Xây dựng phương pháp định lượng notoginsenisid r1 và một số ginsenisid trong thực phẩm bảo vệ sức khoẻ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

TỔNG QUAN

Tổng quan về Notoginsenosid R1 và các ginsenosid

Notoginsenosid R1 và các ginsenosid là saponin damaran được xem là thành phần hóa học chính trong các loài sâm thuộc chi Panax, họ Nhân sâm

Cho đến nay các nhà khoa học đã chiết tách và xác định được cấu trúc hơn

Trong số 100 saponin từ các loài sâm, có hơn 20 loại thuộc nhóm damaran, một nhóm saponin triterpenoid tetracyclic với cấu trúc aglycon gồm 4 vòng và 1 mạch nhánh (khung cyclopentanoperhydrophenantren) Khi tiếp xúc với acid, mạch nhánh sẽ đóng vòng, hình thành vòng tetrahydrofuran Qua các phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, các genin thực sự đã được thu nhận, trong đó hai genin chính là 20(S) protopanaxadiol và 20(S) protopanaxatriol.

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của 2 genin của saponin triterpenoid tetracyclic

Bảng 1.1 Saponin dẫn chất của 20(S) protopanaxadiol [3]

Ginsenosid Rb1 Glc - Glc Glc - Glc Panax ginseng C.A.Mey;

Ginsenosid Rb2 Glc - Glc Glc - Arap Panax ginseng C.A.Mey;

F.H.Chen Ginsenosid Rb3 Glc - Glc Glc - Xyl Panax ginseng C.A.Mey;

F.H.Chen Ginsenosid Rc Glc - Glc Glc - Araf Panax ginseng C.A.Mey;

F.H.Chen Ginsenosid Rd Glc - Glc Glc Panax ginseng C.A.Mey;

F.H.Chen; Panax vietnamensis Ha et

Notoginsenosid R4 Glc - Glc Glc - Glc -

F.H.Chen Notoginsenosid Fa Glc - Glc -

Glc - Glc Panax notoginseng (Burk)

F.H.Chen Notoginsenosid Fc Glc - Glc -

Glc - Xyl Panax notoginseng (Burk)

Chú thích: Glc: β-Dglucopyranosyl; Arap: α-L-arabinopyranosyl; Araf: α-L- arabinofuranosyl; Xyl: β-D-xylopyranosyl

Bảng 1.2 Saponin dẫn chất của 20(S) protopanaxatriol [3]

Ginsenosid Rg1 Glc Glc Panax ginseng C.A.Mey;

F.H.Chen; Panax vietnamensis Ha et Grushv

Ginsenosid Re Glc - Rha Glc Panax ginseng C.A.Mey;

F.H.Chen Ginsenosid nc Glc - Rha Glc Panax ginseng C.A.Mey

Ginsenosid nf Glc - Rha Glc Panax ginseng C.A.Mey

Ginsenosid Rh1 Glc - Rha Glc Panax ginseng C.A.Mey

Xyl Glc Panax pseudo ginseng

Notoginsenosid R1 Glc - Xyl Glc Panax notoginseng (Burk)

F.H.Chen Notoginsenosid R2 Glc - Xyl Glc Panax notoginseng (Burk)

F.H.Chen Notoginsenosid R3 Glc Glc - Glc Panax notoginseng (Burk)

Chú thích: Glc: β-Dglucopyranosyl; Arap: α-L-arabinopyranosyl; Araf: α-L- arabinofuranosyl; Xyl: β-D-xylopyranosyl; Rha: α-L-rhamnopyranosyl

Notoginsenosid R1 là thành phần chính có trong Tam thất và Sâm Việt Nam, trong khi các Ginsenosid như Rg1, Re, Rb1 cũng là hoạt chất đặc trưng của nhiều loại sâm khác nhau, bao gồm Sâm Trung Quốc, Sâm Hàn Quốc, Sâm Nhật Bản và Sâm Hoa Kỳ Theo tài liệu, Tam thất có chứa ít nhất 0,4% notoginsenosid R1 và 5,0% tổng hàm lượng ginsenosid Rg1, Rb1 cùng notoginsenosid R1 Nhân sâm cung cấp ít nhất 0,3% tổng hàm lượng ginsenosid Rg1 và Re, cùng với 0,2% ginsenosid Rb1, trong khi Sâm Việt Nam chứa tối thiểu 0,5% ginsenosid Rb1, 0,5% ginsenosid Rd và 1,5% ginsenosid Rg1.

1.1.2 Đặc điểm tính chất và tác dụng

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Notoginsenosid R1 [17]

- Khối lượng phân tử: 933,1273 g/mol

(2S,3R,4S,5S,6R)-2-[(2S)-2 [(3S,5R,6S,8R,9R,10R,12R,13R,14R,17S)-6- [(2R,3R,4S,5S,6R)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-[(2S,3R,4S,5R)- 3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,12-dihydroxy-4,4,8,10,14- pentamethyl-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahydro-1H- cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-6-methylhept-5-en-2-yl]oxy-6

+ Bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà

+ Tan tốt trong nước và các dung môi phân cực như butanol, ethanol và methanol, tan trong dimethyl sulfoxide

+ Độ tan trong nước là 1 mg/ml

+ Hấp thụ UV ở bước sóng thấp 208 nm

+ Nhiệt độ nóng chảy khoảng 215-217 o C

+ [α]D 25 = +15,0 o (Dung dịch 1,0 mg/ml trong methanol)

Notoginsenosid R1 có nhiều tác dụng dược lý quý, bao gồm việc thúc đẩy hoạt động của alkaline phosphatase (ALP) trong tiền nguyên bào xương, đồng thời tăng cường biểu hiện của osteocalcin và chất khoáng Những tác động này hỗ trợ hiệu quả cho quá trình tái tạo và khoáng hóa xương.

Tác động lên các thụ thể estrogen kích thích hoạt động sao chép của yếu tố đáp ứng estrogen phosphorylated-luciferase, dẫn đến sự phosphoryl hóa trong tế bào gốc xương người (hBMSC) Điều này ảnh hưởng đến quá trình phân hóa và khoáng hóa của osteoblast, góp phần quan trọng trong sự phát triển của xương.

Inhibition of low-density lipoprotein oxidation produces pro-inflammatory cytokines in human endothelial cells EAhy926, leading to a significant reduction in tumor necrosis factor (TNF-α) and interleukin (IL) production, which notably decreases tumor incidence.

Giảm thiểu sự tổn hại do amyloid-β gây ra trong tế bào thần kinh thông qua việc ức chế các dạng oxy phản ứng và điều chỉnh hoạt động của protein kinase MAPK có tác dụng tích cực trong việc điều trị bệnh Alzheimer và các rối loạn thần kinh khác Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy ảnh hưởng đến sự tổng hợp các thành phần của hệ thống tiêu sợi huyết trong nuôi cấy tế bào động mạch phổi và tế bào vi mạch nội mô da người, với việc tăng cường tổng hợp plasminogen kích thích (t-PA) và giảm plasminogen ức chế (PAI-1) trong tĩnh mạch rốn nội mô người.

