Xác định hàm lượng glutaraldehyd trong dung dịch khử khuẩn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tổng quan

Giới thiệu về chất khử khuẩn

Theo hướng dẫn của Bộ Y tế (2012) về khử khuẩn và tiệt khuẩn dụng cụ trong cơ sở khám bệnh, khử khuẩn là quá trình loại bỏ hầu hết hoặc toàn bộ vi sinh vật gây bệnh trên dụng cụ, tuy nhiên không tiêu diệt bào tử vi khuẩn.

Có ba mức khử khuẩn:

- Nhóm 1: Khử khuẩn mức độ cao (high level disinfection) là quá trình tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật và một số bào tử vi khuẩn

Khử khuẩn mức độ trung bình (intermediate-level disinfection) là quá trình khử trùng hiệu quả đối với M tuberculosis, vi khuẩn sinh dưỡng, virus và nấm, tuy nhiên không có khả năng tiêu diệt bào tử vi khuẩn.

Khử khuẩn mức độ thấp (low-level disinfection) trong Nhóm 3 có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn thông thường, một số loại virus và nấm, tuy nhiên, phương pháp này không hiệu quả trong việc tiêu diệt bào tử vi khuẩn.

Commonly used disinfectants include alcohol, chlorine and chlorine compounds, glutaraldehyde, ortho-phthalaldehyde (OPA), peracetic acid, hydrogen peroxide, iodophor, phenolic derivatives, formaldehyde, and quaternary ammonium compounds Notably, glutaraldehyde concentrations of 2% or higher are classified as Group 1 disinfectants.

Ngày nay, phương pháp khử khuẩn bằng hóa chất ngày càng trở nên phổ biến do tính tiện lợi và khả năng di chuyển dễ dàng của các trang thiết bị y tế nhạy cảm với nhiệt Một chất khử khuẩn lý tưởng cần có những đặc tính nhất định để đảm bảo hiệu quả trong việc tiêu diệt vi khuẩn.

- Phải có phổ kháng khuẩn rộng

- Không bị tác dụng của các yếu tố môi trường

- Không tác hại tới các dụng cụ kim loại cũng như bằng cao su, nhựa

- Hiệu quả kéo dài trên bề mặt các dụng cụ được xử lý

- Không mùi hoặc có mùi dễ chịu

- Có khả năng pha loãng

- Có nồng độ ổn định kể cả khi pha loãng để sử dụng

- Có khả năng làm sạch tốt

Glutaraldehyd sở hữu nhiều đặc tính ưu việt như tác dụng nhanh chóng và phổ kháng khuẩn rộng, đồng thời có khả năng làm sạch hiệu quả và duy trì tác dụng lâu dài trên bề mặt các dụng cụ đã được xử lý Nó không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, có mùi nhẹ hoặc không mùi, dễ dàng pha loãng và giữ được nồng độ ổn định ngay cả khi đã pha loãng, đồng thời độc tính của nó cũng không quá nặng.

[11], kinh tế, dễ sử dụng.

Tổng quan về glutaraldehyd

GA là một dialdehyd 5 C bão hòa, không màu, chất lỏng nhớt, mùi hăng, nồng

- Tên thương mại: Cidex, Glutaral

- Trọng lượng phân tử: 100,13 g/mol

- Nhiệt độ sôi: 187-188 o C (áp suất 760 mmHg)

- Độ tan: Tan trong mọi tỷ lệ nước - ethanol, tan trong benzen và ether

- Độ ổn định: Bền với ánh sáng, bị oxy hóa trong không khí, xảy ra phản ứng trùng hợp dưới tác động nhiệt [11]

GA có khả năng alkyl hóa các nhóm hydroxyl, carbonyl và amin, ảnh hưởng đến tổng hợp ADN, ARN và protein của vi khuẩn, dẫn đến sự bất hoạt của chúng Thêm vào đó, GA liên kết với protein trên thành tế bào, tạo ra lớp bao phủ, ức chế enzym qua màng và hạn chế quá trình trao đổi chất, từ đó tăng cường khả năng khử khuẩn.

GA có khả năng diệt khuẩn phổ rộng trong thời gian ngắn Hoạt tính kháng khuẩn được mô tả ở bảng 1.1

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của glutaraldehyd

Bảng 1.1 Khả năng khử khuẩn của dung dịch glutaraldehyd 2% trong nước [12]

Loại vi sinh vật Vi sinh vật cụ thể Thời gian chết

Streptococus aureus, Strep pyogenes, Strep pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginose, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus lysodeukticus

Trực khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis H37Rv < 10 phút

Polio types I và II, Echo type 6, Coxsackie B-1, Herpes simplex, Vaccina, Influenza A-2 (Asian), Adeno type II, Mouse hepatitis (MHV3)

Bên cạnh đó, GA cũng thể hiện khả năng diệt bào tử vượt trội so với một số chất khác cùng nhóm aldehyd, thể hiện ở bảng 1.2

