄN THỊ NGUYÊN

NGHIÊN CÚtJ XÂY DựNG PHƯƠNG

CHẤT PHÂN LẬP TỪ HOA CÂY GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP • • Dược • s ĩ

Giáo viên hưÓTig dẫn:

PGS TS Thái Nguyễn H ùng Thu

Trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài ''Nghiên cứu xây dựng

phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ hoa cây Gạo”,

tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình, chu đáo của các thầy cô, bạn bè và gia đình Nhờ có sự giúp đỡ quý báu đó đã giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Thái Nguyễn Hùng Thu, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, dành nhiều thời gian và công sức giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Đồng thời, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thái An - Bộ

môn Dược Liệu, NCS Hồ Thị Thanh Huyền và DS Phạm Lê Minh đã luôn quan

tâm, động viên, giúp đỡ, cho tôi những ý kiến đóng góp quý báu

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Tnrờng Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô giáo trực tiếp tham gia giảng dạy, các anh chị kỹ thuật viên đã truyền cho tôi những kiến thức thực sự bổ ích trong suốt quá trình học tập tại tmờng

Và cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ và tạo điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, để tôi có được kết quả ngày hôm nay

Tôi xin chân thành cảm cm !

Hà Nội ngày 14 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Nguyễn Thị Nguyên

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỰC CÁC HÌNH ẢNH, Đ ồ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I-T Ổ N G QUAN 2

1.1 TỐNG QUAN VỀ CÂY GẠO 2

1.1.1 Đặc điểm thực v ậ t 2

1.1.2 Phân bố 2

1.1.3 Bộ phận dùng, thu hái và chế biến 3

1.1.4 Thành phần hóa học của hoa G ạo 3

1.1.5 Tác dụng sinh học của hoa G ạo 3

1.1.6 Tính vị, công năng, chủ trị theo y học dân gian 4

1.2 VÀI NÉT VỀ HAI CHẤT PHÂN LẬP Đ ư ợ c TỪ HOA CÂY GẠO 5

1.2.1 Aurantiamid acetat 5

1.2.1.1 Nguồn gốc: 5

1.2.1.2 Tính chất 5

1.2.1.3 Tác dụng 6

1.2.2 Ergosterol peroxid 6

1.2.2.1 Nguồn g ốc 6

1.2.2.2 Tính chất 6

1.2.2.3 Tác dụng 7

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP H PLC 7

1.3.1 Nguyên tắc của quá trình sắc ký 7

1.3.2 Các thông số đặc trưng trong HPLC 9

1.3.3.1 Định tính dược liệu 12

1.3.3.2 Định lượng 12

1.4 VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỒ (LC-M S) 14

1.4.1 Khối phổ 14

1.4.1.1 Nguồn ion (lon source) 14

1.4.1.2 Thiết bị phân tích khối phổ (Mass Analyzer) 15

1.4.1.3 Detector 15

1.4.2 Một số kỹ thuật LC-M S 16

1.4.3 ứ ng dụng của phân tích khối phổ trong định tính các ch ất 16

PHẦN II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PÍĨƯƠNG PHÁP NGHIÊN C Ú tJ 17