[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhept- 5-en-2-yl]-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahydro-1H- cyclopenta[a]phenanthren-6-yl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Ginsenosid Rg1 [17]

+ Bột kết tinh màu trắng

+ Tan trong nước, trong etanol khan và trong metanol

+ Độ tan trong nước là 1 mg/ml

+ Nhiệt độ nóng chảy khoảng 188-191 o C

+ Ginsenosid Rg1 có tác dụng chống oxy hóa và chống lão hóa, thúc đẩy quá trình chữa lành vết thương và tác dụng bảo vệ thần kinh [3,7,27,29]

Ginsenosid Rg1 có khả năng chống tạo huyết khối và ngăn ngừa sự ngưng tập tiểu cầu bằng cách ức chế hình thành thromboxan trong tiểu cầu Đồng thời, nó kích thích enzym phân hủy sợi huyết, giúp ức chế sự hình thành sợi huyết và làm giãn mạch.

+ Bảo vệ tế bào gan, chống ung thư, điều hòa miễn dịch [3,19,24,25,26,27]

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Ginsenosid Re [17]

4,4,8,10,14-pentametyl-17 - [(2 S ) -6 -metyl-2 - [(2 S , 3 R , 4 S , 5 S , 6 R) -3,4,5-trihydroxy-6- (hydroxymetyl) oxan-2-yl] oxyhept-5-en-2-yl]

10 phenanthren-6-yl] oxy] -4,5-dihydroxy-6- (hydroxymetyl) oxan-3-yl] oxy- 6-metyloxane-3,4 , 5-triol

+ Tan trong nước, trong etanol 96% và trong metanol

+ Ginsenosid Re có tác dụng làm giãn mạch, ngăn ngừa co thắt động mạch, chống thiếu máu cục bộ, chống loạn nhịp [3,16,23]

Ginsenosid Re có khả năng cải thiện tình trạng viêm bằng cách ức chế sự liên kết của lipopolysaccharide với TLR4 trên đại thực bào Ngoài ra, hợp chất này còn có tác dụng chống oxy hóa và giảm β-amyloid, góp phần hiệu quả trong điều trị bệnh Alzheimer.

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của Ginsenosid Rb1 [17]

6 R ) -3,4,5-trihydroxy-6- (hydroxymetyl) oxan-2-yl] oxyoxan-2-yl] oxy- 12-hydroxy-4,4,8,10, 14-pentametyl-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17- dodecahydro-1 H -cyclopenta [a] phenanthren-17-yl] -6-metylhept-5- vi-2- yl] oxy-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl] metoxy] -6- (hydroxymetyl) oxan-3,4,5- triol

+ Tan trong nước, trong etanol khan và trong metanol

+ Nhiệt độ nóng chảy khoảng 199 o C

+ Ginsenosid Rb1 có tác dụng ức chế thần kinh trung ương làm giảm lo âu và chống trầm cảm [2,3,16,25]

+ Bảo vệ tế bào gan, ức chế sự phosphoryl hóa protein gây bởi CCL4 theo cơ chế điều hòa protein kinase phụ thuộc Ca 2 + /calmodulin [3]

The article discusses the anti-cancer properties of inhibiting angiogenesis and the role of Pigment Epithelium-Derived Factor (PEDF) through estrogen receptor beta It highlights the suppression of TNF-α release and the protective effects against oxidative stress.

Một số chế phẩm chứa notoginsenosid R1 và các ginsenosid lưu hành trên thị trường:

TPBVSK chứa Tam thất bao gồm bột Tam thất, cao lỏng Tam thất, và các dạng bào chế như viên nang cứng, viên nang mềm, cùng với bột chứa Tam thất và nhiều dược liệu khác như Đan sâm, Nghệ, Long não, Hoa hòe, Cao lá Bạch quả, Xạ đen, và Trinh nữ hoàng cung.

TPBVSK chứa Nhân sâm được bào chế dưới nhiều dạng như nước uống, cao lỏng, chè, viên nang cứng, nang mềm và viên sủi, kết hợp với nhiều dược liệu khác cùng các loại multivitamin và khoáng chất.

- TPBVSK chứa Sâm Việt Nam: Nước uống, cao, các dạng bào chế viên nang cứng, nang mềm chứa Sâm Ngọc linh cùng các loại thảo dược khác

- TPBVSK chứa Sâm và Tam thất: Viên ngậm Nhân sâm Tam thất, Viên Tam thất Hồng sâm.

Các nghiên cứu định lượng notoginsenosid R1 và các ginsenosid 12 1 Định lượng notoginsenosid R1 và các ginsenosid trong một số chuyên luận Dược điển

Bảng 1.3 Định lượng notoginsenosid R1 và các ginsenosid trong một số chuyên luận Dược điển

Tài liệu Đối tượng Điều kiện sắc ký Yêu cầu

Cột: C18, 5àm (25 cm ì 4,6 mm) Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 203 nm

Tốc độ dòng: 1 ml/min

Pha động: Aetonitril (ACN) - Nước (H 2 O) theo chương trình:

70 -100 29 → 40 71 → 60 Nồng độ định lượng: Ginsenosid Rg1,

Tổng Rg1 và Re ≥ 0,3%; Rb1 ≥ 0,2%

Re, và Rb1 nồng độ mỗi chất 0,2 mg/ml

Tốc độ dòng: 1,6 ml/min

Pha động: ACN - H 2 O theo chương trình:

Nồng độ định lượng: Ginsenosid Rg1, và Rb1 nồng độ mỗi chất 0,4 mg/ml, Notoinsenosid R1 nồng độ 0,1 mg/ml

Rb1, Rd, Rg1 và mạjonosid R2)

Tốc độ dòng: 1 ml/min

Nồng độ định lượng: ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd, ginsenosid Rg1 và

14 mạjonosid R2 nồng độ mỗi chất lần lượt 0,1 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0,5 mg/ml

Cột: C18, không nêu thông số cột Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 203 nm

Tốc độ dòng: Không nêu Thể tớch tiờm: 10 àl

70 - 100 29 → 40 71 → 60 Nồng độ định lượng: Ginsenosid Rg1,

Re và Rb1 nồng độ mỗi chất 0,2 mg/ml

Tổng Rg1 và Re ≥ 0,3%; Rb1 ≥ 0,2%

70 - 100 29 → 40 71 → 60 Nồng độ định lượng: Nồng độ định lượng: Ginsenosid Rg1, Rb1 nồng độ 0,5 mg/ml và Ginsenosid Re 0,3 mg/ml

