Tiếp tục nghiên cứu bào proliposome berberin định hướng làm nguyên liệu cho dạng thuốc rắn

TỔNG QUAN

Đại cương về berberin

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của berberin base

- Công thức phân tử: C20H18NO4 +

- Khối lượng phân tử: 336,366 g/mol

Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin, thường được tìm thấy trong rễ, thân rễ và vỏ cây của các loài thuộc chi Berberis, Coptidis và Coscinium Tại Việt Nam, berberin chủ yếu được chiết xuất từ thân và rễ cây Vàng đắng (Coscinium usitatum Pierre) với hàm lượng khoảng 2-3%.

 Cảm quan: Tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị rất đắng

Berberin có độ tan chậm trong nước và ít tan trong ethanol, methanol; nó cũng khó tan trong ether và cloroform Do không có carbon bất đối, berberin không có đồng phân quang học.

 Berberin phát huỳnh quang màu vàng đậm dưới ánh sáng tử ngoại UV

 Hóa tính của N: Berberin có tính chất như một base yếu

 Ở vị trí N của Berberin kém ổn định trong môi trường kiềm mạnh, dễ hỗ biến mở vòng isoquinolin cho chức aldehyd gọi là berberinal

 Liên kết đôi C=N của vòng isoquinolin tham gia phản ứng khử nối đôi

Berberin đã được sử dụng từ nhiều năm nay với tác dụng dược lý chính là điều trị tiêu chảy với hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng [21], [29]

Nghiên cứu gần đây cho thấy berberin có khả năng điều trị các bệnh mạn tính hiệu quả Berberin giúp hạ đường huyết tương tự như metformin bằng cách ức chế reductase aldose, từ đó giảm đường huyết và kháng insulin Ngoài ra, berberin còn làm giảm cholesterol, LDL cholesterol, triglycerid và các mảng xơ vữa mà không gây tác dụng phụ như các statin Berberin cũng có tác dụng chống co giật, bảo vệ tế bào thần kinh trong tổn thương não do tắc mạch máu não, và có tác dụng chống trầm cảm Tác dụng chống ung thư của berberin cũng được nghiên cứu, với khả năng chống oxy hóa trên một số loại khối u, đồng thời tăng cường hiệu quả hóa trị liệu và xạ trị Gần đây, liposome BBR cũng được nghiên cứu để điều trị bệnh.

Leishmania ở trẻ sơ sinh có thể gây ra những biến chứng nghiêm trọng, vì vậy việc ngăn chặn sự chuyển hóa nhanh chóng của BBR tại gan là rất quan trọng Điều này giúp cải thiện khả năng phân phối thuốc một cách chọn lọc đến các cơ quan bị nhiễm bệnh leishmania nội tạng, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị Đặc tính dược động học của thuốc cần được nghiên cứu kỹ lưỡng để đảm bảo tính an toàn và hiệu quả trong việc điều trị bệnh leishmania ở trẻ sơ sinh.

Quá trình hấp thu thuốc chủ yếu diễn ra ở ruột non, và một số nghiên cứu chỉ ra rằng sinh khả dụng của berberin khi sử dụng đường uống ở người tình nguyện khỏe mạnh là tương đối thấp, dưới 5%.

 Berberin dễ dàng liên kết với protein huyết tương ảnh hưởng đến phân bố và hoạt động của thuốc [45]

 Berberin chuyển hóa qua gan và thải trừ qua mật Một số nghiên cứu khác cho thấy thuốc có thể bị thải trừ qua thận [49]

Một số chế phẩm berberin trên thị trường

Bảng 1.1 Một số chế phẩm berberin trên thị trường

Biệt dược Dạng bào chế/hàm lượng Công dụng Nhà sản xuất

Viên nén chứa cao khô berberis aristata 588 mg (berberin clorid

Giảm cholesterol và triglyceride máu, ngăn ngừa xơ vữa động mạch

Berberal Viên bao đường/10mg Trị tiêu chảy Công ty cổ phần

Antesik Viên nang/50mg Trị tiêu chảy

Công ty cổ phần Dược TW MEDIPLANTEX

Loberin Viên nén bao phim/25mg Trị tiêu chảy

Công ty cổ phần Dược phẩm Nam

Đại cương về proliposome

Proliposome là các hạt khô, trơn chảy tốt, khi phân tán vào nước tạo hỗn dịch liposome đa lớp

Proliposome được hình thành từ các phân tử phospholipid có cấu trúc đầu ưa nước và đuôi kị nước Khi được hydrat hóa trong môi trường nước, các phân tử này tự sắp xếp thành các lớp lipid kép, trong đó dược chất ưa nước nằm trong khoang ưa nước, còn dược chất kị nước được bao bọc trong các lớp lipid.

Hình 1.2 Cấu trúc của liposome

Phospholipid là thành phần chính của proliposome, với cấu trúc gồm đầu thân nước và đuôi acid béo kị nước, cho phép chúng tự tạo thành lớp màng kép trong môi trường nước Có nhiều loại phospholipid khác nhau.

Phosphatidylcholin (PC), hay còn gọi là lecithin, là loại phospholipid phổ biến nhất, thường có mặt trong lòng đỏ trứng và đậu nành, cũng như một lượng nhỏ trong tim bò và tủy sống PC có cấu trúc với đầu phân cực thân nước là phosphocholin, đóng vai trò quan trọng trong nhiều chức năng sinh học.

PC thường được sử dụng trong các sản phẩm nhờ vào tính chất rẻ tiền và trơ về mặt hóa học Nó có cấu trúc với hai đuôi hydrocarbon là oleoyl và palmitoyl, được liên kết với nhau thông qua cầu glycerin.

PC tự nhiên là hỗn hợp các phospholipid với độ dài chuỗi và mức độ không bão hòa khác nhau Sự hiện diện của các chuỗi acid béo chưa bão hòa khiến lipid trở nên không ổn định, vì vậy lipid bão hòa thường được ưa chuộng hơn lipid chưa bão hòa.

Ngoài ra còn có phosphatidyl ethanolamin (PE), phosphatidyl serin (PS), phosphatidyl glycerol (PG), phosphatidyl inositol (PI),

Synthetic phospholipids such as distearoyl phosphatidylcholine (DSPC), dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), dioleyl phosphatidylethanolamine (DOPE), distearoyl phosphatidylethanolamine (DSPE), dipalmitoyl phosphatidylglycerin (DPPG), and distearoyl phosphatidylglycerol (DSPG) are commonly used Additionally, other lipids like sphingomyelin (SM) can also be utilized.

Mặc dù có nhiều loại phospholipid, việc sản xuất proliposome chủ yếu chỉ sử dụng PC và PG do các yếu tố như độc tính, độ tinh khiết, ổn định và chi phí.

Bảng 1.2 Một số lipid được sử dụng bào chế proliposome

Hình 1.3 Cấu trúc lớp màng phospholipid kép [6]

Liposome chỉ chứa phospholipid thường không đủ cứng, dẫn đến việc rò rỉ thuốc bao gói Cholesterol, một steroid quan trọng, đóng vai trò cải thiện độ cứng của màng lipid kép, giảm tính thấm nước và nâng cao tính ổn định của lớp màng kép khi tiếp xúc với các chất lỏng sinh học như máu và huyết tương.

[37] Nếu không có cholesterol thì lớp phospholipid dễ tương tác với protein huyết tương như albumin, transferin, macroglobulin dẫn tới giảm độ ổn định của liposome

Hình thái và tính ổn định của liposome chịu ảnh hưởng lớn từ nồng độ phospholipid và cholesterol; bất kỳ sự thay đổi nào trong thành phần này đều có thể gây ra sự phá vỡ cấu trúc túi và rò rỉ thuốc.