2.1 ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIỂT B Ị 17

2.1.1 Đối tư ợng 17

2.1.2 Hóa chất và thiết b ị 17

2.1.2.1 Hóa c h ấ t 17

2.1.2.2 Thiết b ị 17

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u 18

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 18

2.3.1 Xử lý và chuẩn bị mẫu thử 18

2.3.2 Chuẩn bị dung dịch đối chiếu gốc (chuẩn gốc) 20

2.3.3 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 20

2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 21

2.3.4.I Độ phù họp của hệ thống sắc k ý 21

2.3A.2 Tính đặc hiệu 21

2.3.4.3 Khoảng nồng độ tuyến tính, đường chuẩn 21

2.3.4.4 Độ lặp lại của phương p h áp 22

2.3.4.6 Giói hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 22

2.3.5 Phương pháp xử lý kết q u ả 23

2.3.4.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 23

2.3.5 Phương pháp xử lý kết q u ả 23

PHẦN III - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN L U Ậ N 24

3.1 XỬ LÝ VÀ CHUẨN BỊ MẪU THỬ 24

3.1.1 Hàm ẩm của dược liệ u 24

3.1.2 Hiệu suất chiết 24

3.2 KHẢO SÁT XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN SẮC K Ý 25

3.3 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN C Ú tJ 26

3.4 ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CÚXl TRONG HOA GẠO 27

3.5 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 29

3.5.1 Khảo sát sự phù họp của hệ thống sắc k ý 29

3.5.2 Khảo sát tính đặc hiệu 30

3.5.3 Khảo sát độ lặp lại 31

3.5.4 Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 31

3.5.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 33

3.5.6 Khảo sát độ đúng 34

3.6 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÊ ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG HOA G Ạ O 35

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36

KỂTLƯẬN 36

ĐỀ X U Ấ T 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

S T T Chữ viết tắt Chữ đầy đủ

Spectrometry)

STT Ký hiệu Tên bảng Trang

ST T Kí hiệu Tên hình Trang

8 Hình 3.1 Sắc ký đồ hỗn họp chất nghiên cứu aurantiamid acetat và

12 Hình 3.5 Phô khổi lượng ứng với pic của aurantiamid acetat trên

13 Hình 3.6 Phổ khối lượng ứng với pic của ergosterol peroxid trên

sắc ký đồ của mẫu thử hoa Gạo và hỗn họp chất đối chiểu 28

15 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic

16 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic

ĐẶT VẤN ĐỀ

Như chúng ta đã biết, cây Gạo còn có tên gọi khác là Mộc miên, Gòn rừng, cổ

bối là một loài rất gần gũi và quen thuộc với mỗi người dân Việt Nam đặc biệt là người dân miền Bắc Cây Gạo phân bố nhiều ở các tỉnh từ Quảng Bình trở ra, được trồng nhiều không chỉ đế lấy bóng mát mà còn là nguồn dược liệu quý sẵn có Theo kinh nghiệm dân gian, người dân đã quen thu hái nhiều bộ phận khác nhau từ cây Gạo để phòng và chữa bệnh, trong đó hoa Gạo được sử dụng cho người thiếu máu nhược sắc, rong kinh, đa kinh, chảy máu dạ dày, mất máu sau mổ, giúp ăn ngủ tốt, tăng cân [4], [5], [9]

Trên thế giới, nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu hóa thực vật cũng như thử tác dụng sinh học của hoa Gạo và cho kết quả rất đáng ngạc nhiên về tiềm năng chữa các bệnh “thời đại” như tác dụng bảo vệ tim mạch [40], hạ huyết áp [33], bảo vệ gan [30] ở Việt Nam, NCS Hồ Thị Thanh Huyền là người đầu tiên nghiên cứu toàn diện về hoa cũng như tất cả các bộ phận của cây Gạo, đã nhận biết, chiết xuất và phân lập được một số thành phần từ hoa Gạo là aurantiamid acetat, ergosterol peroxid Tuy nhiên, hiện nay chưa có tài liệu nào trên thế giới cũng như tại Việt Nam công bố hàm lượng các thành phần hoạt chất trong hoa Gạo

Đe làm rõ hơn về hàm lượng các họfp chất phân lập được có trong hoa Gạo, đề

tài '"Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân

lập được từ hoa cây Gạo'' đã được thực hiện với mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định quy trình định tính và định lượng đồng thời aurantiamid acetat và ergosterol peroxid trong hoa Gạo bằng phương pháp HPLC

để góp phần vào việc tiêu chuẩn hóa chất lượng vị thuốc hoa Gạo.

2 ưng dụng phươiig pháp đê sơ bộ xác định hàm lưọng aumntiamid acetat và ergosterol peroxid trong một mẫu hoa Gạo thu hái được.