Bảng 1.2 So sánh hoạt động diệt bào tử của một số aldehyd

Aldehyd Công thức hóa học Khả năng diệt bào tử

(propanedial) CHO.CH2.CHO Yếu

(butanedial) CHO.(CH2)2.CHO Yếu

(pentanedial) CHO.(CH2)3.CHO Rất tốt Adipaldehyd

(hexanedial) CHO.(CH2)4.CHO Yếu

1.2.3 Độc tính Độc tính cấp: tiếp xúc dung dịch GA nồng độ cao và hơi có thể gây kích ứng mắt, bỏng da Hít phải GA có thể gây kích ứng mũi, họng và đường hô hấp, gây ho, hắt xì, chóng mặt, đau đầu, buồn nôn Độc tính trường diễn: Những người làm việc, tiếp xúc lâu dài với GA có thể tăng độ mẫn cảm với hóa chất này Những người này dù hít phải GA nồng độ nhỏ, trong thời gian dài có thể có nguy cơ gây dị ứng trên da, khó thở, ho, tức ngực (các biểu hiện của hen do nghề nghiệp) Không có mối liên hệ rõ ràng giữa việc tiếp xúc với GA và nguy cơ gây ung thư, đột biến gen [11]

GA có nhiều ứng dụng khử khuẩn tùy thuộc vào nồng độ Tại Australia, dung dịch GA 1% - 2% được sử dụng để khử trùng ống nội soi, dụng cụ phẫu thuật và thiết bị nha khoa, trong khi dung dịch GA 0,1 - 0,3% được dùng để vệ sinh chuồng trại chăn nuôi Dung dịch GA 45% - 50% trong nước phục vụ cho việc xử lý nước trong hệ thống giải nhiệt công nghiệp và các tòa nhà lớn Đối với mục đích bảo quản, dung dịch GA 2% hoặc 5% được áp dụng Tại Việt Nam, GA thường được dùng để khử khuẩn dụng cụ y tế ở nồng độ 2% hoặc trong xử lý môi trường thủy sản với nồng độ tối thiểu 15%.

Phương pháp xác định glutaraldehyd

1.3.1 Một số phương pháp xác định glutaraldehyd Ở nước ngoài đã có nhiều phương pháp được áp dụng để xác định hàm lượng

Các phương pháp phổ biến để xác định GA bao gồm chuẩn độ iod, chuẩn độ acid-base và đo màu, nhưng chúng không chọn lọc cho từng aldehyd cụ thể Để đạt được độ chính xác cao hơn, có thể sử dụng các phương pháp như điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với sản phẩm dẫn xuất 2,4-dinitrophenylhydrazin và detector PDA, hoặc sắc ký khí (GC) với sản phẩm dẫn xuất o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl) hydroxylamin bằng detector ECD và MS Các phương pháp này cung cấp độ nhạy và độ chọn lọc tốt hơn cho việc phân tích GA.

Hiện tại, chưa có phương pháp định lượng GA bằng HPLC được phát triển tại Việt Nam Do đó, nghiên cứu đã chọn phương pháp sắc ký lỏng với detector PDA, một thiết bị phổ biến và dễ triển khai, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam, để xác định hàm lượng GA Nghiên cứu tham khảo một số phương pháp định lượng GA trong dung dịch khử khuẩn bằng HPLC – PDA trên thế giới, như được trình bày trong bảng 1.3 Ngoài ra, nghiên cứu cũng xem xét một số phương pháp định lượng aldehyd khác, đã được dẫn xuất với 2,4 - DNPH trước khi phân tích bằng HPLC – PDA, được liệt kê trong bảng 1.4.

Bảng 1.3 Một số phương pháp định lượng GA trong DDKK bằng HPLC

Tác giả Chuẩn bị mẫu Điều kiện sắc ký

- Dung dịch khử khuẩn pha loãng trong nước

- Pha tĩnh: Cột Nucleosil C18 RP

- Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút

- Bước sóng cực đại: 358 nm Barnes A R

- Dung dịch khử khuẩn pha loãng trong ACN

- Pha tĩnh: Cột cyanid Zorbax

- Tốc độ dòng: 1 mL/phút

- Bước sóng cực đại: 365 nm Maggadani

- Dung dịch khử khuẩn pha loãng trong ACN

- Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút

Bảng 1.4 Một số phương pháp định lượng aldehyde trên nền mẫu khác bằng HPLC

Tác giả Chuẩn bị mẫu Phương pháp

- Dung dịch aldehyd – 2,4- dinitrophenyl hydrazon pha loãng trong ACN

- Dung dịch 2,4 - DNPH chứa 0,01 – 10% H3PO4 pha trong ACN

- Pha tĩnh: Cột Amid C16 (250 x 4,6 mm, 5 àm), cột Bonus RP

(250 x 4,6 mm, 5àm) hoặc cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 àm)

- Pha động: ACN - nước theo gradient: 0 phút – 40% ACN, 5 phút – 40% ACN, 25 phút – 58% ACN, 40 phút – 70% ACN, 60 phút – 70% ACN)

- Thể tớch tiờm: 20 àL Kim S U và cộng sự [18]

5 mL mẫu mỹ phẩm ủ ở 40 o C/ 60 phút với 6 mL 2,4 - DNPH 0,3%/ACN và 5 mL đệm acetat

- Pha tĩnh: Cột Capcell Pak C18

- Pha động: ACN - nước theo gradient: 0 phút: 50% ACN, 10 phút: 50% ACN, 12 phút: 90% ACN, 18 phút: 90% ACN, 25 phút: 50% ACN

1.3.2 Phản ứng tạo dẫn xuất với 2,4 – dinitrophenylhydrazin

2,4-dinitrophenylhydrazin (C6H3(NO2)2NHNH2) là một chất rắn màu cam đến đỏ, được sử dụng từ năm 1926 để định lượng nhóm carbonyl trong aldehyd và keton 2,4-DNPH là một thuốc thử đáng tin cậy, dễ chuẩn bị và cho sản phẩm hydrazon ổn định, dễ kết tinh với điểm nóng chảy rõ nét.

