Nghiên cứu tác dụng giảm đau, chống viêm và độc tính của chế phẩm vm trên thực nghiệm

TỔNG QUAN

Tổng quan về viêm

1.1.1 Định nghĩa, nguyên nhân và phân loại viêm

Viêm là phản ứng phức tạp của cơ thể, xuất hiện khi các mô bị kích thích hoặc tổn thương Biểu hiện của viêm bao gồm sự thực bào tại chỗ, nhằm loại trừ tác nhân gây viêm và sửa chữa tổn thương, kèm theo các triệu chứng lâm sàng như sưng, nóng, đỏ, đau và rối loạn chức năng.

Tất cả các nguyên nhân gây tổn thương và làm chết tế bào tại một khu vực nhất định đều có khả năng gây ra viêm tại khu vực đó Nguyên nhân gây viêm được phân thành hai nhóm chính.

Nguyên nhân ngoại sinh gây tổn thương ADN có thể đến từ các yếu tố cơ học như chấn thương và va chạm, cũng như các yếu tố vật lý như nhiệt độ và phóng xạ, tạo ra gốc oxy tự do Ngoài ra, hóa chất, thuốc, và các tác nhân sinh học như virus, vi khuẩn, nấm cũng góp phần gây viêm và tổn thương cho ADN.

Nguyên nhân nội sinh gây viêm có thể bao gồm tình trạng thiếu oxy tại chỗ, hoại tử mô, xuất huyết, hoặc sự lắng đọng của các phức hợp miễn dịch có hoạt hóa bổ thể, dẫn đến phản ứng tự miễn.

Có nhiều cách phân loại viêm [6], [14]:

 Theo nguyên nhân: viêm nhiễm khuẩn và viêm vô khuẩn

 Theo dịch rỉ viêm: viêm thanh dịch, viêm tơ huyết, viêm mủ… tùy theo dịch viêm giống huyết thanh, huyết tương hay chứa nhiều bạch cầu thoái hóa…

 Theo diễn biến: viêm cấp và viêm mạn

Viêm cấp là hiện tượng diễn ra trong thời gian ngắn, từ vài phút đến vài ngày, bao gồm ba hiện tượng chính: giãn mạch làm tăng lượng máu tới ổ viêm, thay đổi cấu trúc trong mạch vi tuần hoàn cho phép protein huyết tương thoát ra, và di tản bạch cầu vào nơi tổn thương Những hiện tượng này được gây ra bởi hai yếu tố: yếu tố thần kinh, dẫn đến sự tê liệt các dây thần kinh co mạch, và yếu tố thể dịch, với sự giải phóng các chất trung gian hóa học như histamin, serotonin, và bradykinin, góp phần gây ra triệu chứng sưng, nóng, đỏ, và đau trong viêm cấp.

Viêm mạn có thể kéo dài từ vài ngày đến vài năm, với đặc trưng là sự xâm nhập của lympho bào và đại thực bào, cùng với tổn thương và sửa chữa mô thông qua sự tăng sinh của mạch máu và mô xơ Trong hầu hết các trường hợp, viêm mạn sẽ được loại bỏ, để lại sẹo xơ, nhưng cũng có những trường hợp viêm mạn kéo dài, dẫn đến sự tăng sinh nguyên bào sợi và hình thành u hạt Khi u hạt tiến triển, các thành phần tế bào và mao mạch tân tạo sẽ mất đi, và mô tạo keo sẽ dần xuất hiện.

1.1.2 Những biến đổi chủ yếu trong viêm

Viêm có ba loại rối loạn chính diễn ra đồng thời và liên quan chặt chẽ với nhau: rối loạn tuần hoàn và vi tuần hoàn, rối loạn chuyển hóa, và tổn thương mô kèm theo sự tăng sinh của các tế bào và tổ chức liên kết.

Rối loạn tuần hoàn và vi tuần hoàn tại ổ viêm là biến đổi sớm và dễ thấy nhất khi yếu tố gây viêm tác động lên cơ thể, bắt đầu bằng rối loạn vận mạch và co mạch Sự giải phóng enzym từ lysosom của tế bào chết và các chất trung gian hóa học từ tế bào mast và bạch cầu như histamin, bradykinin, prostaglandin, leucotrien diễn ra, cùng với các sản phẩm từ quá trình thực bào của bạch cầu Nitric oxyd (NO) do NOsynthetase của tế bào viêm sản sinh gây ra các triệu chứng sưng phù, nóng, đỏ và đau Dịch rỉ viêm được hình thành, chứa nước, muối, protein huyết tương, hồng cầu, tiểu cầu, bạch cầu, và các chất trung gian hóa học như histamin, serotonin, bradykinin Các yếu tố gây viêm như LPS từ vi khuẩn kích hoạt đại thực bào, dẫn đến sự tiết TNF, IL-1 và IL-6, làm tăng cường hóa ứng động, thu hút bạch cầu trung tính và đại thực bào đến ổ viêm để thực hiện quá trình thực bào.

Trong ổ viêm, quá trình oxy hóa gia tăng dẫn đến nhu cầu oxy cao hơn, trong khi pH giảm, gây ra nhiều rối loạn chuyển hóa glucid, lipid và protid Màng tế bào của các tế bào viêm chuyển hóa acid arachidonic thành prostaglandin và leukotrien, hai chất này có khả năng gây giãn mạch mạnh và làm tăng nhiệt độ cơ thể.