Cholesterol có khả năng kết hợp với phospholipid với tỷ lệ mol 1:1, nhưng trong màng tự nhiên, tỷ lệ này dao động từ 0,1-1 tùy thuộc vào vị trí giải phẫu và loại tế bào Tuy nhiên, nếu tỷ lệ cholesterol quá cao, nó có thể ảnh hưởng tiêu cực đến sự bền vững của màng.

Vitamin E đóng vai trò quan trọng trong công thức liposome, hoạt động như một chất ổn định màng phospholipid kép, giúp giảm quá trình oxy hóa lipid và duy trì tính thấm của lớp màng Sự hiện diện của vitamin E không chỉ kéo dài thời gian bảo quản mà còn làm giảm tốc độ thanh thải dược chất khỏi máu, tăng cường nồng độ trong máu và hạn chế sự hấp thu của gan so với liposome không chứa vitamin E.

Chất mang được lựa chọn cần có diện tích bề mặt lớn và độ xốp cao để lipid phân bố đều hiệu quả Một số chất mang phổ biến bao gồm maltodextrin, sorbitol, cellulose vi tinh thể, magie nhôm silicat và mannitol.

Phương pháp bào chế proliposome

1.2.3.1 Các phương pháp bào chế proliposome [51]

Hiện nay có nhiều phương pháp bào chế proliposome gồm:

 Phương pháp tráng film trên bề mặt chất mang (film deposition on carrier method)

 Phương pháp phun sấy (spray drying method)

 Phương pháp đối kháng dung môi siêu tới hạn (supercritical anti-solvent method)

 Phương pháp bao hạt (fluidised bed method)

1.2.3.2 Phương pháp tráng film trên bề mặt chất mang Đây là phương pháp đầu tiên để bào chế proliposome được báo cáo bởi Payne và cộng sự [47] Trong phương pháp này, lớp màng phospholipid được phủ trên bề mặt một nguyên liệu xốp gọi là chất mang Một số chất mang được sử dụng là: maltodextrin, sorbitol, mannitol, sucrose, Thiết bị sử dụng là máy cất quay chân không Trong hình 1.4, dược chất và phospholipid

Mười được hòa tan trong dung môi hữu cơ dễ bay hơi và được dẫn vào bình cất quay chân không chứa chất mang Cần tránh làm ướt chất mang quá mức trong quá trình tiêm dung dịch từng giọt Dung dịch tiếp tục được đưa qua ống khi bột trong bình chảy tự do Sau khi loại bỏ dung môi, khối bột được rây và bảo quản ở nhiệt độ thích hợp.

Quy trình bào chế proliposome bằng phương pháp tráng film trên bề mặt chất mang gặp khó khăn trong việc kiểm soát do việc bổ sung và bay hơi dung môi không liên tục Để cải thiện, Xu và cộng sự đã điều chỉnh quy trình bằng cách phân tán chất mang trong dung dịch thuốc và lipid trong bình cất quay, đồng thời thực hiện bay hơi dung môi dưới chân không Phương pháp mới này giúp lipid được phân bố đồng đều và hiệu quả hơn, đồng thời quy trình trở nên liên tục và tiết kiệm thời gian Trong quá trình bào chế, việc lựa chọn và kiểm soát nhiệt độ cất quay là rất quan trọng, cần dựa vào nhiệt độ nóng chảy của phospholipid, tính chất của chất mang và dung môi để tránh hiện tượng kết dính các hạt proliposome.

11 Ưu, nhược điểm của proliposome

Prolipome sau khi hydrat hóa với nước tạo hỗn dịch liposome, vì vậy proliposome có những ưu điểm của liposome [5], [16], [58] :

 Tăng độ tan của dược chất khó tan, do đó tăng sinh khả dụng của thuốc

Đánh giá một số đặc tính của proliposome

Cấu trúc bề mặt của proliposome

Proliposome được phân tích cấu trúc và hình thái bề mặt thông qua phương pháp chụp SEM (kính hiển vi điện tử quét) Kỹ thuật này cho phép xác định hình thái bề mặt của proliposome, giúp quan sát sự thay đổi hình dạng của chất mang sau khi được phủ lipid.

Xiao Yan-yu và các cộng sự đã nghiên cứu bề mặt bột proliposome silymarin so với bề mặt chất mang manitol Kết quả cho thấy manitol có dạng tinh thể, trong khi ở proliposome silymarin, phospholipid đã bám vào bề mặt manitol, khiến cho hình ảnh tinh thể manitol trở nên khó quan sát.

Trong nghiên cứu của Karn và cộng sự, kính hiển vi điện tử quét (SEM) được sử dụng để khảo sát hình thái bề mặt của proliposome cyclosporin và lactose khan Kết quả cho thấy, ở proliposome cyclosporin, dạng tinh thể của lactose khan khó quan sát do sự lắng đọng của phospholipid trên bề mặt Lớp màng lipid mỏng bao phủ các hạt lactose giúp đảm bảo sự hydrat hóa hoàn toàn của phospholipid, từ đó dẫn đến sự phân tán liposome khi tiếp xúc với môi trường.

Xác định kích thước tiểu phân liposome thu được sau khi hydrat hóa proliposome và hiệu suất liposome hóa

Xiao Yan-yu và cộng sự đã nghiên cứu kích thước của liposome silymarin bằng cách trộn 2 mg proliposome silymarin với 1 ml nước cất và khuấy bằng tay trong 2 phút Kích thước liposome được phân tích và đặc trưng hóa thông qua máy phân tích kích thước hạt laser H-3000 của Malvern, Anh.

Hiệu suất liposome hóa EE (%) của silymarin trong liposome được xác định bằng cỏch lọc hỗn dịch liposome silymarin sử dụng màng 0,45 àm

16 cellulose nitrat Hiệu suất liposome hóa (%) của silymarin trong liposome là tỉ lệ lượng silymarin trong liposome sau khi lọc (B) và trước khi lọc (A) và tính bằng biểu thức (B/A) ×100% [65]

Arregui và cộng sự đã xác định kích thước liposome daptomycin sau khi hydrat hóa proliposome bằng máy Malvern Zetasizer ZS90, với kích thước hạt trung bình đạt 520 ± 34 nm Hiệu suất liposome hóa của daptomycin được đánh giá qua quy trình ly tâm Nanosepđ, với các mẫu được ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 10 phút tại 5°C Hàm lượng dược chất tự do được hòa tan và phân tích bằng phương pháp HPLC Độ trơn chảy của proliposome ảnh hưởng đến khả năng phân phối vào các dạng thuốc rắn, quyết định sự đồng nhất về hàm lượng và khối lượng dược chất, rất quan trọng trong bào chế thuốc nang và viên nén.

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá độ trơn chảy của proliposome BBR, nhằm sử dụng làm nguyên liệu cho dạng thuốc rắn Đặc biệt, Khan và cộng sự đã tiến hành đánh giá độ trơn chảy của sorbitol và proliposome beclometasone dipropionat thông qua các thông số như chỉ số nén và tỷ số.

Hausner đã nghiên cứu ảnh hưởng của lipid và dược chất đến độ trơn chảy của sorbitol, từ đó làm cơ sở cho việc khảo sát công thức bào chế proliposome, phục vụ cho việc sản xuất viên nén beclometasone dipropionat.

Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về proliposome

Trần Thị Hải Yến và cộng sự đã nghiên cứu bào chế proliposome berberin bằng phương pháp tráng film trên bề mặt chất mang, với tỉ lệ mol HSPC: cholesterol: berberin là 9:1:6, sử dụng sorbitol làm chất mang với khối lượng gấp 10 lần lipid Proliposome thu được có dạng bột màu vàng, khô tơi và có khả năng hydrat hóa trong nước thành liposome berberin với kích thước tiểu phân trung bình khoảng 8,83 μm, trong đó lượng dược chất đạt 2,23% Phân tích nhiệt vi sai cho thấy berberin đã được phân tán dưới dạng phân tử trong proliposome.