Hình 1.2 Phản ứng tạo dẫn xuất của GA với 2,4 - DNPH

Dựa trên cấu trúc hydrazon, sản phẩm của phản ứng có thể tồn tại dưới dạng ba đồng phân hình học: E,E, E,Z và Z,Z Tuy nhiên, nghiên cứu của Roper và Zahn (1990) dựa vào phổ cộng hưởng từ hạt nhân đã chỉ ra rằng chỉ có hai đồng phân E,E và E,Z được hình thành.

Trong nghiên cứu của Rietz và Barnes, hai đồng phân được khảo sát có bước sóng cực đại lần lượt là 363 nm và 355 nm Kết quả này tương đồng với độ lệch bước sóng cực đại của các aldehyd - 2,4 - diphenylhydrazon hình học khác, với độ lệch từ 5 đến 8 nm.

Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC

Sắc ký lỏng là phương pháp tách các chất dựa trên sự phân bố khác nhau giữa hai pha không trộn lẫn, với pha động là chất lỏng chảy qua pha tĩnh trong cột Trong quá trình sắc ký, các chất phân tích phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Khả năng tương tác của các chất với hai pha này khác nhau do cấu trúc phân tử và tính chất lý hoá, dẫn đến việc chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

Trong HPLC, tùy thuộc vào kỹ thuật sắc ký người ta chia thành:

- Sắc ký phân bố (Partition Chromatography: PC)

- Sắc ký hấp phụ, có 2 loại: Pha thuận (Normal phase: NP-HPLC), Pha ngược hay pha đảo (Reverse phase: RP- HPLC)

- Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC) và tạo cặp ion (IP-HPLC)

- Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC)

1.4.2 Nguyên tắc – cấu tạo hệ thống HPLC

Sơ đồ máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC gồm các bộ phận sau [1]:

- Pha động: Dung môi đưa mẫu đi qua cột

- Pha tĩnh: Cột sắc ký đặt trong buồng cột

- Hệ thống tiêm mẫu: Đưa mẫu vào cột

- Detector (PDA): Phát hiện chất phân tích trong mẫu

- Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc hệ thống HPLC

Hệ cấp pha động bao gồm bình chứa pha động, bộ phận khử khí bơm cao áp và bộ phận trộn dung môi, cho phép thực hiện phân tích theo chương trình đẳng dòng hoặc gradient.

Hệ tiêm mẫu: Mẫu được chuẩn bị dưới dạng dung dịch trước khi tiêm thủ công hoặc tự động vào cột

Cột và buồng cột là hai thành phần quan trọng trong sắc ký Cột pha tĩnh thường được làm từ thép không gỉ, có chiều dài từ 5 đến 25 cm và đường kính trong từ 1 đến 10 mm, với hạt nhồi có kích thước từ 0,3 đến 5 µm Chất nhồi của cột phụ thuộc vào loại cột và kỹ thuật sắc ký được sử dụng Buồng cột có chức năng điều nhiệt cho cột sắc ký, giúp duy trì sự ổn định trong suốt quá trình phân tích.

Detector là bộ phận quan trọng trong việc phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột, cung cấp tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để định tính và định lượng Detector PDA có khả năng đo ở bất kỳ bước sóng nào trong vùng UV – VIS, cho phép lựa chọn bước sóng tối ưu cho chất phân tích Với tính linh hoạt và phạm vi ứng dụng rộng, detector PDA trở thành thiết bị phổ biến hơn so với detector UV – VIS, vốn chỉ đo ở bước sóng cố định.

Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu: Ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang

1.4.3 Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký

Thời gian lưu giữ của các chất tan trong mẫu phân tích được xác định khi chúng được nạp vào cột sắc ký và lưu giữ trên pha tĩnh trong một khoảng thời gian nhất định Thời gian này, được tính từ lúc nạp mẫu cho đến khi chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở nồng độ cực đại, được ký hiệu là tRi Công thức tính thời gian lưu hiệu dụng là tR’ = tR - t0 Khi hai chất A và B xuất hiện kế tiếp trong sắc đồ, thông số α, hay hệ số tách, thể hiện thời gian lưu tương đối của chúng Giá trị α càng lớn thì sự tách biệt giữa hai chất A và B càng rõ ràng.

- Hệ số phân bố và hệ số dung lượng

Quá trình tách sắc ký của các chất dựa trên sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh, diễn ra liên tục trong suốt quá trình sắc ký Hệ số phân bố được định nghĩa là tỷ lệ nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh so với pha động và được tính theo công thức nhất định.

Hệ số Ki cho ta biết khả năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha (pha động và pha tĩnh)

Hệ số dung lượng k’I là tỷ lệ giữa thời gian lưu hiệu chỉnh và thời gian không lưu giữ, phản ánh khả năng lưu giữ của cột đối với cấu tử Công thức tính hệ số này được biểu diễn như sau: 𝑘 ′ = 𝑡′ 𝑅.