Tổn thương mô và tăng sinh tế bào

Tại ổ viêm, có hai loại tổn thương chính: tổn thương tiên phát do nguyên nhân gây viêm và tổn thương thứ phát do rối loạn tại ổ viêm Các tế bào nhu mô của cơ quan viêm có khả năng tái sinh hoàn toàn, giúp phục hồi cấu trúc và chức năng của cơ quan, hoặc một phần nhu mô có thể bị thay thế bằng mô xơ (u hạt).

1.1.3 Các đích tác dụng phân tử của các thuốc chống viêm

Viêm đang được nghiên cứu kỹ lưỡng ở cấp độ phân tử, giúp làm rõ các mục tiêu tác dụng của thuốc chống viêm, từ đó mang lại nhiều lợi ích lâm sàng.

Khi mô bị tổn thương, màng tế bào giải phóng phospholipid, chuyển hóa thành acid arachidonic dưới tác dụng của phospholipase A2 Acid arachidonic sau đó được chuyển đổi thành leucotrien nhờ enzym lipoxygenase (LOX) và tạo ra PGE2 gây viêm, đau, cùng với prostacyclin (PGI2) và thromboxan A2 (TXA2) dưới tác dụng của enzym cyclooxygenase (COX), ảnh hưởng đến sự lắng đọng tiểu cầu.

Hình 1.1 Con đường viêm và các chất trung gian của viêm [20]

Axid arachidonic và các prostaglandin (PG) đóng vai trò quan trọng trong phản ứng viêm, với sinh tổng hợp PG gia tăng đáng kể trong các mô bị viêm Quá trình sản xuất PG phụ thuộc vào enzym PGG/H synthetase, thường được biết đến là enzym COX Enzym COX xúc tác cho việc tổng hợp endoperoxid từ axid arachidonic để tạo ra các PGs Có hai dạng COX, là COX-1 và COX-2, với chức năng khác nhau, và các thuốc chống viêm tác động khác nhau lên hai loại COX này.

Enzym COX-1 đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì hoạt động sinh lý bình thường của tế bào, được coi là một "enzym cấu tạo" Nó hiện diện ở hầu hết các mô như thận, dạ dày, nội mạc mạch, tiểu cầu, tử cung và tinh hoàn COX-1 tham gia vào quá trình sản xuất các chất cần thiết cho cơ thể.

PG như TXA 2 của tiểu cầu, prostacyclin trong dạ dày, PGE 2 tại dạ dày và thận [19],

[37], có tác dụng điều hòa các chức phận sinh lý, ổn định nội môi, bảo vệ tế bào, nên còn được gọi là “enzym giữ nhà” (house eeping enzym) [17], [18], [32]

Enzym COX-2 thường có nồng độ rất thấp trong các mô bình thường, nhưng nhanh chóng được sản sinh trong các mô viêm khi có sự kích thích từ các yếu tố gây viêm như cytokine, yếu tố tăng trưởng, tác nhân thúc đẩy khối u và endotoxin từ vi khuẩn Nồng độ COX-2 trong mô viêm có thể tăng lên đến 80 lần do các kích thích này, dẫn đến việc COX-2 được gọi là “enzym cảm ứng.”

Tổng quan về đau

1.2.1 Định nghĩa và phân loại đau

Theo Hiệp hội Quốc tế Nghiên cứu về Đau (IASP), đau được định nghĩa là cảm nhận giác quan và xúc cảm do tổn thương mô thực thể hoặc tiềm tàng, với mức độ nặng nhẹ phụ thuộc vào mức độ tổn thương Khi có các kích thích đau, cơ thể sẽ giải phóng nhiều chất gây đau như histamin, chất P, các chất chuyển hóa acid và các kinin huyết tương như bradykinin và allidin.

Có rất nhiều cách phân loại đau, trong đó có 3 cách phân loại chính [17]:

 Phân loại đau theo bệnh lý:

Đau do viêm được gây ra bởi sự sản sinh của nhiều chất trung gian hóa học như histamin, serotonin, prostaglandin (PG), cytokine, và các sợi thần kinh hướng tâm tiết ra chất P và noradrenalin Loại đau này thường nhạy cảm với thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs).

Đau do bệnh lý thần kinh là loại đau xuất phát từ những tổn thương hoặc rối loạn chức năng trong hệ thần kinh, và thường không đáp ứng tốt với các thuốc giảm đau thông thường.

 Phân loại đau theo thời gian xuất hiện và duy trì:

Đau cấp tính là loại đau mới xuất hiện với cường độ mạnh mẽ, thường được coi là dấu hiệu cảnh báo hữu ích cho sức khỏe Thời gian của cơn đau này thường kéo dài dưới 3 tháng.

− Đau mạn tính là chứng đau dai dẳng tái đi tái lại nhiều lần

 Phân loại theo hu trú đau:

− Đau cục bộ: là cảm nhận vị trí đau trùng với vị trí tổn thương

− Đau lan xiên: là cảm giác đau gây ra do sự lan tỏa từ một nhánh dây thần kinh này sang một nhánh thần kinh khác

1.2.2 Đường dẫn truyền cảm giác đau Đường dẫn truyền cảm giác đau bao gồm dẫn truyền từ receptor vào tủy, dẫn truyền từ tủy lên não và nhận cảm ở vỏ não [7], [11], [17], [28]

(i) Dẫn truyền từ receptor vào tủy

Cảm giác đau được dẫn truyền từ ngoại vi vào tủy sống thông qua thân tế bào neuron thứ nhất tại hạch gai rễ sau Cảm giác đau cấp được truyền qua các sợi Aδ (ít myelin) với tốc độ 6-30 m/sec, trong khi cảm giác đau mạn được truyền qua sợi C (không có myelin) với tốc độ 0,5-2 m/sec Việc ức chế sợi Aδ sẽ làm mất cảm giác đau cấp, trong khi ức chế sợi C bằng thuốc tê tại chỗ sẽ làm mất cảm giác đau chậm.