Nghiên cứu của Xiao Yan-yu và cộng sự đã phát triển proliposome silymarin nhằm nâng cao sinh khả dụng đường uống cho silymarin trên chó Proliposome được chế tạo bằng phương pháp tráng film trên chất mang manitol, sử dụng methanol và cloroform làm dung môi, với hàm lượng silymarin đạt 9,73% Proliposome silymarin hoàn toàn hòa tan trong 20 phút ở pH 1,2 và 6,8 Sau khi hydrat hóa, liposome silymarin có kích thước trung bình 196,4 nm và hiệu suất liposome hóa đạt 92,56%, ổn định sau 3 tháng bảo quản ở 40°C Thông số dược động học cho thấy Tmax của cả hai dạng đều là 30 phút.

Proliposome silymarin đã cho thấy sự ổn định và khả năng tăng cường hấp thu silymarin qua đường tiêu hóa, với các chỉ số Cmax lần lượt là 472,62 và 89,78 ng/ml, cùng AUC là 2606,21 và 697 ng/ml/h.

Trong một nghiên cứu của Vandana Gupta và cộng sự, proliposome aceclofenac đã được bào chế nhằm phân phối thuốc qua da, giúp loại bỏ các tác dụng phụ liên quan đến đường tiêu hóa Phương pháp bào chế sử dụng tráng film trên bề mặt chất mang manitol, kết hợp với hỗn hợp dung môi methanol và cloroform, thực hiện ở nhiệt độ 60-70°C với tốc độ cất thích hợp.

18 quay 80-90 vòng/phút Hàm lượng aceclofenac trong proliposomes trong khoảng 95,7% đến 98,5% Liposome aceclofenac sau khi hydrat hóa có KTTP trung bình khoảng 200 nm, hiệu suất liposome hóa đạt 80,31% [24]

Bobbala và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế proliposome isradipin nhằm nâng cao sinh khả dụng đường uống Proliposome được tạo ra bằng phương pháp tráng film trên bề mặt chất mang manitol, với tỷ lệ HSPC:cholesterol là 1:1, sử dụng hỗn hợp dung môi methanol và cloroform theo tỷ lệ 1:1 ở nhiệt độ 45°C Sau khi hydrat hóa, liposome có kích thước trung bình khoảng 280 nm và đạt hiệu suất liposome hóa 97% Đặc biệt, sự giải phóng của isradipin từ proliposome cao gấp 3-3,5 lần so với dạng isradipin thông thường.

Nghiên cứu của Velpula A và cộng sự đã thành công trong việc bào chế proliposome raloxifene hydrochloride bằng phương pháp tráng film trên bề mặt chất mang, với mục tiêu nâng cao khả năng hấp thu thuốc tại ruột và tăng sinh khả dụng đường uống Kết quả dược động học in vivo trên chuột cho thấy tốc độ và mức độ hấp thu raloxifene hydrochloride tăng gấp ba lần khi sử dụng công thức proliposome tích điện dương, chứng minh tiềm năng của proliposome và vai trò quan trọng của điện tích dương trong việc cải thiện hấp thu raloxifene hydrochloride qua đường tiêu hóa.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu

Bảng 2.1 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

1 Berberin base (98%) Việt Nam Tiêu chuẩn cơ sở

2 Vitamin E CISME - Italia Nhà sản xuất

3 Lecithin đậu nành Trung Quốc Nhà sản xuất

4 Sorbitol Trung Quốc Nhà sản xuất

5 Cloroform Trung Quốc Nhà sản xuất

6 Methanol Trung Quốc Nhà sản xuất

7 Ethanol 96% Công ty HC Đức Giang-

8 Ethanol tuyệt đối Công ty HC Đức Giang

9 Nước tinh khiết Việt Nam DĐVN V

 Máy cất quay Rovapor R- 210, Buchi- Đức

 Máy đo kích thước tiểu phân Mastersizer 3000E, Zetasizer nano ZS90

 Bể siêu âm Ultrasonic LC 60H, máy khuấy từ (IKA RH basic 1, Đức)

 Tủ sấy chân không Daiban Labtech, Hàn Quốc

 Cân phân tích Satorius AG Gottingen- Đức

 Cân phân tích độ ẩm MB25 Ohaus - Mỹ

 Tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ thuật, nhiệt kế, các dụng cụ thủy tinh

 Máy quang phổ UV- VIS U-1800 (Hatachi - Nhật Bản)

 Máy phân tích nhiệt vi sai DSC 131 (Setaram – Pháp)

 Kính hiển vi điện tử quét SEM S-4800 (Hitachi, Nhật Bản)

 Tủ vi khí hậu KBF P 240 (Binder – Đức)

 Máy đo tỷ trọng biểu kiến bột Erweka SVM – Đức

 Các dụng cụ phân tích khác đạt tiêu chuẩn thí nghiệm.

Nội dung nghiên cứu

 Xây dựng được công thức và quy trình bào chế proliposome BBR bằng phương pháp tráng film trên bề mặt chất mang sử dụng lecithin đậu nành

 Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) của proliposome BBR

 Đánh giá độ ổn định của proliposome BBR.

Phương pháp nghiên cứu

Bào chế proliposome berberin bằng phương pháp tráng film trên bề mặt chất mang

 Thành phần proliposome BBR: Berberin base, lecithin, vitamin E, sorbitol, tỷ lệ thể tích giữa methanol và cloroform là 1:1

 Chuẩn bị dung dịch chứa phospholipid, vitamin E và BBR:

+ Cân phospholipid, vitamin E theo tỉ lệ mol, hòa tan trong một thể tích chloroform thích hợp được dung dịch (1)

+ Cân BBR, hòa tan trong một thể tích MeOH thích hợp, siêu âm 10 phút thu được dung dịch (2)

Phối hợp dung dịch (1) và dung dịch (2) thu được dung dịch đồng nhất

 Chuẩn bị chất mang: Chất mang được nghiền, rõy qua rõy 600 àm, sau đó được sấy khô ở 60°C trong tủ sấy tĩnh

Chất mang được chuyển vào bình cầu và kết hợp với dung dịch để tạo thành hỗn dịch chất mang Bình cầu được kết nối với máy cất quay Rovapor R-210, nơi dung môi hữu cơ được loại bỏ dưới áp suất -0,05 MPa và nhiệt độ 45°C với tốc độ cất quay 50 vòng/phút Sau khi loại bỏ dung môi, sản phẩm được đưa vào tủ sấy chân không ở 40°C trong 24 giờ để đảm bảo khô Cuối cùng, proliposome BBR được rây qua lưới 1 mm và bảo quản trong lọ thủy tinh đậy nắp cao su, bọc màng parafilm, ở nhiệt độ phòng.

Phương pháp hydrat hóa proliposome BBR

Để tạo ra hỗn dịch liposome BBR, cân 5 mg proliposome BBR và thêm 50 ml nước ở nhiệt độ 37°C Sau đó, sử dụng máy vortex xoáy trong 2 phút và siêu âm trong 10 phút.

Phương pháp đánh giá proliposome berberin

2.3.3.1 Đánh giá hình thức

2.3.3.2 Phương pháp đánh giá hình thái

Hình thái của proliposome BBR được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét SEM và kính hiển vi quang học

 Proliposome BBR được làm khô bằng tủ sấy chân không và được đánh giá hình thái bằng kính hiển vi điện tử quét SEM

Để tiến hành thí nghiệm, đưa mẫu vào giá đo và phủ một lớp platin nhằm tăng cường độ dẫn điện Sau đó, mẫu được đưa vào buồng chứa để đánh giá hình thái của proliposome ở nhiệt độ 25˚C với điện áp 10000V.