𝑡 𝑜 Hệ số dung lượng k càng lớn thì thời gian phân tích càng lâu

- Độ chọn lọc: Độ chọn lọc α đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột α = 𝐾′ 𝐵

- Số đĩa và chiều cao của đĩa trong cột sắc ký:

Ta có công thức tính số đĩa lý thuyết:

Từ đó ta có Chiều cao H này được xác định theo công thức:

Để đánh giá độ tách của các chất trong một hệ pha, người ta sử dụng đại lượng độ phân giải Rs, được xác định theo một công thức cụ thể.

Thời gian lưu hiệu lực của hai chất A và B được ký hiệu là t’RA và t’RB, trong khi chiều rộng đáy của pic sắc ký tương ứng với hai chất này được gọi là WA và WB.

Đối tượng và phương pháp phân tích

Đối tượng nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu này tập trung vào mẫu dung dịch khử khuẩn chứa glutaraldehyd, được gửi kiểm nghiệm tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, với thông tin về hàm lượng chưa được công bố.

Nguyên vật liệu, thiết bị

- Chất chuẩn: Chuẩn GA 25% trong nước, Lot STBH9910 (Sigma – Aldrich, Mỹ)

Acid phosphoric 85% tinh khiết phân tích

Nước cất 2 lần dùng ngay sau khi cất

Các thiết bị, dụng cụ sử dụng là các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm:

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) e2695 bao gồm các thành phần chính như bơm cao áp, bộ điều nhiệt cột, bộ tiêm mẫu tự động và detector 2998 PDA Hệ thống này được hỗ trợ bởi phần mềm Empower 3 của Waters, Mỹ, giúp xử lý kết quả một cách hiệu quả.

- Cột Aggilent Eclipse XDB-CN (250 x 4,6 mm, 5 àm); cột Waters Symmentry

- Và một số thiết bị, dụng cụ khác: cân phân tích (có độ chính xác 0,0001 g) XS105, (Metter Toledo, Thụy Sĩ); micropipet điều chỉnh được thể tớch loại 10-100 àL, 20-

Chúng tôi cung cấp các sản phẩm như pipet Eppendorf với dung tích 200 àL và 100-1000 àL, cùng với pipet cú bầu loại 1, 2, 3, 4 ml Ngoài ra, còn có bình định mức và bình đựng mẫu chính xác cấp A, cùng với lọ đựng mẫu 1,8ml có nắp dùng để tiêm mẫu cho HPLC Chúng tôi cũng cung cấp tủ ấm Gyromax 737R từ Amerex Instrument, Mỹ, cùng với các thiết bị và dụng cụ khác phục vụ cho phòng thí nghiệm.

Nội dung nghiên cứu

- Tối ưu quá trình dẫn xuất GA với 2,4-DNPH

- Lựa chọn dung môi pha loãng mẫu

- Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích glutaraldehyd bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Thẩm định phương pháp dựa trên các tiêu chí: độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ dúng

- Ứng dụng phương pháp trên xác định hàm lượng glutaraldehyd trong một số dung dịch khử khuẩn gửi VKNATVSTPQG.

Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc GA 1000 àg/mL, hãy sử dụng micropipet hút 0,1 mL glutaraldehyd và cho vào bình định mức 25 mL Sau đó, thêm ACN cho đến vạch định mức và lắc đều để thu được dung dịch chuẩn.

Để tạo dung dịch chuẩn trung gian GA 50 àg/mL, hãy sử dụng micropipet hút chính xác 1 mL dung dịch chuẩn gốc GA 1000 àg/mL và cho vào bình định mức 20 mL Sau đó, định mức bằng ACN và lắc đều để thu được dung dịch chuẩn trung gian GA 50 àg/mL.

Để pha dung dịch chuẩn GA 5 – 50 àg/mL, cần hút chính xác x (mL) dung dịch chuẩn trung gian GA 50 àg/mL vào bình định mức phù hợp, sau đó định mức bằng ACN và lắc đều Quy trình pha chế dãy dung dịch chuẩn được trình bày chi tiết trong bảng 2.1.

Bảng 2.1 Quy trình pha dãy chuẩn GA

Nồng độ GA (àg/mL) 40 30 25 20 10 5 x (mL) 4 3 5 2 1 1

Thể tích định mức (mL) 5 5 10 5 5 10

2.4.2 Tối ưu quá trình dẫn xuất

Để đảm bảo độ tuyến tính trong quá trình phân tích, tỷ lệ khối lượng DNPH : GA cần đạt trên 32 với nồng độ lớn (0,31 – 2,5 g/L tương ứng 310 – 2500 àg/mL) hoặc từ 250 - 500 với nồng độ nhỏ (1,25 – 10 mg/L tương ứng 1,25 – 10 àg/mL) Để đơn giản hóa quy trình dẫn xuất và đảm bảo thuốc thử luôn dư, cần pha loãng dung dịch glutaraldehyd mẫu thử và chuẩn bị thuốc thử 2,4 - DNPH ở mức 2,5 g/L (tương ứng 2500 àg/mL), thực hiện phản ứng theo tỷ lệ 1:1.

GA cần được dẫn xuất hóa trước khi tiến hành phân tích Để tối ưu hóa quá trình này, một số khảo sát đã được thực hiện nhằm đảm bảo phản ứng diễn ra nhanh chóng và đơn giản.

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nồng độ acid phosphoric ảnh hưởng đến phản ứng dẫn xuất

- Nghiên cứu độ ổn định của sản phẩm dẫn xuất hóa theo thời gian

- Khảo sát nhiệt độ phản ứng

Chuẩn bị các dung dịch thuốc thử 2,4 – DNPH ở các nồng độ acid phosphoric khác nhau như sau:

Dung dịch acid phosphoric 10% được chuẩn bị bằng cách hút khoảng 2,95 mL acid phosphoric 85% vào bình định mức 25 mL, sau đó thêm ACN đến vạch định mức và lắc đều.