12 - 60 19 → 36 81 → 64 Nồng độ định lượng: Ginsenosid Rg1, và Rb1 nồng độ mỗi chất 0,4 mg/ml, Notoinsenosid R1 nồng độ 0,1 mg/ml

Tốc độ dòng: 1,6 ml/phút Thể tớch tiờm: 10 àl

40 - 60 31 → 40 69 → 60 Nồng độ định lượng: Dãy chuẩn chứa mỗi chất Ginsenosid Rg1, Re và Rb1 chứa mỗi chất ở các mức nồng độ 25,

Tổng Rg1 và Re ≥ 0,19%; Rb1 ≥ 0,20%

Pha động: ACN - H 2 O theo chương

Tổng Rg1 và Re ≥ 0,25%; Rb1 ≥ 0,20%

70 - 100 29 → 40 71 → 60 Nồng độ định lượng: Dãy chuẩn chứa mỗi chất Ginsenosid Rg1, Re và Rb1 ở các mức nồng độ 25, 50, 100, 200,

20 - 60 20 → 42 80 → 58 Nồng độ định lượng: Dãy chuẩn chứa mỗi chất Ginsenosid Rg1, Rb1 ở các mức nồng độ 20, 50, 100, 200, 500 àg/ml và R1 ở cỏc mức nồng độ 10,

Dược liệu Nhân sâm (Ginsenosid

Cột: C18, 5àm (12,5 cm ì 4,6 mm) Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 203 nm

Pha động: ACN và H 2 O (nước được điều chỉnh đến pH 2,0 bằng acid phosphoric):

Nồng độ định lượng: Nồng độ định lượng: Ginsenosid Rg1, và Rb1 nồng độ mỗi chất 0,3 mg/ml

Dược liệu Tam thất (Ginsenosid

Cột: Aminopropylsilyl silica gel, 3àm (10 cm ì 4,6 mm)

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 203 nm

Dược liệu Nhân sâm, bột dược liệu Nhân sâm

Bột cao dược liệu Nhân sâm

Nồng độ định lượng: Nồng độ định lượng: 24 mg/ml cao chuẩn Nhân sâm

Rg1+Rb1+Re+Rc+ Rd+ Rb2 ≥ 3,0%

1.2.2 Các nghiên cứu khác Đào Văn Đôn và cộng sự (2014) đã nghiên cứu định lượng đồng thời ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd trong viên nang cứng Ukata (Thành phần chứa cao khô bèo hoa dâu 60 mg; cao khô nghệ 100 mg; cao khô tam thất 80 mg) bằng phương pháp HPLC-UV Phương pháp sử dụng pha động gồm acetonitril - nước, cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, 5 mm), detector UV tại 203 nm và tốc độ dòng 1,5 ml/phút Các ginsenosid được tách hoàn toàn trong thời gian

50 phút Giới hạn định lượng của ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd nằm trong khoảng 6,0 - 8,0 àg/ml [5]

Nguyễn Thị Hạnh (2016) đã phát triển phương pháp định lượng ginsenosid Rg1 và ginsenosid Rb1 trong các mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) dạng viên nang cứng, viên nang mềm và cao lỏng chứa Nhân sâm thông qua kỹ thuật HPLC-DAD và HPTLC Phương pháp này sử dụng ether để loại bỏ dầu và chiết mẫu bằng methanol 70% Độ giới hạn phát hiện (LOQ) của phương pháp HPLC là 3ppm, tương ứng với LOQ trong nền mẫu rắn là 30 µg/g và trong nền mẫu lỏng là 7,5 µg/100mL, với độ thu hồi đạt từ 95,73% đến 101,4%.

Nguyễn Quang Tuyển (2017) đã thực hiện việc định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1 và ginsenosid Rb1 trong dược liệu Tam thất bằng phương pháp HPLC-UV Phương pháp này sử dụng cột Phenomenex C18 (5 m, 250 mm x 4,6 mm) và rửa giải bằng gradient nước - acetonitril trong 70 phút, với bước sóng phát hiện 203 nm và tốc độ dòng 1,5 ml/phút Kết quả cho thấy hàm lượng notoginsenosid R1 đạt 1,14%, ginsenosid Rg1 là 4,47%, ginsenosid Rb1 là 4,23%, và tổng hàm lượng saponin là 10,12%.

Nguyễn Minh Đức và cộng sự (2018) đã xác định đồng thời các ginsenosid Rb1, Rd, Rg1 và majonosid-R2 trong thân rễ và rễ cây Sâm Việt Nam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò phun sương tích điện Phân tích được thực hiện trên cột pha đảo C18 với hệ dung môi ACN - H2O theo chương trình gradient Kết quả cho thấy khoảng tuyến tính của ginsenosid Rb1 từ 0,008 - 0,264 mg/ml, ginsenosid Rd từ 0,008 - 0,251 mg/ml, ginsenosid Rg1 từ 0,016 - 0,501 mg/ml và majonosid R2 từ 0,020 - 0,637 mg/ml, với các hệ số tương quan trên 0,998 Phương pháp có độ lặp lại (RSD) ≤ 2,85% và độ đúng trong khoảng 95-105%.

Quách Thanh Tâm và cộng sự (2019) đã xây dựng quy trình định lượng các ginsenoside Rb1, Rg1, Rf, Re trong thực phẩm bổ sung chứa Nhân sâm bằng

20 phương phỏp LC-MS/MS với giới hạn phỏt hiện là 0,5 àg/mL, giới hạn định lượng là 2,0 àg/mL, độ chụm RSD < 20%, hiệu suất thu hồi trong khoảng 80 - 110% [8].

Nghiên cứu của Weichen và cộng sự (2010) đã áp dụng phương pháp LC-MS/MS kết hợp chiết pha rắn để xác định đồng thời ba chất notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1 và ginsenosid Rb1 có trong huyết tương của Tam thất Phương pháp này đạt được giới hạn định lượng lần lượt là 0,5 ng/mL cho notoginsenosid R1, 0,82 ng/mL cho ginsenosid Rg1, và 1,10 ng/mL cho ginsenosid Rb1.

Nghiên cứu của Zenzhong Yang và cộng sự (2014) đã xác định dấu vân tay sắc ký của năm chất ginsenosid (Rg1, Re, notoginsenosid R1, Rb1, Rd) trong dược liệu Tam thất bằng phương pháp HPLC với detector DAD, sử dụng cột Agilent Zorbax C18 (4,6 mm × 50 mm, 1,8 m) Phương pháp phân tách được thực hiện với tốc độ dòng dung môi 0,8 mL/phút ở nhiệt độ 35°C, sử dụng nước và acetonitril làm pha A và B Chương trình dung môi được thiết lập theo các khoảng thời gian cụ thể, với bước sóng phát hiện là 203nm và thể tích tiêm là 3μL Kết quả cho thấy khoảng tuyến tính của mỗi chất từ 0,05-4,0 mg/ml với hệ số tương quan đạt 0,999, độ thu hồi từ 95,75-104,85% và độ chính xác có RSD từ 1,49-1,72%.