Proliposome BBR và nguyên liệu BBR đã được quan sát đặc điểm hình thái bằng kính hiển vi quang học Để thực hiện, một lượng mẫu thích hợp được cho lên lam kính và dàn mỏng khối bột Sau đó, lam kính được đặt lên bàn mẫu của kính hiển vi, và điều chỉnh ốc đại cấp, ốc vi ấp cũng như ánh sáng cho đến khi hình thái của mẫu hiện rõ trên vi trường, từ đó tiến hành quan sát hình thái mẫu.

2.3.3.3 Phân tích nhiệt vi sai (DSC)

Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá các thông số nhiệt quan trọng của mẫu phân tích, bao gồm nhiệt độ chuyển pha (Tg) và nhiệt độ nóng chảy (Tm), thông qua việc sử dụng phổ nhiệt quét vi sai.

 Thiết bị: Máy phân tích nhiệt vi sai DSC 131 Setaram – Pháp

 Các mẫu đo: Phospholipid, sorbitol, BBR, proliposome BBR

Để tiến hành thí nghiệm, cân khoảng 5 - 10 mg mẫu và cho vào đĩa nhôm, sau đó hàn kín Mẫu trắng sử dụng là đĩa nhôm trống cũng được hàn kín Nhiệt độ đo được thiết lập trong khoảng từ 30°C đến 250°C, với tốc độ gia nhiệt là 10°C/phút và lưu lượng khí nitơ là 50 ml/phút.

2.3.3.4 Phương pháp xác định hàm lượng berberin trong proliposome BBR a Phương pháp xây dựng đường chuẩn định lượng berberin bằng quang phổ hấp thụ UV- VIS

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, cân chính xác khoảng 10 mg BBR base và hòa tan trong ethanol tuyệt đối, sau đó siêu âm trong 15 phút để BBR tan hoàn toàn Tiếp theo, định mức dung dịch bằng ethanol tuyệt đối đến 10 ml để thu được dung dịch A Cuối cùng, hút 1 ml dung dịch A cho vào bình định mức 50 ml và định mức tới vạch bằng ethanol tuyệt đối để tạo ra dung dịch chuẩn gốc.

Pha chế các dung dịch BBR với nồng độ 0,004; 0,006; 0,008; 0,010; và 0,012 mg/ml bằng ethanol 96% Tiến hành quét phổ dung dịch BBR base có nồng độ 0,008 mg/ml để xác định bước sóng hấp thụ cực đại.

23 đại Lần lượt đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn, mẫu trắng là ethanol

96% và xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ BBR bằng phương pháp đo quang phổ UV-VIS ở bước sóng λ max

= 350nm b Phương pháp xác định hàm lượng berberin trong proliposome BBR

 Cân chính xác một lượng proliposome BBR đem hydrat hóa với nước theo phương pháp ở mục 2.3.2 thu được hỗn dịch liposome BBR

Để tiến hành thử nghiệm, hút chính xác 1 ml của hỗn dịch liposome BBR và phá vỡ cấu trúc liposome bằng ethanol tuyệt đối trong bình định mức 10 ml Sau đó, tiến hành pha loãng hỗn hợp bằng ethanol 96%.

Mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách hút chính xác 1 ml hỗn dịch liposome trắng và phá vỡ cấu trúc bằng ethanol tuyệt đối trong bình định mức 10 ml, sau đó pha loãng bằng ethanol 96% Đo quang các mẫu được thực hiện bằng phương pháp quang phổ UV-VIS ở bước sóng hấp thụ cực đại 350 nm Nồng độ BBR trong mẫu thử được xác định dựa vào đường chuẩn.

 Hàm lượng BBR trong proliposome BBR được tính theo công thức:

HLDC% = Ct K Vt m Trong đó:

Ct : nồng độ BBR trong mẫu thử

K : hệ số pha loãng của mẫu thử

Vt : Thể tích hỗn dịch liposome BBR sau khi hydrat hóa m: khối lượng proliposome BBR đem hydrat hóa

2.3.3.5 Xác định khả năng chảy của proliposome BBR qua chỉ số nén và tỷ số Hausner a Xác định khối lượng riêng thô (V0)

 Cách xác định: đo thể tích bằng ống đong

 Dụng cụ: ống đong thể tích 50 ml có độ chia nhỏ nhất 0,5 ml [32], [31]

Để tiến hành thí nghiệm, trước tiên cân chính xác 15 g proliposome BBR và chuyển nhẹ nhàng vào một ống đong khô mà không làm dồn nén Sau đó, cẩn thận san bằng mặt và đọc thể tích biểu kiến (V0) tại vạch chia độ gần nhất trên ống đong Tính khối lượng riêng thô theo công thức m/V0, và lặp lại phép đo này 3 lần để đảm bảo độ chính xác.

[2], [32] b Xác định khối lượng riêng gõ

 Thiết bị: Máy đo tỷ trọng bột Erweka SVM – Đức

Để xác định thể tích gõ, đầu tiên cần xác định thể tích biểu kiến (V0) và lắp chặt ống đong vào giá đỡ Tiến hành gõ mẫu 10, 500 và 1250 lần, sau đó đọc các thể tích tương ứng V10, V500, và V1250 tại vạch chia gần nhất Nếu V10 và V1250 chênh lệch không quá 0,5 ml, thì V1250 được coi là thể tích gõ Ngược lại, nếu V500 và V1250 chênh lệch hơn 0,5 ml, tiếp tục gõ cho đến khi chênh lệch giữa hai lần đo liên tiếp nhỏ hơn 0,5 ml Cuối cùng, đọc thể tích gõ (Vf) chính xác đến 1 ml và tính khối lượng riêng gõ ra (g/ml) theo công thức m/Vf Lặp lại phép đo này 3 lần để đảm bảo độ chính xác Đồng thời, xác định chỉ số nén và tỷ số Hausner.

Sau khi xác định được các giá trị V0 , Vf , tiến hành xác định chỉ số nén và tỷ số Hausner [2]

Dựa vào chỉ số nén và tỷ số Hausner để đánh giá khả năng trơn chảy của proliposome BBR

2.3.3.6 Xác định mất khối lượng do làm khô

Sau khi sấy proliposome BBR trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 40C, sản phẩm được để nguội trong bình hút ẩm Độ ẩm của proliposome BBR được xác định bằng cân phân tích độ ẩm MB25 Ohaus của Mỹ.

2.3.3.7 Đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro

 Chuẩn bị: dung dịch HCl (pH = 1,2), dung dịch đệm phosphat (pH = 6,8)

 Thiết bị: Máy khuấy từ gia nhiệt

Tiến hành thí nghiệm, một lượng proliposome BBR tương đương 20 mg BBR và 10 ml môi trường được nạp vào túi thẩm tích (MWCO 14000 Da), được cố định bằng hai nút thắt ở mỗi đầu Túi thẩm tích sau đó được nhúng vào 190 ml môi trường giải phóng (pH = 1,2; 6,8) và khuấy ở 37 ± 0,5C với tốc độ 50 vòng/phút Tại các thời điểm 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 8 giờ, 12 giờ và 24 giờ, 1 ml mẫu được rút ra và lọc qua màng lọc cellulose nitrat 0,45 µm, đồng thời bổ sung 1 ml dung dịch đệm tương ứng vào cốc Hàm lượng Berberin giải phóng được định lượng bằng phương pháp UV-Vis.

Phương pháp đánh giá liposome BBR sau hydrat hóa

2.3.4.2 Đánh giá kích thước tiểu phân liposome BBR a Sử dụng máy phân tích kích thước Mastersizer 3000E (Tán xạ laser)

 Dải kớch thước đo: 0,1 àm đến 1000 àm

 Mục đích: đánh giá kích thước tiểu phân liposome BBR hình thành sau khi hydrat hóa với nước qua các thông số D[4,3], D[90], D[50], Span

Để tiến hành thí nghiệm, đầu tiên cho khoảng 400 ml nước cất vào cốc có mỏ 500 ml và đặt cốc vào máy đo Mastersizer 3000E Sau đó, từ từ thêm mẫu đã được hydrat hóa theo phương pháp đã mô tả cho đến khi độ đục đạt khoảng 0,5 - 5%.