Hĩnh 1.1 Hình ảnh cây Gạo

PHẦN I - TỎNG QUAN

1.1 TÓNG QUAN VỀ CÂY GẠO

1.1.1 Đặc điểm thực vật

- Cây Gạo còn gọi là Gòn rừng, Gạo

rừng, Mộc miên thụ, Mạy mìn, Mạy nghịu,

Bông Gạo, Anh hùng thụ, Hồng miên, c ổ

bối [8], [13],

- Tên khoa học: Bombax malabaricum

DC Thuộc họ Gạo (Bombacaceae) [8], [13]

- Cây Gạo có thể cao tód 15 m hoặc hơn,

thân gỗ sần sùi, có bạnh vè to ở gốc và có gai

- Quả nang 5 cạnh, hình thoi, dài 8-15 cm, khi chín nứt thành 5 mảnh [13], Hạt hình trứng, màu nâu [5]

1.1.2 Phân bố

- Trên thế giói, cây Gạo phân bố ở nhiều châu lục như châu ú c , châu Mỹ, châuÁ Đặc biệt cây sống rất phổ biến ở các vùng nhiệt đới Châu Á như: Bhutan,Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal, Philippines, Sri Lanka, Thái Lan, Việt Nam [5], [18]

- ở Việt Nam, cây Gạo được trồng chủ yếu ở các tỉnh từ Quảng Bình trở ra Cây thường mọc tự nhiên ở đất trống ven rừng, đồi và nhất là dọc theo các bờ sông suối Cây hay được trồng ở đình chùa, ven đường, hay đầu làng để lấy bóng mát [13]

1.1.3 Bộ phận dùng, thu hái và chế biến [5], [8], [13],

Toàn cây được sử dụng cho các mục đích khác nhau:

- Vỏ thân: thu hái quanh năm, tốt nhất vào mùa xuân Có thể dùng tươi hoặc rửa sạch, phơi khô để dùng

- Rễ: thu hái vào mùa xuân hay mùa thu, rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô

- Hoa: hái vào mùa xuân, có thể dùng tươi hoặc phơi khô

- Gôm, gỗ, nhựa, hạt, quả, bông: thu hái, chế biến phù họp với mục đích sử dụng như làm bông, nệm, gối

1.1.4 Thành phần hóa học của hoa Gạo

- Trong hoa Gạo chứa nhiều acid amin, đường, pectin, saponin, flavonoid, tanin, nhiều nguyên tố vi lượng [4], Theo [13] nụ hoa và đài (tính theo dược liệu tươi) chứa protein thô theo thứ tự lần lượt là 1,38 mg% và 1,56 mg%, carbohydrat 1L95

mg% và 13,87 mg%, chất vô cơ 1,09 mg% và 1,00 mg%, Ca 92,25 mg% và 95

mg%, p 49 mg% và 41 mg%, Mg 54 mg% và 24,64 mg%.

- Từ dịch chiết methanol của hoa khô B.malaharicum, một số tác giả ở Trường

Đại học Dược Hà Nội đã phân lập được hai chất là aurantiamid acetat và ergosterol peroxid [7]

1.1.5 Tác dụng sinh học của hoa Gạo

Kết quả của nhiều công trình nghiên cứu cho thấy hoa Gạo có nhiều tác dụng dược lý quan trọng:

• Tác dụng chống oxy hóa

Năm 2009, bằng phương pháp dùng DPPH, peroxynitrit; Vieira và các cộng sự

đã chứng minh tác dụng chống oxy hóa của cắn methanol chiết xuất từ hoa Gạo [41]

Năm 2011, cũng bằng phương pháp dùng DPPH, các nhà khoa học khác cũng chỉ ra tác dụng chống oxy hóa của cắn hoa Gạo với một số hệ dung môi khác nhau như nước, ethanol 50%, aceton 80%, n-hexan Các kết quả nghiên cứu còn chỉ ra rằng các cắn chiết xuất được có khả năng chống oxy hóa vượt trội hơn acid ascorbic hay gallic [18], [42],

• Tác dụng bảo vệ tim mạch

Theo [40], dịch chiết nước hoa Gạo có tác dụng chống lại nhồi máu cơ tim do adriamycin gây ra trên chuột

• Một số tác dụng dược lý khác

Năm 2011, Said A chứng minh khi dùng cắn methanol với liều 250 mg/kg và

500 mg/kg có tác dụng giảm đau ngoại vi ở chuột Đồng thời, tác giả còn công bố các tác dụng chống viêm, chống ung thư, kháng khuẩn, chống kí sinh trùng sốt rét của hoa Gạo [32],