Zhijiang Wu và cộng sự (2017) đã xác định đồng thời ginsenosid Rg1,

Nghiên cứu về Re, Rb1 và notoginsenosid R1 trong mỹ phẩm như dầu gội, dầu dưỡng tóc và kem dưỡng da đã được thực hiện bằng phương pháp UHPLC-MS/MS kết hợp chiết pha rắn Bốn chất phân tích được tách trên cột Waters HPLC ACQUITY UPLC HSS T3 C18 (2.1 mm x 100 mm, 1.8 µm) thông qua chương trình rửa giải gradient acetonitril - nước Đường chuẩn tuyến tính cho notoginsenosid R1 nằm trong khoảng 0,05-5 mg/L, trong khi các ginsenosid Rg1, Re và Rb1 có khoảng 0,1-10 mg/L, với hệ số tương quan đều lớn hơn 0,996 Phương pháp này cho thấy độ nhạy cao và khả năng phát hiện tốt.

21 phát hiện và giới hạn định lượng tương ứng nằm trong khoảng 0,3-1,0 mg/kg và 1,0-3,5 mg/kg Độ thu hồi của bốn chất phân tích nằm trong khoảng 80,9%

Tỉ lệ phát hiện đạt 93,0% với độ lệch chuẩn tương đối (RSDs, n = 6) là 1,9% - 8,2% Hiện tại, trong các Dược điển chỉ có quy định cho các dược liệu mà chưa có hướng dẫn cụ thể cho sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) Các nghiên cứu trong và ngoài nước chủ yếu tập trung vào dược liệu, trong khi các sản phẩm TPBVSK chỉ được nghiên cứu với Nhân sâm, sử dụng nhiều phương pháp như HPLC-UV, HPLC-DAD, HPLC-CAD, HPLC-ELSD, LC-MS/MS, và UPLC-MS/MS, trong đó HPLC-UV là phổ biến nhất Phương pháp HPLC-UV cho phép tách, định tính và định lượng các thành phần với độ chính xác cao Tam thất và Nhân sâm hiện nay không chỉ được sử dụng riêng lẻ mà còn được bào chế thành TPBVSK kết hợp với nhiều thành phần khác Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào phân tích đồng thời 4 chất notoginsengosid R1, Ginsenosid Rg1, Rb1, Re trong mẫu TPBVSK Do đó, việc xây dựng một phương pháp khả thi, chọn lọc và chính xác để tiêu chuẩn hóa các sản phẩm TPBVSK chứa Tam thất và Nhân sâm là rất cần thiết.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

SKS: 19120521; Hàm lượng: 97,9% (Nguyên trạng); Nguồn gốc: Shanghai Tauto Biotech Co., Ltd - Trung Quốc

SKS: 0117C002.01; Hàm lượng: 94,05% (Nguyên trạng); Nguồn gốc: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

SKS: 0117C001.01; Hàm lượng: 88,59% (Nguyên trạng); Nguồn gốc: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

SKS: 19010322; Hàm lượng: 98,8% (Nguyên trạng); Nguồn gốc: Shanghai Tauto Biotech Co., Ltd - Trung Quốc

- Acetonitril dùng cho HPLC; Nguồn gốc: Merck KgaA - Đức

- Acid phosphoric dùng cho HPLC; Nguồn gốc: Merck KgaA - Đức

- Methanol dùng cho HPLC; Nguồn gốc: Merck KgaA - Đức

- Nước khử ion dùng cho HPLC

- Methanol đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích; Nguồn gốc: Công ty hóa chất Đức Giang

Tất cả các thiết bị phân tích đều được chuẩn hóa theo qui định của ISO/IEC 17025-2017 và GLP, bao gồm:

- Thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu - LC - 2030C 3D Plus (Nhật Bản) với detector PDA

- Bộ chiết pha rắn SPE Vacuum SPE Manifolds (Supelco - Mỹ)

- Cột sắc ký: Cột InertSustain C18 (250 x 4,6 mm; 5 àm) (GL Sciences - Nhật Bản)

- Cột chiết pha rắn: C18 (SilactSPE TM - Affinisep - Pháp) (6 ml - 500 mg)

- Cân phân tích A&D Company Limited - GH-202, độ chính xác d = 0,01 mg (Nhật Bản)

- Máy lắc siêu âm Hwashin Techonology Co - Power Sonic 505 (Hàn Quốc)

- Micropipet Eppendorf loại 10-100àl, 100-1000àl, 500-5000àl (Đức)

- Bình định mức, pipet thủy tinh class A, Prolabo - Pháp

2.1.2.1 Trong t hẩm định phương pháp phân tích:

The solid form of this dietary supplement is a hard capsule containing 100 mg of Tam That, along with extracts of Ginkgo Biloba and Bilberry, magnesium, citicoline, vitamin B1, and vitamin B6 Additional ingredients include magnesium stearate, methyl paraben, propyl paraben, polyvinylpyrrolidone (PVP), and talc, ensuring the formulation is complete for each capsule.

+ Mẫu dạng lỏng: TPBVSK Cao lỏng thành phần chứa: Tam thất 2 g/90 ml, Táo đỏ Hàn Quốc, Nước tinh khiết

TPBVSK Viên nang mềm là sản phẩm bổ sung dinh dưỡng chứa các thành phần quan trọng như Tam thất 125 mg, Ginkgo biloba, rutin, gelatin, sáp ong trắng, sorbitol, dầu đậu nành, dầu cọ, lecithin và glycerin, được đóng gói vừa đủ trong một viên.

Mẫu nền được thiết kế với ba loại tự tạo theo công thức mẫu thử nghiên cứu, bao gồm dạng rắn, dạng lỏng và dạng dầu Tuy nhiên, những mẫu này không chứa chất phân tích và dược liệu có chứa chất phân tích.

- Mẫu tự tạo: Thêm chuẩn vào các mẫu nền ở nồng độ phù hợp theo yêu cầu nghiên cứu

2.1.2.2 Trong nghiên cứu trên mẫu thực :

Các mẫu TPBVSK chứa Nhân sâm, Tam thất được thu thập trên thị trường bao gồm:

- 10 Mẫu TPBVSK chứa Tam thất: Được ký hiệu từ M1 đến M10

- 10 Mẫu TPBVSK chứa Nhân sâm: Được ký hiệu từ M11 đến M20

Dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc 1000 àg/ml được tạo ra bằng cách hòa tan khoảng 20 mg mỗi chất chuẩn notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re và ginsenosid Rb1 vào bình định mức 20 ml Sau đó, thêm methanol, lắc siêu âm cho đến khi tan hoàn toàn, và điều chỉnh bằng cách thêm methanol đến vạch định mức, lắc đều Bảo quản dung dịch trong điều kiện thích hợp.

- Các dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc 1000 àg/ml, được sử dụng trong ngày.