Để chuẩn bị dung dịch acid phosphoric 1%, hút chính xác 1 mL dung dịch acid phosphoric 10% vào bình định mức 10 mL, sau đó thêm ACN đến vạch và lắc đều Kết quả thu được là dung dịch acid phosphoric 1% trong ACN.

Để chuẩn bị thuốc thử 2,4 - DNPH 2500 àg/mL, bạn cần cân khoảng 0,25g bột 2,4 - DNPH vào bình định mức 100 mL Sau đó, thêm 1 mL acid phosphoric 1% và định mức bằng dung môi ACN, lắc đều để hòa tan.

Để chuẩn bị thuốc thử 2,4 - DNPH với nồng độ 2500 µg/mL, cần hòa tan khoảng 0,125g bột 2,4 - DNPH vào bình định mức 50 mL Sau đó, thêm 5 mL acid phosphoric 1% vào và định mức bằng acetonitrile (ACN), lắc đều để đảm bảo dung dịch đồng nhất.

- Thuốc thử 2,4 - DNPH 2500 àg/mL, acid phosphoric 1%: Cõn chớnh xỏc khoảng 0,125g bột 2,4 - DNPH vào bình định mức 50 mL, thêm 5 mL acid phosphoric

10 % bên trên và định mức bằng ACN, lắc đều

2.4.3 Lựa chọn dung môi pha mẫu

Dựa trên tính chất lý hóa của GA và sản phẩm dẫn xuất hydrazon, cùng với việc tham khảo các tài liệu [10], [19], [21], chúng tôi đã tiến hành khảo sát hai dung môi pha mẫu là nước và ACN.

2.4.4 Khảo sát điều kiện sắc ký

Dựa trên công thức cấu tạo và tính chất lý hóa của GA, cùng với các nghiên cứu đã tham khảo, tiến hành khảo sát pha tĩnh trên các loại cột như C18, cột cyanid, cột C8, cột Amid C16 và cột Bonus RP.

2.4.4.2 Khảo sát tỷ lệ pha động

Từ tài liệu [10],[18],[19],[21],[27], tiến hành khảo sát hệ pha động ACN - acid phosphoric 0,1% trong nước và ACN - nước ở các tỷ lệ và gradient khác nhau

Để chuẩn bị dung dịch acid phosphoric 0,1% trong nước, bạn cần hút chính xác 1 mL acid phosphoric 85% vào bình thủy tinh 1 L chứa 850 mL nước cất đã lọc qua màng 0,45 µm hai lần Sau đó, lắc đều dung dịch để đảm bảo hòa tan hoàn toàn.

Sau khi xác định điều kiện sắc ký và tối ưu hóa quá trình dẫn xuất GA với 2,4-DNPH, chúng tôi đã lựa chọn dung môi pha mẫu và tiến hành thẩm định phương pháp định lượng GA theo tiêu chuẩn AOAC Các tiêu chí thẩm định bao gồm độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ chính xác và độ đúng.

2.4.5.1 Độ phù hợp hệ thống Độ phù hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn GA và ghi nhận các giá trị thời gian lưu cùng với diện tích pic Tính toán độ tương thích của hệ thống thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD %) của các đáp ứng phân tích.

Yêu cầu: Các giá trị thời gian lưu và diện tích pic của GA có RSD (%) ≤ 2%

Ứng dụng phương pháp

Áp dụng phương pháp trên tiến hành phân tích GA trong dung dịch khử khuẩn trên thị trường

Xử lý kết quả

Một số đặc trưng thống kê: Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào dựa vào các hàm số trong Microsoft Excel

Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Tối ưu hóa quá trình dẫn xuất glutaraldehyd với 2,4 – dinitrophenylhydrazin

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nồng độ acid phosphoric ảnh hưởng đến phản ứng dẫn xuất

Thực hiện thí nghiệm phản ứng GA 50 àg/mL với thuốc thử 2,4-DNPH 2500 àg/mL trong ACN có chứa H3PO4 ở các nồng độ 0,01%, 0,1% và 1% trong thời gian phản ứng 15, 30, 45 và 150 phút Phân tích mẫu và nhận xét dựa trên sự thay đổi diện tích pic, kết quả được thể hiện trong hình 3.1.

Hình 3.1 Ảnh hưởng thời gian và nồng độ acid phosphoric trong thuốc thử đến phản ứng dẫn xuất

Ở nồng độ acid phosphoric 0,01% và 0,1%, diện tích pic tăng theo thời gian nhưng vẫn nhỏ hơn diện tích pic ở nồng độ 1%, cho thấy phản ứng chưa hoàn toàn Ngược lại, diện tích pic ở nồng độ 1% không thay đổi đáng kể theo thời gian, chứng tỏ rằng thời gian phản ứng 15 phút là đủ để phản ứng xảy ra hoàn toàn.

Kết luận: Để giảm thiểu ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng và đơn giản hóa phương pháp, cũng như rút ngắn thời gian xử lý mẫu, chúng tôi đã chọn thuốc thử 2,4-DNPH 2500 với 1% acid phosphoric để tiếp tục nghiên cứu.