1.1.6 Tính vị, công năng, chủ trị theo y học dân gian

Theo [13], [14], hoa Gạo có vị ngọt, tính mát và có tác dụng thanh nhiệt, lợi tiểu.Hoa Gạo được dùng trị viêm ruột, lỵ, làm trà uống vào mùa hè Nước hoa Gạo được xem như có tác dụng bổ âm, dùng chữa thiếu máu do suy nhược hay các nguyên nhân khác (rong kinh, đa kinh, chảy máu dạ dày - tá tràng, mất máu do mổ)

và trong cả trường hợp suy tủy [5],

Chữa tiêu chảy, kiết lỵ; Hoa Gạo sao vàng 20-30 g, sắc lấy nước uống, chia 2 lần hoặc có thể thêm rau má 20-30 g, sắc uống ngày 1 thang, chia 2 lần [4], [9].Khoa tiêu hóa và huyết học bệnh viện Trung ương quân đội 108 đã dùng 100

mL nước sắc cao lỏng 2:1 của hoa Gạo khô cho bệnh nhân thiếu máu nhược sắc do

rong kinh, đa kinh, chảy máu dạ dày - tá tràng, mất máu sau mổ đạt kết quả tót.

1.2 VÀI NÉT VỀ HAI CHẤT PHÂN LẬP Đ ư ợ c TỪ HOA CÂY GẠO

1.2.1 Aurantỉamid acetat

1.2.1.1 Nguồn gốc

- Aurantiamid acetat là hợp chất đã được tìm thấy từ nhiều loài khác nhau: nó có

thể phân lập được từ các loài Acantophora spicifera, Aspergillus penicỉlloides [20],

từ thảo dược Brillantaisia lamium [38] Phân lập từ vỏ cây Albizia adianthifolia [39], hoặc từ vỏ cây Pỉerreodendron kerstingii, một loài thực vật thuộc họ

Hình 1.2 Công thức cẩu tạo của aurantiamid acetat

- Tên khoa học: N-benzoyl-1-phenylalanyl-l-pheylalaninol acetate.

- Tính chất vật lý: [36]

Aurantiamid acetat là chất bột màu trắng, tinh thể

không màu, hình kim, tan tốt trong methanol, aceton,

1.2.1.3 Tác dụng

- Theo Jean De Dieu Tamokou và cộng sự, aurantiamid acetat có tác dụng kháng

khuẩn, tăng tác dụng của kháng sinh, ức chế sự phát triển của một số nấm và vi

khuân như Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Salmonella typhi,

Candida albicans và Candida tropicaỉis [38], tác dụng oxi hóa và kháng khuẩn này

cũng được nhiều nghiên cứu khác đề cập tới [39]

- Theo [26], aurantiamid acetat ức chế sản xuất TNF-a và IL-2 nên có tác dụng chống viêm, giảm tình trạng viêm trong các bệnh như viêm khớp dạng thấp, vảy nến, lupus ban đỏ hệ thống Với liều 10 mg/kg, aurantiamid acetat có tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm khóp ở chuột [20], điều này phù họp với kết quả nghiên cứu chống viêm trong hoa Gạo đã được trình bày ở trên

1.2.2 Ergosterol peroxid

1.2.2.1 Nguồn gốc

- Hợp chất ergosterol peroxid đã từng được phân lập từ nhiều nguồn nguyên liệu

khác nhau như: từ các loài nấm Lactarium volemus [21], Daedalea quercina [22],

Aspergillus sp [19], [29], Sarcodon aspratus [32],

- Phân lập từ Trùng thảo Cordyceps cicadae [28], Cordyceps sinensis [16], [34],

- Năm 2012, làn đầu tiên ở Việt Nam, một số tác giả Trường Đại học Dược Hà Nội đã phân lập được ergosterol peroxid từ hoa cây Gạo [7]

1.2.2.2 Tính chất [29]

- Công thức phân tử: C 2 8 H 4 4 O 3 (M = 428)

Hình 1.5 Hình ảnh tinh thê ergosterol peroxid.