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng quy trình phân tích

2.2.1.1 Kh ảo s át điều kiện sắc k ý:

Tham khảo tài liệu [1,17,31,35] và điều kiện thực tế tại phòng thí nghiệm, khảo sát sơ bộ với các điều kiện sắc ký trong quy trình như sau:

Để đạt được kết quả tách biệt rõ ràng và cân xứng cho các chất phân tích, cần tiến hành thử nghiệm với cột sắc ký pha đảo từ các hãng khác nhau Đặc biệt, độ phân giải của pic Rg1 và Re phải lớn hơn 1,5 để đảm bảo hiệu quả của quá trình phân tích.

Tiến hành khảo sát chương trình rửa giải gradient với pha động là acetonitril kết hợp với H2O theo các tỉ lệ khác nhau Qua việc phân tích và đánh giá các thông số pic sắc ký, chúng tôi sẽ lựa chọn pha động phù hợp nhất cho quá trình này.

25 dựa trên khả năng tách các chất phân tích với các chất cản trở trong nền mẫu

Khảo sát tốc độ dòng với ba mức độ khác nhau giúp lựa chọn tốc độ tối ưu cho việc tách các chất phân tích Điều này đảm bảo áp suất không vượt quá mức cho phép và thời gian phân tích được rút ngắn, nâng cao hiệu quả của quá trình phân tích.

- Thể tích tiêm: Tiến hành sắc ký các thể tích tiêm khác nhau trong khoảng

10 - 50 àl Lựa chọn thể tớch tiờm cho cỏc pic cú đỏp ứng khụng quỏ nhỏ, độ phân giải Rg1 và Re đạt yêu cầu

- Detector DAD: Quét phổ các chất phân tích ở bước sóng từ 190-300 nm, lựa chọn bước sóng phát hiện cho đáp ứng cao

2.2.1.2 Kh ảo s át q uy trình xử lý mẫu :

Các sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) chứa Nhân sâm và Tam thất thường được kết hợp với nhiều dược liệu khác, cũng như vitamin và khoáng chất, dưới nhiều dạng bào chế khác nhau Điều này tạo ra một nền mẫu phức tạp cho nghiên cứu, trong khi bước sóng phát hiện các chất phân tích lại ở mức thấp.

Để tối ưu hóa quá trình định lượng chất phân tích, chúng tôi đã tham khảo nhiều tài liệu trong nước và quốc tế và khảo sát điều kiện chiết mẫu bằng hai phương pháp: methanol 70% và methanol 90% kết hợp với làm sạch bằng SPE Việc lựa chọn điều kiện chiết mẫu dựa trên hiệu suất cao và khả năng loại bỏ cản trở từ nền mẫu Sau khi xác định phương pháp phù hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình, bao gồm nhiệt độ chiết, bước làm sạch và rửa giải.

2.2.2 Thẩm định quy trình phân tích :

According to the AOAC guidelines (Appendix K, 2013) for dietary supplements and botanicals, testing must be conducted on at least three sample forms: hard capsules, soft capsules, and liquid forms, with specified criteria to be met.

- Tiến hành sắc ký và so sánh sắc ký đồ của 03 mẫu: Mẫu chuẩn hỗn hợp chứa 100 àg/ml mỗi chất notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, Ginsenosid

Re, ginsenosid Rb1; mẫu nền và mẫu tự tạo dạng rắn, lỏng, dầu được chuẩn bị theo quy trình phân tích

Sắc ký đồ mẫu nền không cho thấy các pic tại thời gian lưu tương ứng với notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re và ginsenosid Rb1 trong mẫu chuẩn Nếu có sự xuất hiện của pic, đáp ứng pic phải nhỏ hơn hoặc bằng 1,0% so với đáp ứng pic của mẫu chuẩn ở nồng độ trung bình.

Sắc ký đồ của dung dịch mẫu tự tạo cho pic có thời gian lưu tương ứng với pic chính trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn notoginsenosid R1, Ginsenosid Rg1, Ginsenosid Re, và Ginsenosid Rb1 Các pic notoginsenosid R1, Ginsenosid Rg1, Ginsenosid Re, Ginsenosid Rb1 trên sắc ký đồ của dung dịch thử cần phải tách hoàn toàn với các pic tạp để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích.

2.2.2.2 Độ thích hợp của hệ thống :

- Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp Notoginsenosid R1, Ginsenosid Rg1, Re, Rb1 mỗi chất cú nồng độ khoảng 100 àg/ml

- Ghi lại các sắc ký đồ và xác định thời gian lưu, diện tích pic của Notoginsenosid R1, Ginsenosid Rg1, Ginsenosid Re, Ginsenosid Rb1

Để đảm bảo chất lượng phân tích, yêu cầu độ phân giải của pic Ginsenosid Rg1 và Ginsenosid Re phải lớn hơn 1,5 Ngoài ra, độ lệch chuẩn tương đối RSD diện tích pic cần phải ≤ 2,0%, và RSD thời gian lưu cũng phải ≤ 2,0% cho từng chất phân tích.

2.2.2.3 K hoảng tuyến tính và đường chuẩn :

Khoảng tuyến tính được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng, tức là điểm nồng độ thấp nhất, và kết thúc ở nồng độ cao nhất vẫn đảm bảo tính tuyến tính Chúng tôi tiến hành thử nghiệm với 07 mức nồng độ của dung dịch chuẩn cho mỗi chất, nhằm xác định đường biểu diễn tương quan giữa nồng độ và diện tích pic.

- Đường chuẩn được xây dựng từ khoảng tuyến tính để đảm bảo khoảng nồng độ bao trùm vùng nồng độ trong mẫu thực tế

+ Hệ số tương quan tuyến tính (r): r ≥ 0,995 hay R 2 ≥ 0,99

+ Độ chệch của các điểm cho tất cả các nồng độ không quá ± 15%, không được quá ± 20% ở nồng độ LOQ [12]

2.2.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):

Để ước lượng LOD của phương pháp, cần dựa vào độ lệch chuẩn trên nền mẫu thử Thêm chuẩn vào mẫu nền của từng dạng bào chế với nồng độ mỗi chất khoảng 5-7 lần LOD ước lượng Sau đó, phân tích mẫu thử với 6 lần lặp lại để tính giá trị trung bình x và độ lệch chuẩn SD.

+ Nếu 4 ≤ R ≤ 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy

+ Nếu R < 4 thì phải tiến hành lại với dung dịch thử đặc hơn

+ Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn hoặc pha loãng dung dịch thử đã dùng và tiến hành làm lại thử nghiệm [12]

Tiến hành tạo 09 mẫu tự tạo trong khoảng tuyến tính đã xây dựng, với 03 mức nồng độ thấp, trung bình và cao (mỗi mức nồng độ có 03 mẫu, tổng n = 9) Mục tiêu là xác định độ thu hồi của các chất phân tích, đảm bảo độ thu hồi đạt yêu cầu theo quy định của AOAC (Bảng 2.1).