Acid phosphoric 1% Acid phosphoric 0,1% Acid phosphoric 0,01%

3.1.2 Độ ổn định của sản phẩm dẫn xuất hóa theo thời gian

Thực hiện thí nghiệm phản ứng GA với nồng độ 50 àg/mL và thuốc thử 2,4-DNPH 2500 àg/mL trong dung môi ACN chứa 1% H3PO4, chúng tôi đã phân tích và so sánh tỷ lệ phần trăm diện tích pic sau các khoảng thời gian 1, 3, 5, 7 và 9 giờ Kết quả được trình bày trong hình 3.2.

Hình 3.2 Độ ổn định của sản phẩm dẫn xuất hóa

Nhận xét cho thấy rằng diện tích pic của dẫn xuất hydrazon không thay đổi đáng kể qua các thời điểm khác nhau, điều này chứng tỏ rằng sản phẩm dẫn xuất hóa hydrazon ổn định trong dung dịch phản ứng trong suốt quá trình phân tích.

Kết luận: Quá trình dẫn xuất hóa mẫu có thể được thực hiện chỉ trong 15 phút, và việc phân tích có thể diễn ra trong ngày mà không cần phải thực hiện ngay lập tức hoặc sử dụng chất dừng phản ứng.

3.1.3 Khảo sát nhiệt độ phản ứng

Nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ và hiệu suất của phản ứng dẫn xuất hóa, vì vậy cần tiến hành dẫn xuất hóa ở cả hai điều kiện: có gia nhiệt (45 độ C trong 45 phút) và không gia nhiệt (nhiệt độ phòng).

Theo Menet [21], ở nồng độ thấp (1,25 – 10 mg/L tương đương 1,25 – 10 àg/mL), hệ số tương quan của đường chuẩn sẽ thấp hơn 0,999 nếu không đun nóng Do đó, việc nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình phản ứng cần được thực hiện trên toàn bộ khoảng nồng độ đường chuẩn dự kiến (1 – 10 àg/mL).

Thực hiện phản ứng GA ở khoảng nồng độ 1 – 10 àg/mL với thuốc thử 2,4 - DNPH 2500 àg/mL trong ACN chứa acid phosphoric 1% ở nhiệt độ thường và ở 45 o C/

45 phút Kết quả thể hiện ở hình 3.3 và bảng 3.1

Phần trăm diện tích pic(%)

Bảng 3.1 So sánh tín hiệu của sản phẩm dẫn xuất ở 2 điều kiện nhiệt độ:

45 o C/ 45 phút (A) và nhiệt độ thường (B)

Hình 3.3 So sánh tín hiệu của dẫn xuất ở 2 điều kiện nhiệt độ:

45 o C/ 45 phút và nhiệt độ thường

Diện tích pic và thời gian lưu của dẫn xuất hydrazon ở hai điều kiện nhiệt độ tương tự cho thấy rằng hiệu suất và tốc độ phản ứng dẫn xuất hóa không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ.

- Đường chuẩn khi dẫn xuất hóa có gia nhiệt có hệ số tương quan r không tốt hơn khi không gia nhiệt (bảng 3.1), trái với dự kiến ban đầu

Kết luận: Để đơn giản hóa quá trình xử lý mẫu, phản ứng GA nên được thực hiện ở mọi mức nồng độ với thuốc thử 2,4 - DNPH trong dung môi ACN chứa 1% H3PO4 ở nhiệt độ thường.

Nồng độ (àg/mL)45oC/ 45 phút nhiệt độ thường

3.1.4 Lựa chọn dung môi pha mẫu

Trong các nghiên cứu trước đây, nước và acetonitrile (ACN) là hai dung môi phổ biến được sử dụng để pha loãng mẫu Mặc dù dẫn xuất hóa GA tan trong nước, nhưng thuốc thử 2,4-DNPH lại có độ tan thấp trong nước Hiện tại, chưa có tài liệu chính thức nào công bố độ tan của sản phẩm dẫn xuất GA – 2,4-dinitrophenylhydrazon Các mẫu định lượng thực tế có nồng độ dao động từ 0,1% đến 50%, trong khi một số mẫu gửi đến VKNATVSTPQG không công bố nồng độ GA Để đơn giản hóa quy trình pha loãng mẫu, cần thực hiện hai bước cụ thể.

- Bước 1: Pha loãng mẫu về nồng độ khoảng 0,1%

- Bước 2: Cân bằng lại tỷ lệ ACN – nước

Thực hiện hai bước trên với cả hai loại dung môi nước và ACN

- Bước 1: Pha loãng 50 lần dung dịch khử khuẩn (nồng độ khoảng 10%) vào 2 ống nghiệm lần lượt bằng nước và ACN Lắc đều Nhận xét Kết quả thể hiện ở hình 3.4A

Bước 2: Pha loãng mẫu đã chọn với tỷ lệ 1:100 bằng ACN và nước, sau đó thực hiện phản ứng với thuốc thử 2,4-DNPH theo tỷ lệ 1:1 Lắc đều hỗn hợp và tiến hành nhận xét kết quả, được thể hiện trong hình 3.4B.