(ii) Dẫn truyền từ tủy lên não

Từ tủy lên não, cảm giác đau được dẫn truyền theo nhiều đường:

− Bó gai-thị nằm ở cột trắng trước-bên Bó này có nhiều sợi nhất Nơ ron ở nhóm nhân sau của đồi thị

− Bó gai-lưới tận cùng ở các vùng khác nhau ở hành não, cầu não, não giữa của cả hai bên

− Các bó gai-cổ đồi thị từ tủy cùng bên đi lên

Tại các synap với nơ ron thứ hai ở sừng sau tủy, các sợi C tiết ra chất P, một peptid thần kinh có đặc điểm bài tiết và khử hoạt chậm Cấu tạo lưới chứa nhiều nơ ron với các sợi trục ngắn, truyền tín hiệu lên các nhân của đồi thị và vùng lân cận ở nền não Sự kích thích của cấu tạo lưới không chỉ giúp truyền tín hiệu mà còn kích hoạt vỏ não, làm tăng hoạt động của hệ thần kinh để đáp ứng với cảm giác đau.

Đồi thị là trung tâm nhận cảm đau của hệ thần kinh trung ương, chứa các tế bào neuron cảm giác thứ ba Những neuron này kết nối từ đồi thị đến nhiều vùng khác nhau trong não, bao gồm cả vùng cảm giác đau ở vỏ não Từ các neuron này, các sợi tạo thành bó thị vỏ đi qua 1/3 sau của tay sau bao trong và vành tia, đến vỏ não hồi sau trung tâm và thùy đỉnh để phân tích thông tin và quyết định phản ứng thích hợp.

1.2.3 Các đích tác dụng phân tử của các thuốc giảm đau

Trong cơ thể, nhiều chất trung gian hóa học tham gia vào việc dẫn truyền cảm giác đau hoặc làm mất cảm giác đau Hai chất nội sinh quan trọng bao gồm opioid nội sinh, có tác dụng giảm đau tương tự như morphin, và prostaglandin, một chất gây viêm đau mạnh.

1.2.3.1 Kích thích các receptor opioid:

Morphin tác động lên ba loại receptor đặc hiệu là mu (μ), delta (δ) và kappa (κ), chủ yếu tập trung ở sừng sau tủy sống, đồi thị, chất xám quanh cầu não và não giữa Ngoài ra, các receptor này cũng xuất hiện ở tủy thượng thận, đám rối thần kinh tạng và tuyến ngoại tiết dạ dày - ruột Hầu hết các thuốc opioid lâm sàng có tác dụng chọn lọc trên các receptor này, với nhiều opioid nội sinh như endorphin, dynorphin A và enkephalin có ái lực cao Từ năm 1998-2000, một loại receptor opioid mới được phát hiện, gọi là N/OFQ receptor, với peptid nociceptin (N) và orphan FQ (OFQ), có khả năng làm giảm ngưỡng đau.

Cơ chế giảm đau của các peptid opioid [7], [17], [20]:

Các receptor opioid gắn với protein G i , làm ức chế hoạt động của adenylcyclase vì vậy có tác động trên các kênh ion của tế bào thần kinh:

− Ức chế mở kênh Ca 2+ hoạt động bằng điện thế tại đầu tận cùng thần inh trước synap, do đó làm giảm giải phóng chất dẫn truyền thần kinh

− Hoạt hóa kênh K + , làm mở kênh K vào tế bào gây ưu cực hóa, vì vậy ức chế dẫn truyền sau synap

Hệ thống nhận và truyền cảm giác đau có sự tham gia của nhiều chất dẫn truyền thần kinh như chất P, enkephalin, serotonin cùng với các cấu trúc như tủy sống, hành tủy và não giữa Các hệ thống này tương tác với serotonin, adrenalin và dopamin Nghiên cứu cho thấy các receptor opioid có thể kích hoạt hệ thống truyền tin thứ hai như MAP kinase và phospholipase C (PLC), dẫn đến sự hình thành inositol triphosphat và diacylglycerol.

Các thuốc opioid được xếp vào nhóm thuốc giảm đau trung ương được chia thành ba loại [17]:

− Cỏc chất đồng vận giống morphin: gắn đồng thời trờn cả receptor à và κ nờn có tác dụng giảm đau mạnh Ví dụ morphin, methadon, fentanyl…

Các chất có tác dụng hỗn hợp đồng vận đối kháng với morphin, như pentazocin và butorphanol, có khả năng gắn kết với cả receptor μ và κ Tại receptor κ, chúng hoạt động như đồng vận kích thích, giúp giảm đau, trong khi tại receptor μ, chúng lại có tác dụng đối kháng.