Bảng 2.1 Độ thu hồi chấp nhận, độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSD r ), độ lệch chuẩn tương đối tái lặp (RSD R ) ở các nồng độ khác nhau

Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%)

2.2.2.6 Độ chính xác của phương pháp:

Để xác định độ lặp lại, mẫu thử đã được đồng nhất sẽ được phân tích 06 lần theo quy trình đã thiết lập, từ đó tính toán RSD.

Yêu cầu: Giá trị RSD tính được phải đạt yêu cầu theo bảng 2.1

Để xác định độ chính xác trung gian, chúng tôi đã thực hiện phân tích 06 lần lặp lại của cùng một mẫu thử ở các thời điểm khác nhau và trên các thiết bị HPLC khác nhau Kết quả phân tích được đánh giá bằng cách xác định RSD của các lần thử nghiệm (n = 12).

Yêu cầu: Giá trị RSD tính được phải đạt yêu cầu theo bảng 2.1

2.2.3 Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa notoginsenosid R1 và các ginsenosid

- Ứng dụng phương pháp nghiên cứu định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, Re, Rb1 trong một số chế phẩm chứa Tam thất, Nhân sâm thu thập trên thị trường: 20 mẫu

- Mỗi mẫu thực hiện 03 lần lặp lại, tính giá trị trung bình

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2017 để xử lý số liệu và trình bày kết quả

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, Rb1, Re trong TPBVSK bằng HPLC

3.1.1 Xây dựng quy trình phân tích

3.1.1.1 Kh ảo s át điều kiện sắc ký :

Cột sắc ký được khảo sát theo điều kiện sắc ký của dược điển Hồng Kông chuyên luận về Tam thất Nghiên cứu này sử dụng dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm Notoginsenosid R1, Ginsenosid Rg1, Ginsenosid Re và Ginsenosid Rb1, với nồng độ mỗi chất khoảng xác định.

Kết quả thực nghiệm cho thấy khi phân tích dung dịch chuẩn hỗn hợp trên các cột C18 Shimadzu, C18 InertSustain và C18 Eclipse Plus, các pic R1, Rg1, Re, Rb1 tách ra khỏi nhau Trong đó, cột C18 InertSustain cho kết quả tách biệt rõ ràng nhất, với độ phân giải giữa pic Rg1 và Re đạt 1,6, lớn hơn yêu cầu tối thiểu là 1 Do đó, cột C18 InertSustain được lựa chọn để phân tích đồng thời các chất phân tích.

Khảo sát khả năng tách các chất phân tích khỏi các chất cản trở trong nền mẫu được thực hiện bằng dung dịch chuẩn hỗn hợp và dung dịch mẫu trắng, với các chất ở nồng độ 50 àg/ml Hệ pha động sử dụng là ACN - H2O, và các chương trình tách được áp dụng để tối ưu hóa quy trình phân tích.

Bảng 3.1 Chương trình dung môi

Kết quả được thể hiện ở hình 3.1, 3.2, 3.3

Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn (phía trên), dung dịch thử dạng dầu

(phía dưới) theo chương trình pha động 1

Kết quả khảo sát cho thấy, cả ba chương trình pha động các chất R1, Rg1,

Trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn, Rb1 và Rb1 tách biệt rõ ràng Tuy nhiên, trong mẫu dầu ở chương trình 1, pic Rb1 không tách được với pic tạp, dẫn đến yêu cầu phân tích lớn hơn khoảng 1,5 lần so với dung dịch chuẩn trong chương trình pha động.

Chương trình pha động 2 pic Rb1 cho phép tách hoàn toàn với tạp chất, đạt độ thu hồi 99,3% Để tiết kiệm thời gian phân tích và đảm bảo các chất phân tích được tách rõ ràng khỏi nền mẫu, hệ dung môi ACN - Nước theo chương trình pha động 2 đã được lựa chọn để tiến hành phân tích các chất trong đề tài.

Kết quả khảo sát về tốc độ dòng cho thấy rằng ở mức 1,6 ml/phút, các pic R1, Rg1, Re, Rb1 được tách biệt tốt nhất, đạt yêu cầu về hệ số kéo đuôi và độ phân giải giữa Rg1 và Re.

Trong quá trình sắc ký các thể tích tiêm 10 µl, 20 µl và 50 µl, kết quả cho thấy khi tiêm 20 µl, các pic tách nhau rõ ràng với diện tích pic đạt yêu cầu (lớn hơn 300000) Độ phân giải Rg1 và Re cũng được xác nhận là đạt tiêu chuẩn.

Để lựa chọn bước sóng phát hiện cho detector DAD, quét phổ các chất phân tích trong khoảng 190 - 300 nm cho thấy bước sóng 203 nm mang lại tín hiệu cao nhất cho các chất R1, Rg1, Re và Rb1 Vì vậy, bước sóng 203 nm được lựa chọn để phát hiện các chất phân tích.

Kết quả thực nghiệm đã xác định các điều kiện sắc ký tối ưu cho việc phân tích định tính và định lượng các hợp chất R1, Re, Rg1, Rb1 trên hệ thống HPLC.

➢ Pha động: ACN - Nước gradient theo chương trình:

Thời gian (phút) Acetonitril (% tt/tt) H2O (% tt/tt)

➢ Cột sắc ký: InertSustain C18 (kớch thước 250 x 4,6 mm; 5àm)

➢ Tốc độ dòng: 1,6 ml/phút

➢ Detector: DAD ở bước sóng 203 nm

3.1.1.2 Kh ảo s át q uy trình xử lý mẫu : a Chuẩn bị mẫu:

- Mẫu dạng rắn: Đồng nhất mẫu thử của 20 đơn vị, nghiền thành bột mịn, trộn đều

- Mẫu dạng lỏng: Trộn đều dung dịch trong 05 đơn vị

- Mẫu dạng dầu: Đồng nhất dịch chứa trong nang của 20 viên, trộn đều

- Mẫu được trộn theo công thức mẫu thực của từng dạng bào chế nhưng không chứa Tam thất, Nhân sâm

- Công thức chế tạo mẫu nền như sau:

The solid base formula includes 300 mg of Ginkgo biloba extract, 50 mg of blueberry extract, 50 mg of magnesium, 30 mg of citicoline, 1 mg of vitamin B1, 1 mg of vitamin B6, 2.5 mg of magnesium stearate, 1 mg of methyl paraben, 0.2 mg of propyl paraben, 15 mg of polyvinylpyrrolidone (PVP), and 5 mg of talc, sufficient for one tablet.