D[4,3]: KTTP trung bình theo thể tích

D[90]: 90% tiểu phân có kích thước dưới D[90]

D[50]: 50% tiểu phân có kích thước dưới D[50]

Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft office excel

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Xây dựng phương pháp định lượng BBR bằng quang phổ UV-Vis 29 3.2 Xây dựng công thức proliposome BBR

Quá trình xác định phổ dung dịch berberin base chuẩn với nồng độ 9,58 (µg/ml) cho thấy cực đại hấp thụ đạt 0,669 tại bước sóng λ max = 350 nm Hình ảnh của phổ hấp thụ được trình bày chi tiết trong phụ lục 1.

Bào chế proliposome BBR được thực hiện với tỉ lệ mol BBR : VitE : Lecithin là 9:1:9, trong khi proliposome trắng có tỉ lệ là 0:1:9 Tỷ lệ khối lượng các thành phần so với chất mang sorbitol là 1:5 Quá trình hydrat hóa proliposome BBR theo phương pháp đã nêu trong mục 2.3.2 cho ra sản phẩm là hỗn dịch liposome BBR.

Quột phổ UV của mẫu thử có nồng độ 10,44 (àg/ml) cho thấy cực đại hấp thụ 0,728 tại bước sóng λ max = 350 nm, với hình ảnh phổ hấp thụ được trình bày trong phụ lục 2 Để định lượng hàm lượng BBR trong proliposome BBR, mẫu trắng là liposome trắng được pha loãng tương tự như mẫu thử và ethanol 96%, kết quả được thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3.1 Mật độ quang của hỗn dịch liposome BBR với mẫu trắng là liposome trắng và ethanol 96% ở bước sóng 350 nm (trung bình ± SD, n=3)

Mẫu trắng Kết quả đo quang

Kết luận: Ethanol 96% có thể được sử dụng để thay thế liposome trắng làm mẫu trắng trong việc xác định hàm lượng BBR có trong proliposome BBR thông qua phương pháp đo quang phổ UV – Vis.

Xây dựng đường chuẩn định lượng berberin

 Đo mật độ quang của các dung dịch berberin base ở bước sóng 350 nm Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 dưới đây

Bảng 3.2 Mật độ quang của các dung dịch berberin base

Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự tương quan tuyến tính rõ rệt giữa mật độ quang và nồng độ berberin base trong khoảng nồng độ từ 0,004 đến 0,012 mg/ml, với hệ số xác định R² đạt 0,9999, cho thấy mối liên hệ mạnh mẽ giữa hai yếu tố này Phương trình hồi quy được xác định là y = 68,65x + 0,0116, cho phép áp dụng phương pháp đo quang để định lượng và xác định hàm lượng của BBR trong khoảng nồng độ khảo sát.

3.2 Xây dựng công thức proliposome BBR

Khảo sát tỷ lệ mol BBR : Lecithin

Tiến hành bào chế proliposome BBR theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.3.1, với tỷ lệ mol BBR và lecithin như trong bảng 3.3 Khối lượng chất mang sorbitol được sử dụng gấp 10 lần tổng khối lượng của BBR và lecithin Mỗi mẫu chứa 110 mg lecithin, cùng với thể tích methanol và chloroform là 3 ml.

Hydrat hóa proliposome BBR được thực hiện theo phương pháp ở mục 2.3.2 Hiệu suất liposome hóa và hàm lượng dược chất trong proliposome BBR được đánh giá theo phương pháp ở mục 2.3.4.3 và 2.3.3.4 Kích thước tiểu phân của các mẫu được đo theo phương pháp ở mục 2.3.4.2 Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.3 dưới đây.

Bảng 3.3.Ảnh hưởng của tỷ lệ mol BBR, lecithin đến một số đặc tính của liposome BBR (trung bình ± SD, n=3).

:Le EE% HLDC% KTTP Span PDI

Hình 3.2 Liposome BBR sau khi hydrat hóa proliposome BBR với các tỷ lệ mol dược chất:lecithin khác nhau

Proliposome BBR được tạo ra từ các mẫu có màu vàng, khô và tơi Sau khi hydrat hóa, hỗn dịch liposome BBR ở các mẫu M1, M2 và M4 có màu vàng đục, không lắng cặn và không nhìn thấy tiểu phân bằng mắt thường Trong khi đó, hỗn dịch liposome BBR ở mẫu M3 có màu vàng trong suốt.

Kết quả từ bảng 3.3 cho thấy các mẫu liposome BBR M1, M2 và M4 đều có Span nhỏ hơn 2,5, trong khi mẫu M3 có PDI dưới 0,5, chứng tỏ rằng chúng có kích thước phân bố tương đối hẹp Đặc biệt, mẫu M3 cho thấy kích thước phân bố ở dải nanomet.

Khi hydrat hóa proliposome BBR, berberin base, một dược chất có tính chất thân dầu, sẽ xen kẽ vào các đuôi kị nước của lecithin trong màng phospholipid kép.

Khi tỷ lệ mol BBR:lecithin đạt 8:9, dược chất có đủ vị trí để gắn kết và sắp xếp thành lớp màng bền vững, tạo ra cấu trúc liposome BBR ổn định, từ đó nâng cao hiệu suất liposome hóa BBR Tuy nhiên, khi tỷ lệ mol BBR tăng, dược chất dư thừa sẽ đẩy tách phần đầu thân nước của các phân tử lecithin, dẫn đến sự tích tụ dược chất bên trong.

Sự không che phủ của liposome ảnh hưởng đến độ ổn định của lớp màng, dẫn đến việc dược chất bị rò rỉ và giảm hiệu suất liposome hóa Khi tỷ lệ mol BBR giảm, các vị trí gắn trở nên trống, lớp phospholipid kép trở nên lỏng lẻo, dễ thấm nước, từ đó làm giảm hiệu suất liposome hóa, khả năng nạp dược chất và độ ổn định của liposome.

Trong nghiên cứu này, bào chế proliposome BBR dùng đường uống Liposome BBR sau khi hydrat hóa của mẫu M3 có KTTP trung bình ở mức

Công thức M3 với tỷ lệ mol BBR/Lecithin là 8:9 cho thấy kích thước hạt trung bình nhỏ nhất và hiệu suất entrapment (EE) cao, giúp giảm thanh thải và tăng sinh khả dụng đường uống của proliposome BBR.

63,937% (lớn thứ 2 sau M1) để tiếp tục nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất liposome hóa và tăng khả năng nạp dược chất

Khảo sát tỷ lệ chất mang

Tiến hành bào chế proliposome BBR với tỷ lệ mol BBR : lecithin là 8:9 (công thức M3), điều chỉnh tỷ lệ khối lượng (BBR + lecithin) : chất mang theo bảng 3.4 Mỗi mẫu chứa 110 mg lecithin và 50,5 mg berberin base, với thể tích methanol và chloroform là 3 ml Kết quả đánh giá proliposome BBR và liposome BBR sau khi hydrat hóa được trình bày trong bảng 3.4 dưới đây.

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng sorbitol đến một số đặc tính của proliposome BBR và liposome BBR sau hydrat hóa (trung bình ± SD, n=3)

Chú thích: (-) Không đánh giá hiệu suất liposome hóa và khả năng nạp thuốc vì mẫu M8 không đúng với định nghĩa proliposome

Hình 3.3 Liposome BBR sau khi hydrat hóa proliposome BBR với các tỷ lệ khối lượng chất mang khác nhau

Proliposome BBR được thu được từ các mẫu M3, M5, M6, M7, M9 có đặc điểm màu vàng, khô và tơi xốp Trong khi đó, mẫu M8 tạo thành một khối dẻo, không đáp ứng tiêu chí của proliposome Sau quá trình hydrat hóa, hỗn dịch liposome BBR ở các mẫu (ngoại trừ mẫu M8) có màu vàng trong suốt, không nhìn thấy các tiểu phân bằng mắt thường và không lắng cặn sau thời gian dài, vẫn giữ được hình thức ban đầu.