− Các chất đối kháng với morphin như nalorphin, naloxon, naltrexon

Hình 1.2 Đường dẫn truyền cảm giác đau và các đích tác dụng của các thuốc giảm đau opioid tại tủy sống [17]

Khi các tế bào bị tổn thương sẽ giải phóng kali, histamin, serotonin, bradykinin

Các chất này không chỉ kích hoạt trực tiếp các thụ thể đau mà còn làm giảm ngưỡng hoạt động của các sợi thần kinh nhỏ, khiến chúng trở nên kém nhạy cảm với các kích thích cơ học và nhiệt Đồng thời, chúng khởi động quá trình tổng hợp acid arachidonic, dẫn đến sản sinh các prostaglandin (PG) và leucotrien, làm tăng độ nhạy của thụ thể với các chất gây đau Theo nghiên cứu của Mocada và Vane (1978), việc ức chế enzym COX sẽ giảm tổng hợp PGF2a, từ đó làm giảm độ nhạy của các dây thần kinh cảm giác với các chất gây đau trong phản ứng viêm như bradykinin, histamin và serotonin, có tác dụng giảm đau hiệu quả.

Nhóm thuốc giảm đau ức chế enzym COX, còn được gọi là thuốc giảm đau ngoại vi, bao gồm paracetamol và các thuốc giảm đau chống viêm không steroid (NSAIDs).

1.2.4 Một số mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau của thuốc

1.2.4.1 Mô hình giảm đau trung ương:

Hot plate method (Thử nghiệm tấm nóng) [12] [78]

Bàn chân chuột rất nhạy cảm với nhiệt độ, vì vậy cần đặt chuột lên máy đo phản xạ với nhiệt độ ổn định là 55 ± 1 o C Sử dụng đồng hồ bấm giây để xác định thời gian phản ứng đau của từng con chuột, tính từ lúc đặt chuột lên máy đến khi chuột có phản ứng liếm chân sau hoặc nhảy lên để tránh phiến nóng Nếu thuốc thử nghiệm có tác dụng giảm đau, chuột sẽ không có hoặc có phản ứng chậm hơn.

Tổng quan về chế phẩm VM

1.3.1 Thành phần của chế phẩm VM

Chế phẩm VM được phát triển từ bài thuốc cổ truyền, bao gồm sự kết hợp của 7 vị dược liệu quý: địa liền, đỗ trọng, đương quy, hương hoạt, ngải mọi, thổ phục linh và xuyên tâm liên.

1.3.2 Tác dụng của các dược liệu trong chế phẩm VM

1.3.2.1 Địa liền Địa liền hay còn được gọi là thiền liền, tam nại, sơn nại, sa hương Tên hoa học: Kaempferia galanga L (Kaempferia Rotunda Ridl.), thuộc họ Gừng

Bộ phận dùng: Thân rễ.

Thành phần hóa học: thân rễ địa liền khô chứa 2,4 - 3,9 % tinh dầu, thành phần chủ yếu là acid p -methoxycinamic, ethyl cinamat và p-methoxy ethylcinamat [2],

Địa liền là một loại thảo dược có công dụng chữa trị hiệu quả các triệu chứng như đau bụng, tiêu chảy, và các vấn đề liên quan đến tiêu hóa như đau dạ dày và khó tiêu Ngoài ra, nó còn được sử dụng trong việc điều trị ho cảm, nôn mửa và hen suyễn, theo kinh nghiệm dân gian và nghiên cứu trên thế giới.

Địa liền đã được nghiên cứu tại Việt Nam về tác dụng chống viêm và giảm đau, cho thấy cao chiết từ địa liền không chỉ có khả năng giảm đau mà còn hạ sốt, làm giãn khí phế quản và có phổ kháng nấm rộng Theo nghiên cứu của Đỗ Trung Đàm, trên mô hình gây phù bàn chân chuột cống trắng bằng aolin 10%, địa liền thể hiện tác dụng chống viêm rõ rệt, với liều 10 g/kg cân nặng ức chế viêm lên tới 60% (p < 0,02) Trong thí nghiệm gây đau quặn bằng acid acetic 0,6%, chuột uống địa liền với liều 5 g/kg cân nặng giảm 69% số cơn đau so với nhóm chứng (p < 0,02) Tuy nhiên, trên mô hình gây đau bằng mâm nóng, địa liền không cho thấy tác dụng giảm đau như morphin.

Nghiên cứu của Sulaiman và cộng sự (2008) đã chứng minh hoạt tính chống viêm in vivo của dịch chiết nước lá K galanga thông qua thử nghiệm gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan 0,1 % Kết quả cho thấy dịch chiết này có tác dụng chống viêm mạnh, phụ thuộc vào liều lượng, với tỷ lệ ức chế phù chân chuột đạt 45% và 50% ở liều 100 và 300 mg/kg (p < 0,05) Trong mô hình gây u hạt, khối lượng khô của u hạt giảm đáng kể (p < 0,001) khi sử dụng chiết xuất K galanga, với tỷ lệ ức chế hình thành u hạt là 36,70% ở liều 1200 mg/kg, tương đương với tác dụng của aspirin (42,17%) Ngoài ra, chiết xuất K galanga ở liều 600 và 1200 mg/kg còn cho thấy hoạt tính giảm đau mạnh, làm chậm thời gian xuất hiện cảm giác đau so với nhóm chứng dùng codein (p < 0,01) Điều này cho thấy chiết xuất địa liền trong ethanol 95% có hoạt tính chống viêm và giảm đau đáng kể trong các mô hình in vivo thực nghiệm (p < 0,01).