+ Mẫu nền dạng lỏng: Dịch chiết 5 g Táo đỏ Hàn Quốc, nước tinh khiết vừa đủ 90 ml

Mẫu nền dạng dầu bao gồm các thành phần chính như 250 mg Ginkgo biloba, 25 mg rutin (20 % rutin), 150 mg gelatin, 10 mg sáp ong trắng, 65 mg sorbitol, 150 mg dầu đậu nành, 135 mg dầu cọ, 40 mg lecithin và 75 mg glycerin cho mỗi viên Quy trình xử lý mẫu cũng được khảo sát để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của sản phẩm.

❖ Khảo s át điều kiện chiết mẫu:

Tiến hành khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu Hai quy trình khảo sát trong nghiên cứu gồm:

Đối với mẫu dạng rắn và dạng dầu, cần cân chính xác khoảng 2,0 g mẫu thử vào ống ly tâm 50 ml Tiếp theo, thêm khoảng 30 ml methanol 90% và lắc xoáy cho đến khi mẫu phân tán đồng nhất Sau đó, rung siêu âm ở nhiệt độ 50 o C - 60 o C trong 30 phút để hoàn tất quá trình.

Ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút và gạn dịch vào cốc mỏ 100 ml Thêm khoảng 15 ml methanol 90% vào phần cặn để chiết lần 2 Tập trung dịch chiết vào cốc mỏ 100 ml và cô dịch chiết trên cách thủy ở 60-70 độ C đến cạn Hòa cặn với 5 ml nước và tiến hành chiết qua cột SPE Hoạt hóa cột SPE bằng 3 ml methanol và cân bằng cột bằng 3 ml nước Chuyển dịch chiết lên cột SPE, rửa tạp bằng 5 ml nước, sau đó rửa bằng 5 ml hỗn hợp methanol-nước (3:7) với tốc độ rửa 2 ml/phút Tiến hành rửa giải bằng 8 ml methanol với tốc độ 1 ml/phút, hứng dịch rửa giải vào bình định mức 10 ml Thêm methanol vừa đủ đến vạch và lắc đều, sau đó lọc qua màng lọc 0,45 µm.

+ Đối với mẫu dạng lỏng: Hút chính xác 5,0 ml dịch chế phẩm Tiến hành chiết qua cột SPE tương tự như trên

Để chuẩn bị mẫu dạng rắn hoặc dạng dầu, cân chính xác khoảng 2,0 g mẫu thử vào ống ly tâm 50 ml Tiếp theo, thêm khoảng 30 ml methanol 70% và lắc xoáy cho đến khi mẫu phân tán đồng nhất Cuối cùng, rung siêu âm ở nhiệt độ 50 o C - 60 o C trong 30 phút để đạt được kết quả tối ưu.

Ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút và gạn dịch vào bình định mức 50 ml Thêm khoảng 15 ml methanol 70% vào phần cặn, sau đó rung siêu âm ở nhiệt độ 50 o C - 60 o C trong 30 phút Tiếp tục ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút, gạn dịch vào bình định mức chứa dịch chiết lần 1 Cuối cùng, bổ sung methanol 70% vừa đủ đến vạch và lắc đều trước khi lọc qua màng lọc 0,45 µm.

BÀN LUẬN

Về đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, và ginsenosid Rb1, những thành phần chủ yếu của Tam thất và Nhân sâm, là nguyên liệu quý cho sản xuất các sản phẩm thực phẩm chức năng (TPBVSK) đang được sử dụng rộng rãi Việc xác định hàm lượng các chất này là rất quan trọng trong việc đánh giá chất lượng sản phẩm của các cơ sở sản xuất và các cơ quan quản lý Hiện nay, các dược điển chỉ có chuyên luận cho Nhân sâm và Tam thất, và các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào dược liệu, với ít nghiên cứu về TPBVSK chứa Nhân sâm Nghiên cứu này nhằm phát triển phương pháp định lượng các hoạt chất điển hình của Nhân sâm và Tam thất, để phân tích chất lượng các mẫu TPBVSK chứa một hoặc cả hai dược liệu trên thị trường Việt Nam Nghiên cứu được thực hiện theo tiêu chuẩn ISO IEC 17025, yêu cầu ít nhất 3 mẫu đại diện cho các dạng bào chế khác nhau Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin giá trị cho việc kiểm tra chất lượng các sản phẩm TPBVSK.

58 quy trình tham khảo cho các phòng thí nghiệm giúp tiết kiệm chi phí trong việc thẩm định và xây dựng phương pháp định lượng đồng thời các hoạt chất trong chế phẩm thực phẩm chức năng (TPBVSK) chứa Nhân sâm và Tam thất.

Phương pháp phân tích HPLC với detector DAD là một lựa chọn hiện đại, nhạy bén và chính xác, phù hợp với nhiều phòng thí nghiệm tại Việt Nam Sử dụng hệ dung môi acetonitril - nước trong chương trình gradient 80 phút giúp tiết kiệm thời gian so với các phương pháp truyền thống (100 phút) trong dược điển Với các sản phẩm TPBVSK có nền mẫu phức tạp và hàm lượng hoạt chất thấp, việc xây dựng quy trình xử lý mẫu để đạt tỷ lệ thu hồi cao và ổn định là rất quan trọng Sau khảo sát, quy trình chiết mẫu bằng siêu âm với methanol 90% và làm sạch qua cột chiết pha rắn đã cho thấy độ thu hồi cao và tinh khiết tốt, phù hợp với phân tích HPLC So với các nghiên cứu trước đó sử dụng dung môi hữu cơ, phương pháp chiết qua cột chiết pha rắn nhanh và ít độc hơn, mặc dù chi phí cao hơn.

Về kết quả thẩm định phương pháp

Nghiên cứu đã được thực hiện trên ba dạng bào chế: viên nang cứng, cao lỏng và viên nang mềm Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp nghiên cứu đã đạt được hiệu quả cao.

59 xây dựng đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác phù hợp với các yêu cầu của AOAC

Giỏ trị LOQ của cỏc chất phõn tớch từ 3,3 - 4,6 àg/ml tương ứng với 7,11

- 22,98 àg/g chế phẩm, thấp hơn so với nghiờn cứu của Đào Văn Đụn và cộng sự (2014) (cú LOQ là 6 - 8 àg/ml) [5], của Nguyễn Thị Hạnh và cộng sự

Phương pháp HPLC-UV được áp dụng trong nghiên cứu cho thấy độ giới hạn phát hiện (LOQ) dạng rắn là 30 àg/g chế phẩm, với khoảng tuyến tính từ 4 - 400 àg/ml, rộng hơn so với các dược điển và nghiên cứu trước đó Độ thu hồi tại mức nồng độ LOQ đạt từ 86,2 - 96,7%, tương tự như nghiên cứu của Zhijiang Wu (2017) với độ thu hồi từ 80,9 - 93,0% sử dụng UPLC-MS/MS Ở các mức nồng độ khác, độ thu hồi dao động từ 95,3 - 105,3%, với RSD từ 0,48 - 2,28% Kết quả này tương đương với các nghiên cứu trước đó về ginsenosid và saponin trong mẫu dược liệu Tam thất Độ chính xác của phương pháp đạt RSDr từ 1,41 - 2,91% và RSDR từ 1,29 - 3,23%, đều đáp ứng yêu cầu tiêu chuẩn.