Hầu hết các mẫu đều có KTTP trung bình < 250 nm và PDI < 0,5 chứng tỏ liposome BBR có KTTP phân bố trong khoảng tương đối hẹp Riêng mẫu

M8, M9 có phân bố KTTP lớn (PDI >0,5), đặc biệt mẫu M8 xuất hiện nhiều tiểu phân có kích thước trên 1000 nm - phù hợp với hình thức hỗn dịch thu được

Đánh giá các đặc tính proliposome BBR ở quy mô 25 g/mẻ

Tiến hành bào chế 3 mẻ proliposome BBR NC01, NC02, NC03 quy mô 25 g/mẻ với công thức và trình tự bào chế như ở mục 3.4

Kết quả đánh giá proliposome BBR và liposome BBR sau khi hydrat hóa được trình bày ở bảng 3.8 dưới đây

Bảng 3.8 Các đặc tính của proliposome BBR và liposome BBR sau khi hydrat hóa ở 3 mẻ (trung bình ± SD, n=3)

Khả năng giải phóng dược chất in vitro

Đánh giá khả năng giải phóng dược chất của ba mẻ NC01, NC02 và NC03 được thực hiện trong môi trường dung dịch HCl (pH=1,2) và dung dịch đệm phosphat (pH=6,8) theo phương pháp đã nêu Kết quả thu được được trình bày trong biểu đồ hình 3.10.

Biểu đồ trong hình 3.8 cho thấy mức độ giải phóng dược chất ở hai môi trường pH khác nhau Cụ thể, ở môi trường pH 1,2, sau 2 giờ, dược chất được giải phóng đạt 30 - 40% Trong khi đó, ở môi trường pH 6,8, sau 4 giờ, tỷ lệ giải phóng dược chất đạt ≥ 75%.

Giả i phóng tí ch lũy (% )

3.5 Đề xuất tiêu chuẩn chất lượng của proliposome BBR

Từ các khảo sát ở mục 3.4, đề xuất tiêu chuẩn của proliposome BBR như sau:

Tiêu chuẩn Giới hạn chấp nhận

1 Hình thức Dạng hạt khô tơi, có màu vàng

4 Khối lượng riêng thô 0,6 – 0,7 g/ml

6 Khả năng giải phóng dược chất in vitro pH 1,2 Sau 2 giờ dược chất giải phóng

30 - 40% pH 6,8 Sau 4 giờ dược chất giải phóng

3.6 Độ ổn định proliposome BBR trong các điều kiện bảo quản

Để đánh giá độ ổn định của proliposome sau 1 tháng bảo quản, phương pháp tại mục 2.3.5 đã được thực hiện với hai loại bao bì: túi nhôm và túi PE hai lớp Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm và điều kiện lão hóa cấp tốc ở nhiệt độ 40 oC ±2, 75% ±5 trong tủ vi khí hậu KBF P 240 (Binder – Đức).

Bảo quản trong điều kiện phòng thí nghiệm

Sau một tháng bảo quản, proliposome BBR vẫn duy trì các đặc điểm ban đầu với dạng hạt khô tơi và màu vàng Liposome BBR sau khi được hydrat hóa có màu vàng trong suốt, không lắng cặn và không có tiểu phân nào nhìn thấy bằng mắt thường.

Hình 3.9 Proliposome BBR sau khi bảo quản 1 tháng ở điều kiện phòng thí nghiệm

Bảng 3.9 Đánh giá các đặc tính của proliposome BBR bảo quản ở điều kiện phòng thí nghiệm (trung bình ± SD, n=3)

Kết quả từ bảng 3.9 cho thấy, sau 1 tháng bảo quản trong điều kiện phòng thí nghiệm, proliposome BBR trong túi nhôm có các chỉ số đặc tính không thay đổi đáng kể so với ban đầu Trong khi đó, proliposome BBR được bảo quản trong 2 lớp túi PE lại ghi nhận sự gia tăng độ ẩm, chỉ số nén, kích thước phần tử (KTTP), và chỉ số phân bố kích thước (PDI), nhưng hiệu suất liposome hóa lại giảm so với mức ban đầu.

Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện mức độ giải phóng dược chất ở môi trường pH 1,2 và 6,8 sau khi bảo quản 1 tháng ở điều kiện phòng thí nghiệm

Từ hình 3.10 thấy ở cả bao bì túi nhôm và túi PE, trong môi trường pH 1,2 sau 2 giờ dược chất giải phóng 30 – 40%; trong môi trường pH 6,8 dược chất giải phóng  75%

Bảo quản trong điều kiện lão hóa cấp tốc

Hình thức proliposome BBR trong túi nhôm vẫn giữ nguyên, trong khi túi PE cho thấy hiện tượng ẩm và màu vàng đậm hơn Sau khi hydrat hóa, liposome BBR có màu vàng trong, không lắng cặn và không có tiểu phân lớn có thể nhìn thấy bằng mắt thường.

Hình 3.11 Liposome BBR sau hydrat hóa proliposome BBR ở thời điểm 1 tháng sau bảo quản trong điều kiện lão hóa cấp tốc

KTTP d.nm PDI Độ ẩm

KLR thô g/ml Ban đầu

Bảng 3.10 Các đặc tính của proliposome BBR khi bảo quản ở điều kiện lão hóa cấp tốc (trung bình ± SD, n=3)

Kết quả từ bảng 3.10 cho thấy, sau 1 tháng bảo quản trong điều kiện lão hóa cấp tốc, proliposome BBR trong cả hai loại bao bì đều có sự gia tăng về các chỉ số KTTP, PDI, độ ẩm và chỉ số nén, trong khi hiệu suất liposome hóa và hàm lượng dược chất trong proliposome BBR giảm Sự thay đổi đáng chú ý nhất diễn ra ở bao bì dạng túi hai lớp.

Hình 3.12 Biểu đồ thể hiện mức độ giải phóng dược chất ở môi trường pH 1,2 và 6,8 sau khi bảo quản 1 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc

Từ hình 3.12 thấy ở bao bì túi nhôm trong môi trường pH 1,2 sau 2 giờ dược chất giải phóng 30 – 40%, trong môi trường pH 6,8 dược chất giải phóng 

75%; ở bao bì 2 lần trong môi trường pH 1,2 sau 2 giờ dược chất giải phóng > 40%, trong môi trường pH 6,8 dược chất giải phóng  80%

3.7 Đánh giá một số đặc tính khác của proliposome BBR

3.7.1.1 Hình thái proliposome BBR quan sát bằng kính hiển vi quang học

Hình 3.13 trình bày đặc điểm của các mẫu khi được quan sát bằng kính hiển vi quang học Cụ thể, bột berberin nguyên liệu được quan sát với vật kính 40x và thị kính 10x, trong khi sorbitol nguyên liệu và proliposome BBR được quan sát với cả vật kính và thị kính 10x.

Hình ảnh dưới kính hiển vi cho thấy bột berberin có hình dạng tinh thể hộp chữ nhật và tinh thể hình kim, trong khi sorbitol xuất hiện dưới dạng các hạt đa giác Proliposome BBR có hình dạng tương tự như các hạt sorbitol nhưng có bề mặt nhẵn hơn Các quan sát này cung cấp thông tin quý giá về cấu trúc của các nguyên liệu.

Nguyên liệu chính để tạo proliposome BBR bao gồm BBR, Lecithin và vitamin E, được hòa tan trong methanol và cloroform, sau đó được tráng lên bề mặt các hạt sorbitol Hình thái của sorbitol và proliposome được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM).