Nhóm nghiên cứu của Umar và cộng sự (2012, 2014) đã tiến hành đánh giá độc tính cấp tính của K galanga theo hướng dẫn của OECD, cho chuột uống dịch chiết K galanga với liều tối đa 5000 mg/kg Kết quả cho thấy trong 14 ngày theo dõi, không có chuột nào chết và không có thay đổi đáng kể nào trong hành vi và sinh lý của động vật thí nghiệm Trong mô hình in vitro, ethyl-p-methoxycinnamat (EPMC), hoạt chất chính từ K galanga, đã chứng minh khả năng ức chế không chọn lọc cả hai enzym COX-1 và COX-2, với sự ức chế COX-2 rõ ràng hơn (57,82%) so với COX-1 (42,9%) Thêm vào đó, EPMC còn làm giảm nồng độ IL-1, TNF-α và NO trong đại thực bào, từ đó ngăn chặn sản sinh các chất trung gian tiền viêm, thể hiện tác dụng chống viêm của nó.

Tên khoa học: Eucommia ulmoides Oliv, họ Đỗ trọng Eucommiaceae

Bộ phận dùng: vỏ thân

Đỗ trọng chứa hai nhóm thành phần hóa học chính là iridoid glycosid và lignan glycosid Trong đó, aucubin là iridoid glycosid chủ yếu có trong vỏ thân, với hàm lượng dao động từ 0,1 - 4%.

Vỏ thân đỗ trọng có nhiều công dụng trong y học cổ truyền, được sử dụng để điều trị các vấn đề như thận hư, đau lưng, yếu mỏi chân gối, phong thấp, sưng tê phù, tăng huyết áp, và di tinh liệt dương.

Một số nghiên cứu về tác dụng chống viêm, giảm đau của đỗ trọng:

Nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra rằng các dẫn chất iridoid từ vỏ thân đỗ trọng có nhiều tác dụng dược lý, bao gồm kháng khuẩn, hạ huyết áp, giảm đau, chống viêm, nhuận tràng, an thần và chống ung thư.

Năm 1999, nghiên cứu về độc tính cấp của Eucommia ulmoides đã được thực hiện bằng cách cho chuột uống liều 88,9 g/kg/ngày trong 7 ngày Kết quả cho thấy không có chuột nào chết và không có sự thay đổi đáng kể nào về tình trạng chung cũng như khối lượng của chuột thí nghiệm.

Nghiên cứu của Kim Bong Hyun và cộng sự (2009) cho thấy vỏ cây đỗ trọng chứa nhiều iridoid có khả năng ức chế enzym COX-2 mà không ảnh hưởng đến COX-1, giúp tránh tác dụng phụ trên đường tiêu hóa Cơ chế chống viêm của đỗ trọng được xác định là ngăn chặn sự hoạt hóa của NF-kB, từ đó ức chế các gen gây viêm Ngoài ra, nghiên cứu của Koh và cộng sự đã chỉ ra rằng dịch chiết nước đỗ trọng có tác dụng chống viêm in vitro trên tế bào RAW 264.7, ức chế các chất trung gian viêm như iNOS, COX-2, TNF-α và IL-1β, đồng thời điều chỉnh con đường TLR-4 trong sụn của bệnh nhân viêm khớp.

Tên khoa học: Rhizoma Notopterygii, họ Hoa tán Apiaceae

Bộ phận dùng: rễ cây

Rễ hương hoạt chứa các hoạt chất coumarin như notopterol (34 %), notoptol (1,2 %), bergapten và isoimperatorin, trong đó notopterol nổi bật với tác dụng giảm đau, chống viêm và chống oxy hóa Trong y học cổ truyền, hương hoạt được sử dụng để điều trị các chứng bệnh như thủy thấp phong, đau nhức khớp xương, cũng như để chữa nhức đầu và cảm mạo.

Một số nghiên cứu về tác dụng chống viêm, giảm đau của khương hoạt:

Nghiên cứu cho thấy tinh dầu hương hoạt pha loãng có tác dụng giảm phù bàn chân chuột nhắt trắng do carrageenan và dextran gây ra Khi chuột nhắt trắng uống tinh dầu với liều 0,75 g/kg, chúng hoạt động bình thường trong vòng 24 giờ, với LD 50 đạt 2.83 g/kg Ngoài ra, dịch tiêm hương hoạt 2% với liều 10 ml/kg (gấp 125 lần liều trên lâm sàng) tiêm tĩnh mạch cho thỏ không ghi nhận phản ứng phụ đáng kể.

Theo nghiên cứu của Nguyễn Quỳnh Chi, trong tài liệu "Nghiên cứu một số thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của hương hoạt có trên thị trường Việt Nam", hương hoạt được xác định có nhiều thành phần hóa học quan trọng và các tác dụng sinh học đáng chú ý Những thông tin này giúp hiểu rõ hơn về giá trị và ứng dụng của hương hoạt trong đời sống.

Năm 2001, nghiên cứu cho thấy nước sắc hương hoạt có tác dụng giảm đau và chống viêm rõ rệt trên các mô hình đau quặn do acid acetic và mô hình cấy túi u hạt Chiết xuất n-hexan từ hương hoạt, giàu phenethyl và falcarindiol, đã cho thấy khả năng ức chế enzym 5-LOX và COX, trong đó phenethyl ức chế COX và falcarindiol ức chế 5-LOX Hơn nữa, hương hoạt còn có khả năng chống viêm nhờ vào việc ức chế sản sinh NO thông qua con đường tổng hợp NOs.