Hình 3.4 Lựa chọn dung môi pha mẫu (1: nước, 2: ACN)

- Bước 1: Khi pha loãng DDKK bằng nước được dung dịch trong suốt, trong khi pha loãng bằng ACN lại có tủa trắng, dịch trắng đục (hình 3.4A)

Kết quả từ bước 1 cho thấy ống 1 (tỷ lệ nước – ACN 1:1) có tủa vàng giống sản phẩm hydrazon, trong khi ống 2 (tỷ lệ nước – ACN 1:199) chỉ có dung dịch vàng Phân tích phần dịch trong cho thấy ống 1 chỉ cho pic bằng 1/10 so với ống 2, chứng tỏ hydrazon đã bị tủa lại, do đó không nên dùng nước để pha loãng ở bước 2 Phần dịch trong ống 2 được pha loãng 100 lần bằng ACN và lọc qua màng 0,2 µm PTFE, sau đó phản ứng với thuốc thử 2,4 – DNPH Phân tích mẫu này trên HPLC – PAD cho thấy có pic với thời gian lưu và diện tích tương đồng với mẫu pha loãng bằng nước Tuy nhiên, việc pha loãng bằng ACN tốn kém hơn, vì vậy nghiên cứu quyết định sử dụng nước cất làm dung môi pha loãng cho bước 1 và ACN cho bước 2.

Hình 3.5 Sắc ký đồ phản ứng dẫn xuất hóa bước 2

Kết luận: Bước 1 pha loãng mẫu thử bằng nước đến nồng độ khoảng 0,1 – 0,5%, bước 2 pha loãng mẫu 100 lần bằng ACN

Quy trình chuẩn bị mẫu thử bao gồm các bước sau: Đầu tiên, pha loãng mẫu thử bằng nước đến nồng độ khoảng 0,1 – 0,5% Tiếp theo, tiến hành pha loãng mẫu thử thêm 100 lần bằng ACN Cuối cùng, thực hiện phản ứng dẫn xuất bằng cách cho dịch pha loãng mẫu thử tương tác với thuốc thử 2,4-DNPH.

2500 àg/mL trong ACN chứa 1% acid phosphoric theo tỷ lệ 1:1 ở tối thiểu 15 phỳt, rồi phân tích bằng HPLC - PDA Tóm tắt các bước chuẩn bị trong hình 3.6

Hình 3.6 Sơ đồ chuẩn bị mẫu

Khảo sát điều kiện sắc ký

Based on section 1.3.1 and the actual conditions of the laboratory, the Water Symmetry C18 column (250 x 4.6 mm, 5 µm) and the Agilent Eclipse XDB-CN column (250 x 4.6 mm, 5 µm) were selected for investigation.

Tiến hành phân tích chuẩn GA 50 àg/mL trên cột C18 với pha động là hỗn hợp ACN - nước (75:25) theo phương pháp của Maggadani và trên cột CN với pha động ACN - H3PO4 0,1% (62:38) theo phương pháp của Menet Kết quả được trình bày trong hình 3.7.

Hình 3.7 Lựa chọn pha tĩnh (A: cột C18, B: cột CN)

Cột CN: Vị trí xuất hiện pic chỉ có 1 pic, thời gian phân tích ngắn tuy nhiên pic chuẩn chưa tách hẳn khỏi pic thuốc thử

Cột C18 cho thấy pic sắc ký sắc nhọn và khả năng lưu giữ tốt, nhưng sắc ký đồ lại không thể hiện đường nền phẳng tại vị trí pic chuẩn Ngoài ra, vị trí xuất hiện pic còn có 2 pic chưa được tách hoàn toàn.

Kết quả quét phổ UV của hai đồng phân EE và EZ – hydrazon (hình 3.8) cho thấy chúng có phổ tương tự, với bước sóng cực đại chênh lệch khoảng 5 nm, điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây [10], [26], [27].

Hình 3.8 Phổ 2 pic trên sắc ký đồ cột C18

Tỷ lệ hai đồng phân EE và EZ hình thành trong phản ứng dẫn xuất hóa phụ thuộc vào nồng độ acid và thời gian, như được nêu trong nghiên cứu của Uchiyama [27] Tuy nhiên, khi khảo sát cột C18 với hai pha động ACN – nước và ACN - H3PO4 0,1% với các tỷ lệ khác nhau, việc tách hoàn toàn hai đồng phân này chưa thành công Do đó, không thể xác định tỷ lệ giữa hai đồng phân như tài liệu tham khảo [27] đã chỉ ra, dẫn đến khả năng sai số nếu tính toán trên tổng diện tích của hai pic này.

Kết luận: Cần tiếp tục nghiên cứu tỷ lệ pha động nhằm tách biệt hoàn toàn pic dẫn xuất hydrazon khỏi pic thuốc thử và các thành phần khác trong mẫu thử.

3.2.2 Khảo sát tỷ lệ pha động

Tiến hành khảo sát pha động ACN - H3PO4 0,1% ở các tỷ lệ 62:38, 55:45, 50:50 Kết quả thể hiện trên hình 3.9

Hình 3.9 Sắc ký đồ khảo sát pha động ACN - H 3 PO 4 0,1%

Khi tỉ lệ ACN trong pha động giảm từ 62% xuống 50%, pic chuẩn tách biệt rõ ràng khỏi pic dẫn xuất, mặc dù tín hiệu có giảm Hệ số phân giải trong các sắc ký đồ A, B, C lần lượt là 0,59, 1,06 và 1,64 (> 1,5), cho thấy pic của sản phẩm dẫn xuất trong sắc ký đồ C tách tốt khỏi pic thuốc thử và các thành phần khác trong nền mẫu.