60 pháp có độ lặp tốt và ổn định hơn nghiên cứu định lượng ginseosid Rg1, Rb1 trong TPBVSK chứa Nhân sâm của Nguyễn Thị Hạnh (2016) (RSD từ 1,03 - 5,17%) [7].

Về ứng dụng phân tích mẫu thực tế

Nghiên cứu đã áp dụng phương pháp định lượng để phân tích 20 mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK), trong đó có 01 mẫu chứa đồng thời Nhân sâm, Tam thất và 05 dược liệu khác; 09 mẫu chứa Tam thất cùng với ít nhất 02 dược liệu bổ sung.

10 mẫu sản phẩm chứa nhân sâm kết hợp với vitamin và các dược liệu khác được bào chế dưới nhiều dạng như bột, hoàn cứng, cốm hòa tan, trà túi lọc, viên nang cứng, cao lỏng, dung dịch uống và viên nang mềm, mang lại nhiều lợi ích sức khỏe đáng kể.

Hàm lượng ginsenosid R1 trong các mẫu dao động từ 1,57 mg/g chế phẩm với RSD < 1,8% Ginsenosid Rg1 có hàm lượng từ 5,86 mg/g chế phẩm, RSD < 2,12% Ginsenosid Re đạt hàm lượng 6,83 mg/g chế phẩm, RSD < 2,91% Ginsenosid Rb1 dao động từ 10,29 mg/g chế phẩm, RSD < 2,16% Kết quả cho thấy phương pháp nghiên cứu có độ chọn lọc và độ tin cậy cao trong việc định lượng các chất trong thực phẩm chức năng.

Trong 20 mẫu đã phân tích có 02 mẫu không đạt yêu cầu về hàm lượng R1, 04 mẫu không đạt yêu cầu về hàm lượng Rg1, Re, 03 mẫu không đạt yêu cầu hàm lượng Rb1 Từ đó cho thấy cần phải quản lý, kiểm tra chặt chẽ chất lượng các chế phẩm chứa Nhân sâm, Tam thất lưu hành trên thị trường để đảm bảo quyền lợi người tiêu dùng

Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Hà Nội đã áp dụng kỹ thuật HPLC theo quy trình TQKT/HL/036 để xác định hàm lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re và ginsenosid Rb1 trong các sản phẩm thực phẩm chức năng, nhằm đảm bảo chất lượng sản phẩm.

61 mẫu TPBVSK chứa Nhân sâm, Tam thất được các cơ sở gửi đến trung tâm, góp phần vào công tác đảm bảo chất lượng sản phẩm

Trong nghiên cứu này, do số lượng mẫu phân tích còn hạn chế, chúng tôi chưa thể đưa ra đánh giá khách quan về chất lượng thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) chứa Nhân sâm và Tam thất trên thị trường Chúng tôi dự định sẽ thực hiện các thử nghiệm với số lượng mẫu lớn hơn trong các nghiên cứu tiếp theo, nhằm đánh giá tổng quát và khách quan hơn về chất lượng các sản phẩm này.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Từ kết quả thu được, chúng tôi có những kết luận sau:

1 Đã xây dựng được phương pháp định lượng notoginsenosid R1 và các ginsenoside Rg1, Re, Rb1 trong TPBVSK (mẫu rắn, mẫu dạng dầu và dạng lỏng) bằng HPLC - DAD Mẫu thử được chiết bằng dung môi methanol 90% làm sạch bằng SPE cột SilactSPE TM C18, hiệu suất chiết với cả 4 chất đạt đều lớn hơn 95% Các chất phân tích được tách bằng cột InertSustain C18 (250 x 4,6 cm; 5 àm), pha động sử dụng hệ dung mụi acetonitril - nước rửa giải theo chương trình gradient trong 80 phút, phát hiện ở bước sóng 203 nm Các chất được tách rõ ràng, pic cân xứng, pha động dễ chuẩn bị, phù hợp với nhiều phòng thí nghiệm

2 Phương pháp đã được thẩm định đầy đủ các chỉ tiêu theo qui định của AOAC trên cả 3 nền mẫu Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đảm bảo độ chọn lọc; độ nhạy cao (LOQ cỏc chất trong khoảng 3,3 - 4,6 àg/ml); khoảng tuyến tớnh rộng (4,0 - 400,0 àg/ml) đối với cả 4 chất nghiờn cứu với

R 2 > 0,999 cho phép phân tích các mẫu với hàm lượng khác nhau từ 20 g/g -

Chế phẩm có nồng độ 2000 àg/g cho thấy độ thu hồi tốt ở ba mức nồng độ khảo sát, đạt từ 87,55% đến 103,53%, đáp ứng tiêu chuẩn AOAC Độ chính xác trong ngày và khác ngày cũng thỏa mãn yêu cầu đối với bốn chất nghiên cứu, với hệ số biến thiên tương đối (RSD) từ 1,80% đến 2,91%.

3 Đã ứng dụng phương pháp phân tích được 20 mẫu TPBVSK lưu hành trên thị trường gồm các dạng bào chế bột, hoàn cứng, cốm hòa tan, trà túi lọc, viên nang cứng, cao lỏng, dung dịch uống, viên nang mềm Kết quả thu được đã minh chứng cho phương pháp có đủ độ chọn lọc và độ tin cậy để định lượng các chất nghiên cứu trong TPBVSK, góp phần vào công tác đảm bảo chất lượng các sản phẩm chứa Nhân sâm và Tam thất lưu hành trên thị trường Việt Nam

Tiếp tục áp dụng phương pháp định lượng R1, Rg1, Re, Rb1 trong sản phẩm chứa Nhân sâm và Tam thất trong quá trình sản xuất và các chế phẩm lưu hành trên thị trường.

Nghiên cứu này tập trung vào việc phát triển phương pháp mở rộng đối tượng cho các hoạt chất ginsenosid Rf, R3, Rd và majonosid R2 Mục tiêu là xây dựng quy trình định lượng đồng thời các loại nhân sâm, hồng sâm, tam thất và sâm Ngọc Linh trong các dạng bào chế và chế biến khác nhau, phục vụ cho sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK).

Tiêu đề	Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Notoginsenosid R1 Và Một Số Ginsenosid Trong Thực Phẩm Bảo Vệ Sức Khỏe Bằng Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao
Tác giả	Đàm Thị Thu
Người hướng dẫn	PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
Trường học	Trường Đại Học Dược Hà Nội
Chuyên ngành	Kiểm Nghiệm Thuốc Và Độc Chất
Thể loại	luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2021
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	114
Dung lượng	2,87 MB