Nghiên cứu cho thấy, trong mô hình gây đau quặn bằng acid acetic, dịch chiết hương hoạt từ methanol với liều 3 g/kg trọng lượng chuột khi sử dụng theo đường uống có khả năng ức chế tới 87% số cơn đau quặn so với nhóm chứng.

Tên khoa học: Angelica sinensis (Oliv) Diels, họ Hoa tán Apiaceae

Bộ phận dùng: rễ cây

Thành phần hóa học: thành phần chủ yếu là tinh dầu, bao gồm ligustilid, n-butilphtalid, butylidenephthalid, …, ngoài ra còn có các acid amin [2]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tƣợng nghiên cứu

Chế phẩm VM do đề tài mã số KHCN-TNB/14-19 cung cấp, là sự kết hợp của

Bảy vị dược liệu được nghiên cứu bao gồm địa liền, đỗ trọng, đương quy, hương hoạt, ngải mọi, thổ phục linh và xuyên tâm liên Cao chiết VM được thực hiện bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ thường với dung môi ethanol 40%, đạt hàm ẩm 15% và tỷ lệ cao chiết là 11% Cao đặc được bảo quản trong điều kiện phòng để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo Trong các nghiên cứu pha chế phẩm VM trong NaCMC 0,1%, thể tích cho chuột uống được đảm bảo đồng nhất ở mức 0,1 ml/10g trọng lượng cơ thể.

Trong nghiên cứu, liều cao VM được sử dụng cho chuột cống trắng là 75 mg/kg và 150 mg/kg, trong khi đối với chuột nhắt trắng, liều dùng là 120 mg/kg.

Chuột cống trắng chủng Wistar khỏe mạnh, cân nặng 140 - 180 g do học viện Quân Y cung cấp

Chuột nhắt trắng, thuộc chủng Swiss albino, có trọng lượng từ 18 - 20 g, được cung cấp bởi viện vệ sinh dịch tễ trung ương Chúng được nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng và ánh sáng tự nhiên tại phòng thí nghiệm của bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội Chuột được cho ăn bằng thức ăn chuẩn từ viện vệ sinh dịch tễ trung ương và có nước uống tự do Trước khi bắt đầu nghiên cứu, chuột được nuôi ổn định trong điều kiện thí nghiệm tối thiểu 5 ngày.

Tế bào RAW264.7 sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp bởi American Type Culture Collection (ATCC ® TIB-71™), được lưu giữ trong nitơ lỏng

2.1.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

− Voltaren 50mg của công ty Norvatis, Thụy Điển, số lô 11735 hạn dùng 05/2021

− Prednisolon 5mg của công ty dược phẩm Nam Hà, số lô 26052, hạn dùng 03/2021

− Ống nghiệm chống đông EDTA K2 của hãng HTM Việt Nam

− Ethanol 96 %, nước cất hai lần, n-hexan, ethyl acetat, methanol, cloroform, aceton, dicloromethan, …

− Môi trường nuôi cấy tế bào RPMI 1640 hãng Gibco, Invitrogen

− Huyết thanh bào thai bê FBS hãng Gibco, Invitrogen

− Khỏng sinh penicillin, streptomycin (100 àg/ml) hóng Gibco, Invitrogen

− Tetrazolium salt, 3-4,5 dimethylthiazol-2,5 diphenyl tetrazolium bromid (MTT) của hãng Invitrogen

HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid) from Invitrogen, Germany, is a key component in various biological applications It is used in conjunction with antibiotics such as penicillin and streptomycin (100 µg/ml), along with NaCl and Tris buffers Additionally, Sigma's NP40 is utilized for cell lysis, while anti-mouse IgG HRP-linked antibodies are employed for detection in immunoassays.

− Bộ dung dịch ECL Prime gồm dung dịch luminol và dung dịch peroxid do hãng

GE Health UK Limited cung cấp

− Các dụng cụ và hóa chất hác đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

− Đồng hồ bấm giây (Nhật Bản)

− Máy đo độ phù chân chuột Plethysmometer LE 7500 (Letica Scientific Instruments)

− Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI)

− Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

− Cân ĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, cân xác định độ ẩm Precisa HA 60

− Máy xét nghiệm sinh hóa TC 84 plus của hãng Teco Diagnostics (Mỹ)

− Hệ thống máy ELISA hãng Bio-tek Instrument; máy điện di và chuyển màng Bio-rad

The cell culture system includes essential equipment such as the Sanyo incubator from Japan, the Telstar laminar hood, the Axiovert 25 CFL inverted microscope by Carl Zeiss from Germany, the Beckman Coulter centrifuge, the Shellab temperature stabilization unit from the USA, and the Thoma counting chamber from Germany.

Trong nuôi cấy tế bào in vitro, các loại vật tư tiêu hao rất quan trọng, bao gồm đĩa Petri, đĩa 6 giếng, đĩa 96 giếng, ống ly tâm Falcon 50 ml và 15 ml, 1,5 ml, cùng với pipet nhựa và các loại đầu côn Những vật liệu này hỗ trợ hiệu quả trong quá trình nuôi cấy và thí nghiệm tế bào.

Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Cao đặc VM (Chế phẩm VM)

Nghiên cứu đánh giá tác dụng giảm đau

Nghiên cứu đánh giá độc tính

Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm

Mô hình gây đau quặn bằng acid acetic 1%

Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm mạn

Nghiên cứu đánh giá độc tính cấp

Nghiên cứu đánh giá độc tính bán trường diễn

Mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan

Mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng cấy viên bông tẩm carageenan

Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm in vivo

Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm in vitro

Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm cấp

2.2.2 Nội dung nghiên cứu Để giải quyết mục tiêu đề ra, nghiên cứu gồm 3 nội dung chính:

Nội dung 1 : Đánh giá tác dụng giảm đau của chế phẩm VM trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic 1 % trên chuột nhắt trắng

Nội dung 2: Đánh giá tác dụng chống viêm của chế phẩm VM

 Đánh giá tác dụng chống viêm in vivo của chế phẩm VM:

− Đánh giá tác dụng chống viêm cấp của chế phẩm VM trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan 1 %

− Đánh giá tác dụng chống viêm mạn của chế phẩm VM trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng cấy viên bông tẩm carrageenan 1 %

 Đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của chế phẩm VM

Nội dung 3: Đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của chế phẩm VM.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Đánh giá tác dụng giảm đau của chế phẩm VM trên mô hình gây đau quặn sử dụng acid acetic 1 %

Nghiên cứu được thực hiện tại bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội nhằm đánh giá tác dụng giảm đau của chế phẩm VM Thí nghiệm sử dụng mô hình gây đau quặn bằng acid acetic 1% theo phương pháp của Kostler và cộng sự [48].

Bài nghiên cứu thực hiện trên 40 chuột nhắt, được chia thành 4 lô ngẫu nhiên: lô chứng trắng, lô chứng dương và các lô chế phẩm nghiên cứu với liều lượng khác nhau, mỗi lô gồm 10 con Tên mỗi lô được ký hiệu theo loại chế phẩm thử nghiệm là VM và liều lượng tương ứng của chế phẩm.

Lô 1: Lô chứng trắng (n = 10), chuột được uống natri carboxymethyl cellulose (NaCMC) 0,1 % với liều 0,1 ml/ 10 g cân nặng

Lô 2: Lô chứng dương (n = 10), chuột được uống Voltaren (diclofenac natri) với liều 36 mg/ g trước tiêm acid acetic 1 %

Lô 3 Lô VM-1, liều 1 (n = 10), chuột được uống chế phẩm VM liều 120 mg/kg

Lô 4 Lô VM-2, liều 2 (n = 10), chuột được uống chế phẩm VM liều 240 mg/kg

Trong nghiên cứu, chuột được cho uống NaCMC, Voltaren và chế phẩm nghiên cứu cùng một thời điểm 4 ngày trước khi thực nghiệm Trước khi sử dụng chế phẩm nghiên cứu 2 giờ, chuột được nhịn ăn nhưng vẫn được cung cấp nước Vào ngày thứ 5, sau khi uống NaCMC, Voltaren và chế phẩm nghiên cứu 30 phút, chuột được gây đau quặn bằng cách tiêm dung dịch acid acetic 1% với liều 0,1 ml/10g chuột Số cơn đau quặn được đếm liên tục trong từng 5 phút từ sau khi tiêm đến phút thứ 30, với biểu hiện là cơ bụng co lại và chi sau duỗi thẳng Thông số đánh giá là số cơn đau quặn ở từng thời điểm của các lô dùng chế phẩm nghiên cứu so với lô chứng dùng NaCMC nhằm đánh giá tác dụng giảm đau của chế phẩm.

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu tác dụng giảm đau theo mô hình gây đau quặn sử dụng acid acetic 1%

Ghi lại số cơn đau quặn mỗi 5 phút trong 30 phút

Tiêm màng bụng acid acetic 1%

2.3.2 Đánh giá tác dụng chống viêm của chế phẩm VM

2.3.2.1 Đánh giá tác dụng chống viêm in vivo của chế phẩm VM Đánh giá tác dụng chống viêm cấp in vivo của chế phẩm VM bằng mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan

Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của VM đã được thực hiện tại bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội, bằng cách sử dụng mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan theo phương pháp của Winter và cộng sự [81].

Chuột cống trắng Wistar được chia thành 4 lô, mỗi lô gồm 8 con, và được cho uống các mẫu nghiên cứu hàng ngày trong 3 ngày trước khi gây viêm Trước khi sử dụng chế phẩm nghiên cứu 2 giờ, chuột được nhịn ăn nhưng vẫn được cung cấp nước Vào ngày thứ 4, sau 30 phút uống chế phẩm, viêm bàn chân chuột được gây ra bằng cách tiêm 0,1 ml carrageenan 1% vào gan bàn chân sau bên phải Đồng thời, lô chứng trắng (uống dung môi NaCMC 0,1%) và lô chứng dương (uống diclofenac natri 36 mg/g) cũng được tiến hành để so sánh hiệu quả.

Lô 1 Lô chứng (n = 8), chuột được uống NaCMC 0,1 % với liều 1 ml/100g cân nặng

Lô 2 Lô chứng dương (n = 8), chuột được uống diclofenac natri với liều 36 mg/ g cân nặng

S c : số cơn đau của lô chứng trắng

S t : số cơn đau của các lô dùng Voltaren/chế phẩm VM

X %: tỷ lệ giảm đau của lô nghiên cứu so với lô chứng trắng

Lô 3 Lô VM-1, liều 1 (n = 8), chuột được uống chế phẩm VM với liều 75 mg/ g cân nặng

Lô 4 Lô VM-2, liều 2 (n=8), chuột được uống chế phẩm VM với liều 150 mg/ g cân nặng Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) bằng dụng cụ chuyên biệt vào các thời điểm trước khi gây viêm và các thời điểm sau khi gây viêm 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ,