- Tên khoa học: 5a,8a-epidioxyergosta-6,22-dien-3P-ol

- Tính chất vật lý [3\\

Bột kết tinh màu trắng, tinh thể không màu, hình kim,

tan trong methanol, aceton, ethyl acetat

- Các nghiên cứu cho thấy ergosterol peroxid có tác dụng ức chế sự phát triển

của một số tế bào ung thư, đặc biệt ung thư tuyến tiền liệt, ung thư tuyển vú [10], ung thư trực tràng và ung thư tuyến ruột kết [16], [31]

- Chống oxi hóa và kháng kí sinh trùng sốt rét [27], [44]

- Ergosterol peroxid có tác dụng ức chế miễn dịch, chống dị ứng bằng cách ức chế sự tăng sinh tế bào lympho T ở những tế bào đã bị kích hoạt bởi PHA (là lectin

ở thực vật, có tác dụng kích thích sự phân bào, được dùng trong y học để kích thích

sự phân chia tế bào lympho T ở ngưòd) [43]

- Một nghiên cứu khác chứng minh ergosterol peroxid có tác dụng ức chế sự

phát triển của vi khuẩn Escherichia coli Staphylococcus aureus, sau khi so sánh các

ống nghiệm đã được ủ ở 36°c trong vòng 18 giờ của nồng độ khác nhau của chất này với sự phát triển của chủng vi sinh vật, sự tăng trưởng của vi sinh vật bị giảm đáng kể [15]

=> Những tác dụng trên cũng giải thích phần nào tác dụng sinh học của hoa Gạo

sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy vào loại pha tĩnh sử dụng.

Nguyên tẳc

Mầu phân tích được hòa tan trong pha động Pha tĩnh được cố định trong cột

theo pha động vói tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động

và chất tan Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích

dải, làm cở sở cho phân tích định tính và định lượng, sự tách này đạt được là do quá trình phân bố, hấp phụ, trao đổi ion

Các chất sau khi được rửa giải ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện

gọi là detector Tùy theo bản chất của các chất mà sử dụng detector thích hợp

Detector hay được sử dụng nhất là detector uv Đường cong rửa giải sau một quá trình sắc ký được gọi là sắc ký đồ, có chức năng đánh giá quá trình rửa giải trong cột có tốt hay không

Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao như hình 1.6 bao gồm:

1-Bình chứa dung môi pha động

7-Hệ thống máy tính gắn Hình 1.6 Mô hình cấu tạo máy HPLC.

phàn mềm nhận tín hiệu và xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC

8-In dữ liệu

1.3.2 Các thông số đặc trung trong HPLC

trong đó: Cs và Cm là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động

K tùy thuộc bản chất pha tĩnh, pha động và chất hòa tan K nhỏ: chất di chuyển nhanh; K lớn; chất di chuyển chậm Thông thường K > 1 để chất có ái lực với pha tĩnh, nếu không thì nó sẽ di chuyển nhanh quá làm cho khó tách

- Nếu Ka = Kb thì quá trình sắc ký sẽ không tách được hai chất A và B ra khỏi nhau

- Ka Kg càng nhiều thì khả năng tách hai chất A và B trong quá trình sắc ký càng lớn

b Thòi gian lưu ( íịị ) (Retention time)

Là thời gian cần thiết để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu vào hệ thống sắc

ký đến khi xuất hiện đỉnh của pic, tR là một hằng số đối với một chất nhất định So sánh thòd gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn, ta có thể định tính được chất đó

*> Thời gian chết (ím)

Là thời gian cần thiết để rửa giải một chất không bị lưu giữ

*t* Thời gian lưu hiệu chỉnh (I’r)

Là hiệu số giữa thòd gian lưu và thời gian chết

t ’ R — ĨR

-c Hệ số dung lượng k ’(Capacity factor)

Là đại lượng đặc tmng cho tốc độ di chuyển của một chất qua cột

- Nếu k’ lớn thì pic bị doãng, độ nhạy kém

- Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 1< k ’< 8 là tốt hơn cả

d Hệ số chọn lọc ịa) (Selective factor)