Kết luận: Chọn tỷ lệ pha động là ACN - H3PO4 0,1% 50:50

Vậy lựa chọn điều kiện sắc ký sau để tiến hành phân tích GA:

- Pha tĩnh: cột cyanid Agilent Eclipse XDB-CN (250 x 4,6 mm, 5 àm)

- Pha động: ACN - acid phosphoric 0,1% (50:50 v/v)

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

- Bước sóng phát hiện: 360 nm

- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àL

- Thời gian phân tích ngắn: 10 phút

Thẩm định phương pháp

3.3.1 Độ phù hợp hệ thống

Chuẩn bị dung dịch chuẩn GA 1000 àg/mL theo mục 2.4.1, sau đó pha loãng mẫu chuẩn với tỷ lệ 25 lần bằng ACN Tiến hành phân tích mẫu này 06 lần theo phương pháp đã chọn ở mục 3.1 Ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tích pic, với kết quả được trình bày trong bảng 3.2 và phụ lục I.

Bảng 3.2 Kết quả độ phù hợp hệ thống

STT Dẫn xuất hydrazon t R (phút) S (mAU.s)

Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các thông số phân tích đều dưới 2% Như vậy, phương pháp đạt tiêu chuẩn về độ ổn định hệ thống

Chuẩn bị mẫu thử như mục 3.1.5 và mẫu chuẩn như mục 2.4.1, sau đó tiến hành phân tích theo phương pháp mục 3.3 Kết quả được thể hiện ở hình 3.10 và hình 3.11

- Trên sắc ký đồ chuẩn glutaraldehyd ở bước sóng 360nm xuất hiện pic ở 8,905 phút

- Trên sắc ký đồ của mẫu trắng (dung dịch khử khuẩn không chứa glutaraldehyd) không có pic tại thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu chuẩn

- Trên sắc ký đồ mẫu thử và thử thêm chuẩn có pic tương ứng với thời gian lưu của pic trên sắc ký đồ mẫu chuẩn

Kết luận: Phương pháp đã khảo sát có tính chọn lọc với glutaraldehyd

Mẫu thử Mẫu thử thêm chuẩn

Hình 3.10 Sắc ký đồ độ chọn lọc

Hình 3.11 Kết quả chồng pic ở bước sóng 360 nm

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn glutaraldehyd với nồng độ từ 5 – 50 µg/mL và tiến hành phân tích bằng HPLC để xây dựng mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích tương ứng Thông tin về nồng độ và tín hiệu của chất phân tích được trình bày trong bảng 3.3.

Bảng 3.3 Kết quả đường chuẩn

Nồng độ (àg/mL) Spic (mAU.s) Nồng độ thực tế

Nhận xét: Trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic của glutaraldehyd Độ lệch ∆ < 15%, 1> R² > 0,99

Kết luận: Phương pháp đã khảo sát có khoảng tuyến tính đạt yêu cầu

Để đảm bảo độ chính xác, chúng tôi đã thực hiện 6 lần phân tích riêng biệt trên cùng một mẫu thử Ngoài ra, một lần phân tích thêm được tiến hành vào thời điểm khác để đánh giá độ chính xác trung gian Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.4.

Nhận xét: Độ lặp lại và độ lặp lại trung gian của hàm lượng glutaraldehyd đạt yêu cầu

Kết luận: Phương pháp đã khảo sát đạt về độ chính xác

Tiến hành thêm chuẩn vào mẫu thực và tính hiệu suất thu hồi theo công thức đã được đề cập ở mục 2.4.4.6 Kết quả thể hiện ở bảng 3.5

Nhận xét: Kết quả phân tích cho thấy độ thu hồi của glutaraldehyd nằm trong khoảng 97,8 – 103,2 %, phù hợp với yêu cầu của AOAC [8]

Kết luận: Phương pháp khảo sát đạt độ đúng

Bảng 3.4 Kết quả độ chính xác

Bảng 3.5 Kết quả độ đúng

Thể tích định mức (mL)

Thể tích std 25000 àg/mL spike (mL)

Nồng độ mẫu (àg/mL)

Ứng dụng

Phương pháp phân tích sử dụng hóa chất và thiết bị phổ biến, với thời gian phân tích ngắn chỉ 10 phút cho mỗi lần tiêm mẫu, đã được thẩm định theo tiêu chí AOAC, cho phép dễ dàng chuyển giao giữa các phòng thí nghiệm Phương pháp này đáp ứng đủ điều kiện để tiến hành thẩm định liên phòng thí nghiệm, nhằm phát triển thành phương pháp chính thức, góp phần quan trọng trong việc định lượng các dung dịch khử khuẩn chứa GA trên thị trường.

Kết quả phân tích 10 mẫu dung dịch khử khuẩn không có hàm lượng ghi trên nhãn, gửi kiểm nghiệm tại VKNATVSTPQG, cho thấy tất cả các mẫu đều chứa GA như đã ghi trên nhãn, với nồng độ dao động từ 0,2% đến 27,1% như được mô tả trong bảng 3.6 Các mẫu được chuẩn bị theo hình 3.6, trong đó mẫu 2 và 4 chỉ được pha loãng 10 lần ở bước 2.

Bảng 3.6 Nồng độ 10 mẫu DDKK

Một số sắc ký đồ phân tích dung dịch khử khuẩn chứa GA thể hiện trong hình 3.12

Hình 3.12 Sắc ký đồ phân tích DDKK chứa GA