Hình 3.14 Hình ảnh chụp SEM của các mẫu a, b: hình ảnh chụp SEM của bột sorbitol nguyên liệu ở độ phóng đại

3000x,4000x c,d: hình ảnh chụp SEM của proliposome BBR ở độ phóng đại 10000x, 2000x

Hình ảnh SEM cho thấy sorbitol có dạng tinh thể hình kim điển hình, trong khi tinh thể hình kim của sorbitol không có mặt trong hình ảnh SEM của proliposome, mà chỉ thấy các dạng hình khối Điều này chứng tỏ sự lắng đọng phospholipid và dược chất trên bề mặt, với lớp màng lipid mỏng phủ trên các hạt sorbitol.

54 đảm bảo sự hydrat hóa hoàn toàn của phospholipid, dẫn đến sự phân tán liposome sau khi tiếp xúc với môi trường [13]

Liposome BBR sau khi hydrat hóa

Hỗn dịch liposome BBR, được tạo ra từ việc hydrat hóa proliposome BBR, có màu vàng trong suốt, không có cặn lắng và không chứa các tiểu phân lớn có thể nhìn thấy bằng mắt thường.

Hình 3.15 Liposome BBR sau khi hydrat hóa

Sau khi hydrat hóa, kích thước của liposome BBR được đo bằng máy phân tích Zetasizer nano ZS90 Kết quả phân bố kích thước của chúng được thể hiện trong hình dưới đây.

3.7.2.3 Quá trình hydrat hóa proliposome BBR quan sát dưới kính hiển vi quang học

Nghiên cứu hydrat hóa nhằm đánh giá khả năng hình thành liposome từ proliposome sau khi hydrat hóa trong điều kiện tĩnh Phương pháp thực hiện bao gồm việc đặt một lượng nhỏ proliposome BBR lên lam kính, sau đó từ từ thêm nước và quan sát bằng kính hiển vi để theo dõi quá trình hình thành liposome Sự hòa tan diễn ra nhanh chóng ngay sau khi hydrat hóa, với liposome được hình thành khi nước tiếp xúc với bề mặt lipid của proliposome Quá trình này tiếp tục cho đến khi lipid được hydrat hóa hoàn toàn và chất mang được hòa tan Quan sát quá trình hòa tan sorbitol cũng được thực hiện tương tự Kết quả thu được cho thấy sự hình thành liposome hiệu quả trong quá trình hydrat hóa.

Hình 3.16 Quan sát bằng kính hiển vi quang học quá trình hòa tan sorbitol sau 0 giây (a), 30 giây (b), 1 phút (c) c b a

Quá trình hòa tan của sorbitol trong nước diễn ra nhanh chóng và hoàn toàn trong vòng một phút, với độ tan đạt 2,75 g/ml Sự hòa tan nhanh chóng này tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình hydrat hóa proliposome BBR, diễn ra theo cơ chế ăn mòn toàn phần Kết quả là liposome BBR thu được có kích thước tiểu phân nhỏ và phân bố trong khoảng hẹp.

Hình 3.17 Quan sát bằng kính hiển vi quang học quá trình hydrat hóa proliposome BBR tại thời điểm 0 giây (a), 30 giây (b), 1 phút (c), 2 phút (d) a b d c

Độ ổn định proliposome BBR trong các điều kiện bảo quản

Đánh giá độ ổn định của proliposome được bảo quản sau 1 tháng đã được thực hiện theo phương pháp tại mục 2.3.5, sử dụng hai loại bao bì là túi nhôm và túi PE kép Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm và điều kiện lão hóa cấp tốc ở nhiệt độ 40 oC ±2, 75% ±5 trong tủ vi khí hậu KBF P 240 (Binder – Đức).

Bảo quản trong điều kiện phòng thí nghiệm

Sau một tháng bảo quản, proliposome BBR vẫn duy trì được các đặc điểm ban đầu với dạng hạt khô tơi màu vàng Sau khi được hydrat hóa, liposome BBR có màu vàng trong suốt, không lắng cặn và không nhìn thấy các tiểu phân bằng mắt thường.

Hình 3.9 Proliposome BBR sau khi bảo quản 1 tháng ở điều kiện phòng thí nghiệm

Bảng 3.9 Đánh giá các đặc tính của proliposome BBR bảo quản ở điều kiện phòng thí nghiệm (trung bình ± SD, n=3)

Kết quả từ bảng 3.9 cho thấy, sau 1 tháng bảo quản trong điều kiện phòng thí nghiệm, proliposome BBR trong túi nhôm có các chỉ số đặc tính không thay đổi đáng kể so với ban đầu Trong khi đó, proliposome BBR được bảo quản trong 2 lần túi PE lại cho thấy độ ẩm, chỉ số nén, kích thước phần tử (KTTP), và chỉ số phân bố kích thước (PDI) tăng lên, đồng thời hiệu suất liposome hóa giảm so với ban đầu.

Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện mức độ giải phóng dược chất ở môi trường pH 1,2 và 6,8 sau khi bảo quản 1 tháng ở điều kiện phòng thí nghiệm

Từ hình 3.10 thấy ở cả bao bì túi nhôm và túi PE, trong môi trường pH 1,2 sau 2 giờ dược chất giải phóng 30 – 40%; trong môi trường pH 6,8 dược chất giải phóng  75%

Bảo quản trong điều kiện lão hóa cấp tốc

Hình thức của proliposome BBR trong túi nhôm vẫn được giữ nguyên, trong khi túi PE cho thấy hiện tượng ẩm ướt và màu sắc vàng đậm hơn Sau khi hydrat hóa, liposome BBR có màu vàng trong suốt, không có lắng cặn và không xuất hiện các tiểu phân lớn có thể nhìn thấy bằng mắt thường.

Hình 3.11 Liposome BBR sau hydrat hóa proliposome BBR ở thời điểm 1 tháng sau bảo quản trong điều kiện lão hóa cấp tốc

KTTP d.nm PDI Độ ẩm

KLR thô g/ml Ban đầu

Bảng 3.10 Các đặc tính của proliposome BBR khi bảo quản ở điều kiện lão hóa cấp tốc (trung bình ± SD, n=3)

Kết quả từ bảng 3.10 chỉ ra rằng sau 1 tháng bảo quản trong điều kiện lão hóa cấp tốc, proliposome BBR trong cả hai loại bao bì đều ghi nhận sự gia tăng về các chỉ số KTTP, PDI, độ ẩm và chỉ số nén, đồng thời giảm hiệu suất liposome hóa và hàm lượng dược chất Sự thay đổi rõ rệt nhất được quan sát thấy ở bao bì dạng túi 2 lần.

Hình 3.12 Biểu đồ thể hiện mức độ giải phóng dược chất ở môi trường pH 1,2 và 6,8 sau khi bảo quản 1 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc

Từ hình 3.12 thấy ở bao bì túi nhôm trong môi trường pH 1,2 sau 2 giờ dược chất giải phóng 30 – 40%, trong môi trường pH 6,8 dược chất giải phóng 

75%; ở bao bì 2 lần trong môi trường pH 1,2 sau 2 giờ dược chất giải phóng > 40%, trong môi trường pH 6,8 dược chất giải phóng  80%.

Đánh giá một số đặc tính khác của proliposome BBR

3.7.1.1 Hình thái proliposome BBR quan sát bằng kính hiển vi quang học

Hình 3.13 trình bày đặc điểm của các mẫu khi quan sát bằng kính hiển vi quang học, trong đó bột berberin nguyên liệu được quan sát ở vật kính 40x và thị kính 10x (a, b) Ngoài ra, sorbitol nguyên liệu và proliposome BBR cũng được quan sát ở vật kính 10x và thị kính 10x (c, d).

Hình ảnh dưới kính hiển vi cho thấy bột berberin có dạng tinh thể hình hộp chữ nhật và tinh thể hình kim xen lẫn, trong khi sorbitol xuất hiện dưới dạng các hạt đa giác Proliposome BBR có hình dạng tương tự như hạt sorbitol nhưng với bề mặt nhẵn hơn Những quan sát này cung cấp cái nhìn sâu sắc về cấu trúc của các thành phần nguyên liệu.