Là đại lượng đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất

A O r ) A ~ ^ M

Qui ước: B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên a > 1

a càng lớn, khả năng tách càng cao, 2;iá trị tối ưu là 1,5-2

e Độ phân giải (Rs) (Resolution)

Là đại lượng đăc trưng cho mức độ tách của hai chất ra khỏi nhau trên cùng một điều kiện sắc ký;

~ ^ RA ) _ ~ ^ R ạ )

trong đó:

+ ÍRA írb: thời gian lưu của 2 pic liền kề của 2 chất tan A và B (phút)

+ Wa, Wb: độ rộng đo ở các đáy pic của chất A và B (phút)

+ Wi/2A, Wi/2b’ độ rộng đáy pic ở nửa chiều cao pic của chất A và B (phút)

+ Các giá trị ÍRA, tRB Wa, Wb Wi/2a, W]/2b phải tính theo cùng một đơn vị

+ Yêu cầu Rs > 1, giá trị tối ưu là Rs = 1,5; Rs > 1,5 là không cần thiết, vì nó kéo dài thời gian phân tích

+ Wị/2o: chiều rộng pic được đo ở 1/20 chiều cao pic.

+ a: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía truớc của pic ở 1/20 chiều cao pic

Trong phép định lượng yêu cầu: 0 ,9 < AF<2

g Số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa lý thuyết (H)

Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H, lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động

Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức sau:

1/2trong đó; + W: chiều rộng đo ở đáy pic

+ W i/2: chiều rộng của pic đo ở Yi chiều cao của đỉnh.

Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là phù họp, tối thiểu là 1000 Nếu gọi L là chiều dài cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết tính theo công

thức: H - —

N

1.3.3 ứ n g dụng của HPLC trong kiểm nghiệm dưọ’c liệu

13.3.1 Định tính dược liệu [1], [2], [6]

Dựa vào sắc ký đồ của dung dich thử và dung dịch chuẩn

- So sánh thời gian lưu, kết quả định tính sẽ dưcmg tính khi thời gian lưu ÍR của các đỉnh quan tâm trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu đối chiểu phủ họp với nhau khi tiến hành HPLC phân tích trong cùng điều kiện

- Nếu chỉ dựa vào thời gian lưu để khằng định kết quả dưofng tính, nên tiến hànhsắc ký trên ít nhất hai điều kiện khác nhau

- So sánh phổ (chồng phổ) UV-VIS của chất thử với chất chuẩn trên detector DAD

- Ngoài ra có thể kết nối HPLC - phổ IR hoặc HPLC - MS định tính dựa vào nhóm chức (IR) hoặc số khối (MS)

- Để kết luận dương tính, kết quả phân tích HPLC của một dược liệu phải cho thấy nó chứa các hoạt chất hay chất đánh dấu trong thành phần, khi so sánh với kết quả HPLC trong cùng điều kiện thực nghiệm của các chất chuẩn hoạt chất hay các chất đánh dấu tương ứng

13.3.2 Định lượng [2]

- Tất cả các phương pháp định lượng bằng HPLC đều dựa trên nguyên tắc: nồng

độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó

- Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký là;

• Phương pháp chuẩn ngoại

• Phương pháp chuẩn nội

• Phương pháp thêm chuẩn

• Phưong pháp chuẩn hóa diện tích

- Trong khuôn khổ của luận văn này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại

Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic

của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử.

Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc chuẩn hóa nhiều điểm

+ Chuẩn hóa một điểm

Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử Tính nồng độ của

s

mâu thử theo công thức; Cỵ = Q —

trong đó: Cx: Nồng độ mẫu thử

Cs: Nồng độ mẫu chuẩnSx(Hx): Diện tích (chiều cao) của pic chất phân tíeh trong mẫu thử Ss(Hs): Diện tích (chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn

+ Chuẩn hóa nhiều điểm

Cách tiến hành: Chuẩn bị 1 dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm nồng độ chuẩn Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích s (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất càn xác định Có thể tính theo 2 cách:

- Áp dữ liệu diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy

ra được nồng độ của nó

- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích pic (hoặc chiều cao) với nồng độ của chất cần xác định

Y = a + b C

trong đó: Y là diện tích của pic, a là giao điểm của đường chuẩn với trục tung, b là

độ dốc của đưòmg chuẩn, c là nồng độ của chất thử

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ của chất thử

F - a

Chú Ỷ Độ lớn của diện tích hoặc chiều cao pic mẫu thử phải nằm trong đoạn

tuyến tính của đường chuẩn

1.4 VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHÔ (LC-MS) [1]

- LC-MS là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết họfp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phân tích khối phổ, phương pháp được hiểu là hỗn họp chất phân tích sau khi tách

ra khỏi cột sẽ đi qua một đường truyền đến đầu dò khối phổ Cột sắc ký lỏng cho phép tách chất cần quan tâm, khối phổ cho phép tách ion cần quan tâm và cho biết phân tử lượng của chất phân tích Một hệ thống LC- MS sẽ phân mảnh ion mẹ thành các ion con và tách các ion con để định danh và định lượng

- Một hệ LC- MS cơ bản gồm: hệ thống bơm sắc ký lỏng, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký, đầu dò khối phổ

1.4.1.1 Nguồn ion (lon source)

- Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển

thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử

- Một số kĩ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như;

+ lon hóa phun điện tử (electrospray ionization - ESI)

+ lon hóa hóa học ở áp suất Idií quyển (atmospheric-pressure chemical ionization - APCI)

+ lon hóa bắn phá nguyên tử nhanh (fast-atom bombardment - FAB)

I.4.I.2 Thiết bị phân tích khối phổ (Mass Analyzer)

Tách các ion theo tỷ số m/z Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của

từ trường, điện trường để đi đến detector Có thể phân bộ phân tích khối thành 4 loại:

- Bộ phân tích từ (Magnetic Analyser )

- Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole)

- Bộ phân tích thời gian bay (Time o f Flight Analyser - TOP)

- Bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron (Ion cyclotron resonance analyser - ICR).

Trong đề tài này, tôi sử dụng máy khổi phổ có bộ phân tích khối là bộ phân tích

tứ cực chập ba

Bộ tứ cực chập ba (Triple Quadrupole Analyser): Bộ phân tích khối gồm ba bộ

tứ cực nối tiếp nhau Bộ Q1 và Q3 làm nhiệm vụ phân tích khối, bộ Q2 làm nhiệm

vụ va chạm ion để phân tách thành các mảnh khối nhỏ hơn, đó là ion con

Hình 1.7 Sơ đồ bộ tứ cực chập ba.

Bộ phân tích tứ cực chập ba còn gọi là Tandem Mass Analyser Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này là khối phổ 2 lần (MS/MS), thường được dùng để khẳng định cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn họp nhiều thành phần chưa được tinh chế sạch

1.4.1.3 Detector

Detector có nhiệm vụ chuyển các ion đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ Hiện có 2 dạng truyền thống:

+ Nhân electron (electron myltiplier)

+ Nhân quang (photomultiplier)

1.4.2 Một số kỹ thuật LC-MS

- Kỹ thuật phân tích toàn thang (FULL SCAN)

Cho đầy đủ thông tin về các chất phân tích trong mẫu ion, tuy nhiên phương pháp này có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn

- Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM, Selected lon Monitoring)

Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo thời gian,

Kỹ thật SIM nhạy hơn FULL SCAN từ 10 tới 100 lần tùy theo thiết bị

-K ỹ thuật MS/MS

Trong kỹ thật MS/MS một ion chọn lọc ở chế độ MS lần 1 được phân tích bằng cách sử dụng năng lượng bẻ gãy, tạo ra một hoặc vài ion con đặc trưng ở chế độ phân tích MS lần 2 Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng độ nhạy do làm giảm nhiễu đường nền rất đáng kể

Trong nghiên cứu này, tôi sử dụng kỹ thuật MS/MS để định tính aurantiamid acetat và ergosterol peroxid có trong hoa cây Gạo

1.4.3 ứng dụng của phân tích khối phổ trong định tính các chất

- Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử (M +1)'^, (M+2)’^ Đây là đặc trưng quan trọng của hợp chất hóa học Bên cạnh đó, xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của chúng cùng với khối lượng của vài mảnh ion có thể xác định được công thức nguyên của chất phân tích

- Trong phân tích Dược, thường sử dụng kết nối GC-MS hoặc LC-MS Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có trong máy hoặc phổ nghiên cứu với chất đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu

PHÀN II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ

- Dung môi loại dùng cho HPLC (Merck, Đức); Methanol, Acetonitril.