Nguyên liệu chính để tạo proliposome BBR bao gồm BBR, Lecithin và vitamin E, được hòa tan trong methanol và cloroform, sau đó được tráng lên bề mặt các hạt sorbitol Hình thái của sorbitol và proliposome đã được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM).

Hình 3.14 Hình ảnh chụp SEM của các mẫu a, b: hình ảnh chụp SEM của bột sorbitol nguyên liệu ở độ phóng đại

3000x,4000x c,d: hình ảnh chụp SEM của proliposome BBR ở độ phóng đại 10000x, 2000x

Hình ảnh chụp SEM cho thấy sorbitol có dạng tinh thể hình kim điển hình, trong khi tinh thể hình kim của sorbitol không xuất hiện trong hình ảnh SEM của proliposome, mà chỉ có các dạng hình khối Điều này chứng tỏ sự lắng đọng phospholipid và dược chất trên bề mặt, với lớp màng lipid mỏng phủ trên các hạt sorbitol.

54 đảm bảo sự hydrat hóa hoàn toàn của phospholipid, dẫn đến sự phân tán liposome sau khi tiếp xúc với môi trường [13]

Liposome BBR sau khi hydrat hóa

Hỗn dịch liposome BBR, sau khi được hydrat hóa từ proliposome BBR, có màu vàng trong suốt, không lắng cặn và không chứa các tiểu phân lớn có thể nhìn thấy bằng mắt thường.

Hình 3.15 Liposome BBR sau khi hydrat hóa

Sau khi hydrat hóa, kích thước của liposome BBR được đo bằng máy phân tích Zetasizer nano ZS90 Kết quả phân bố kích thước thể hiện trong hình dưới đây.

3.7.2.3 Quá trình hydrat hóa proliposome BBR quan sát dưới kính hiển vi quang học

Nghiên cứu hydrat hóa nhằm đánh giá khả năng hình thành liposome từ proliposome sau khi được hydrat hóa trong điều kiện tĩnh Phương pháp thực hiện bao gồm việc đặt một lượng nhỏ proliposome BBR lên lam kính, sau đó từ từ thêm nước và quan sát sự hình thành liposome qua kính hiển vi Quá trình hydrat hóa diễn ra nhanh chóng ngay khi nước tiếp xúc với bề mặt lipid của proliposome, tiếp tục cho đến khi hoàn tất quá trình hydrat hóa lipid và hòa tan chất mang Quan sát quá trình hòa tan sorbitol cũng được thực hiện tương tự Kết quả thu được cho thấy sự hình thành liposome hiệu quả từ proliposome khi được hydrat hóa.

Hình 3.16 Quan sát bằng kính hiển vi quang học quá trình hòa tan sorbitol sau 0 giây (a), 30 giây (b), 1 phút (c) c b a

Quá trình hòa tan của sorbitol trong nước diễn ra nhanh chóng, hoàn toàn trong vòng một phút, với độ tan đạt 2,75 g/ml Sự hòa tan nhanh chóng này giúp tăng tốc quá trình hydrat hóa proliposome BBR, theo cơ chế ăn mòn toàn phần, dẫn đến việc thu được liposome BBR có kích thước nhỏ và phân bố hẹp.

Hình 3.17 Quan sát bằng kính hiển vi quang học quá trình hydrat hóa proliposome BBR tại thời điểm 0 giây (a), 30 giây (b), 1 phút (c), 2 phút (d) a b d c

Quá trình hydrat hóa của prolipsome BBR diễn ra nhanh chóng chỉ trong một phút khi tiếp xúc với nước, và sự chuyển đổi hoàn toàn thành liposome BBR hoàn tất trong vòng 2 phút sau khi hydrat hóa.

Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC)

Hình 3.18 Phổ DSC của sorbitol, berberin, lecithin và proliposome BBR

Các giản đồ nhiệt vi sai cho thấy sorbitol có một peak thu nhiệt ở 112C, tương ứng với nhiệt độ nóng chảy của nó Berberin base xuất hiện một peak thu nhiệt ở 93C, phản ánh sự bay hơi của các phân tử nước trong nguyên liệu bị hút ẩm, cùng với một peak ở 135C tương ứng với nhiệt độ nóng chảy và một peak ở 208C liên quan đến nhiệt độ phân hủy Đặc biệt, trên phổ đồ DSC của proliposome berberin, peak thu nhiệt của berberin đã biến mất, chứng tỏ berberin đã chuyển từ dạng kết tinh sang vô định hình trong proliposome.

Đánh giá độ ổn định của liposome BBR sau khi hydrat hóa trong các môi trường

Độ ổn định trong môi trường nước

Bảng 3.11 Độ ổn định của liposome BBR sau khi hydrat hóa trong môi trường nước (trung bình ± SD, n=3)

Hàm lượng BBR trong môi trường

Kết quả từ bảng 3.11 cho thấy rằng, sau khi đưa hỗn dịch liposome BBR vào môi trường nước, các chỉ số về hàm lượng dược chất hầu như không thay đổi, trong khi KTTP và PDI chỉ tăng nhẹ trong suốt 4 giờ Điều này chứng tỏ rằng môi trường nước không ảnh hưởng đến độ ổn định của liposome BBR sau khi được hydrat Hơn nữa, độ ổn định của liposome BBR cũng được đánh giá trong môi trường mô phỏng dịch dạ dày (pH 1,2).

Bảng 3.12 Độ ổn định của liposome BBR sau khi hydrat hóa trong môi trường pH 1,2 (trung bình ± SD, n=3)

Kết quả từ bảng 3.12 cho thấy, sau 4 giờ trong môi trường pH 1,2, hàm lượng dược chất giảm còn 89,69% Kích thước trung bình của hạt (KTTP) tăng từ 237,867 nm lên 253,33 nm, trong khi chỉ số phân tán (PDI) giảm từ 0,323 xuống 0,260 nm Điều này chứng tỏ rằng môi trường sinh lý dạ dày có tác động nhẹ đến độ ổn định của liposome BBR sau khi hydrat hóa, đồng thời cho thấy độ ổn định trong môi trường đệm phosphat pH 4,5.

Bảng 3.13 Độ ổn định của liposome BBR sau khi hydrat hóa trong môi trường đệm phosphat pH 4,5 (trung bình ± SD, n=3)

Kết quả từ bảng 3.13 cho thấy, sau 4 giờ trong môi trường đệm phosphat pH 4,5, hàm lượng dược chất của hỗn dịch liposome BBR hầu như không thay đổi Kích thước trung bình của tiểu phân (KTTP) tăng từ 386,2 nm lên 493,467 nm, trong khi chỉ số phân bố (PDI) cũng tăng từ 0,338 lên 0,497 Điều này chứng tỏ rằng môi trường đệm phosphat pH 4,5 không ảnh hưởng đến hàm lượng dược chất, mặc dù làm tăng KTTP và PDI, nhưng tiểu phân vẫn duy trì trong khoảng kích thước tương đối hẹp.

60 Độ ổn định trong môi trường đệm phosphat pH 6,8

Bảng 3.14 Độ ổn định của liposome BBR sau khi hydrat hóa trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 (trung bình ± SD, n=3)

Kết quả từ bảng 3.14 cho thấy, sau 4 giờ trong môi trường mô phỏng dịch ruột, hàm lượng dược chất của hỗn dịch liposome BBR gần như không thay đổi, trong khi PDI tăng từ 0,345 lên 0,412 Tuy nhiên, kích thước của liposome vẫn phân bố trong khoảng hẹp, chứng tỏ môi trường này không ảnh hưởng đến độ ổn định của liposome BBR.

BÀN LUẬN

Định dạng
Số trang	97
Dung lượng	3,71 MB