- Nước cất hai lần được lọc qua máy lọc

- Các hợp chất đã phân lập được từ hoa Gạo là aurantiamid acetat và ergosterol peroxid đã được tinh chế và nhận dạng cấu trúc bằng các phương pháp phổ MS và NMR

2.1.2.2 Thiết bị

- Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS 8030 có kết nối thêm detector

SPD - 20A (có khả năng phân tích UV- VIS trong vùng 190 - 700 nm) của Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm và Mỹ phẩm Hà Nội

- Cột sắc ký Zorbax C18 (250 mm; 4,6 mm, 5 í-im) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30 mm ID)

- Máy đo pH 510 CyberScan

- Cân phân tích Mettler Toledo độ chính xác 0,01 mg

- Cân kỹ thuật SARTOTIUS

- Kính hiển vi LEICA CME

- Máy xác định độ ẩm PRECISA

- Máy cất quay BUCHI ROTA VAPOR R-200

- Máy siêu âm Brasonic (Mỹ)

20 5 0

- Máy khuẩy từ Ikamag (Đức).

- Định tính các pic trên sắc ký đồ dựa vào thời gian lưu và kết hợp với MS kết nối

- Thẩm định các điều kiện định lượng một số hợp chất trên với chất đối chiếu là các chất phân lập được đã qua nhận dạng cẩu trúc và xác định tổng tạp bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích

- Áp dụng phương Dháp HPLC để sơ bộ xác định hàm lượng 2 hợp chất trên có trong mẫu hoa Gạo thu hái được

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.3.1 Xử lý và chuẩn bị mẫu thử

Muốn định lượng được hoạt chất trong dược liệu nói chung cũng như định lượng được aurantiamid acetat và ergosterol peroxid nói riêng, vấn đề đầu tiên cần quan tâm là lựa chọn phương pháp chiết thích họp Phương pháp đó phải đảm bảo chiết kiệt được hoạt chất cần định lượng và dịch chiết phải đủ sạch để không làm sai lệch kết quả phân tích Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp khác nhau, phương pháp ngâm lạnh với methanol được chọn để xử lý mẫu

*1* Xác định độ ẩm của bột dược liệu bằng máy đo độ ẩm

Hoa sau khi được làm Idiô tự nhiên, nghiền thành bột thô Lấy khoảng 2g bột mẫu nghiên cứu để xác định độ ẩm của dược liệu Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 110°c, rắc bột dược liệu lên đĩa cân và trải đều lên mặt đĩa, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả lên màn hình Đọc kết quả Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình

*x* Chiêt xuất

Cho dược liệu đã chia nhỏ đến kích thước thích họp (thường là bột thô) vào bình kín ngâm với methanol ở nhiệt độ phòng Sau khi ngâm 24 giờ, gạn, ép dịch chiết, lọc tạp chất Bã lại được tiến hành ngâm lần 2 với 48 giờ, lần 3 với 72 giờ và xử lý tương tự như lần 1

Dịch chiết thu được đem cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay BUCHI ROTAVAPOR R-200 để thu được cắn toàn phần Cân cắn thu được và bảo quản ở 4°c

**** Tính hiệu suất chiết

Hàm lượng % của cắn toàn phần so với khối lượng bột dược liệu được tính theo công thức sau:

M(lOO-x)Trong đó: X là hàm lượng (%), M là khối lượng dược liệu đem chiết (g), X là độ

ẩm dược liệu (%), a là khối lượng cắn toàn phần thu được (g)

❖ Pha dung dịch thử:

Lấy chính xác khoảng 0,5000 g cắn toàn phần, hòa tan hoàn toàn trong methanol định mức thành 25 mL dung dịch, lọc qua bông thủy tinh, rồi qua màng lọc 0,45 |am truớc khi tiêm mẫu vào hệ thống HPLC