7 giờ để đánh giá tác dụng của thuốc

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu hoạt tính chống viêm cấp in vivo của chế phẩm VM bằng mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan 1%

− Thể tích bàn chân sau phải của từng chuột

− Mức độ phù bàn chân của từng chuột được tính theo công thức của Fontaine:

V 0 , V t : thể tích chân chuột tại thời điểm t giờ sau và trước khi gây viêm

Gây viêm -0,5 giờ 0 giờ 1 giờ 3 giờ 5 giờ 7 giờ Đo thể tích chân chuột

Mức độ phù bàn chân chuột (% ∆V) được đo vào thời điểm t giờ sau khi gây viêm nhằm đánh giá tác dụng chống viêm mạn in vivo của chế phẩm VM Nghiên cứu sử dụng mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng cách cấy viên bông tẩm carrageenan 1%.

Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm mạn của VM qua đường uống được thực hiện tại bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội, sử dụng mô hình gây u hạt thực nghiệm với cấy viên bông tẩm carrageenan 1%.

Chuột cống trắng chủng Wistar được chia thành 4 lô ngẫu nhiên, mỗi lô gồm 10 con Tên mỗi lô được ký hiệu theo loại chế phẩm thử nghiệm là VM và liều lượng tương ứng.

Lô 1 Lô chứng trắng (n = 10), chuột được uống NaCMC 0.1 % với liều 1 ml/ 100g cân nặng,

Lô 2 Lô chứng dương (n = 10), chuột được uống prednisolon với liều 5 mg/kg,

Lô 3 Lô VM-1, liều 1 (n = 10), chuột được uống VM với liều 75 mg/kg,

Lô 4 Lô VM-2, liều 2 (n = 10), chuột được uống VM với liều 150 mg/kg

Vào ngày đầu tiên, tất cả chuột được gây mê bằng ether và sau đó gây viêm mạn tính bằng cách cấy viên bông tẩm carrageenan 1% (20 ± 2 mg bông cho mỗi con chuột) đã được tiệt trùng ở 60 độ C trong 2 giờ vào dưới da lưng của chuột cống trắng Sau khi cấy u hạt, chuột được cho uống chế phẩm VM, thuốc đối chiếu và NaCMC liên tục trong 7 ngày trước khi sử dụng chế phẩm.

− % ức chế phù của các lô nghiên cứu/lô chứng dương so với lô chứng được tính theo công thức:

X (%): Phần trăm ức chế phù của lô nghiên cứu/lô chứng dương so với lô chứng

Mức độ phù chân chuột trung bình ở lô chứng và lô nghiên cứu/lô chứng dương sau 2 giờ cho thấy sự thay đổi rõ rệt Chuột được nhịn ăn nhưng vẫn được cung cấp nước bình thường Vào ngày thứ 8, sau 5 giờ kể từ lần uống cuối cùng, chuột được giết bằng ether, tiến hành bóc tách u hạt và cân hối lượng ướt của hạt Sau đó, hạt được sấy ở 60 độ C trong khoảng 18 giờ cho đến khi hối lượng không đổi, và cuối cùng, hạt được cân lại sau khi sấy.

Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu hoạt tính chống viêm mạn in vivo của chế phẩm VM theo mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng cấy viên bông tẩm carrageenan 1 %

− Khối lượng u hạt tươi và khô của từng chuột:

Trong đó m 0 là khối lượng bông ban đầu, m 1 là khối lượng bông tươi, m 2 là khối lượng bông khô

− Tỷ lệ % độ giảm khối lượng u hạt của lô chế phẩm nghiên cứu so với lô chứng:

Uống mẫu nghiên cứu hàng ngày

Bóc tách, cân tươi, sấy khô u hạt (18 tiếng) và cân u hạt khô

Nhịn ăn, Uống mẫu nghiên cứu

Trong đó: m c : khối lượng trung bình khối u hạt lô chứng trắng m t : khối lượng trung bình khối u hạt lô chế phẩm nghiên cứu

X (%): tỷ lệ % độ giảm khối lượng u hạt của lô nghiên cứu so với lô chứng

2.3.2.2 Đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của chế phẩm VM

Chế phẩm VM đã được đánh giá tác dụng chống viêm in vitro thông qua khả năng ức chế COX-2 trên tế bào RAW264.7 được kích thích bằng LPS Nghiên cứu này được thực hiện tại phòng Dược lý phân tử, bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội.

Phương pháp nghiên cứu: sử dụng kỹ thuật Western Blot để bán định lượng

COX-2 được nghiên cứu trong tế bào RAW264.7, một loại tế bào đại thực bào chuột nhắt, sau khi ủ với mẫu nghiên cứu Dòng tế bào này được bảo quản trong nitơ lỏng và được kích hoạt, duy trì trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung 10% huyết thanh bê cùng với dung dịch kháng sinh và kháng nấm 1%, bao gồm penicillin 50,000 đơn vị/L và streptomycin.

Tế bào được nuôi cấy cho đến khi đạt khoảng 70% phát triển, sau đó thay môi trường sạch để tiến hành thí nghiệm Các mẫu nghiên cứu được pha chế dung dịch gốc trong DMSO với nồng độ 50 mg/ml, và các dung dịch này được pha loãng bằng môi trường nuôi cấy để đạt nồng độ cần thiết cho thử nghiệm.

Xử lý số liệu

Phân tích thống ê bằng phần mềm SPSS 20 Kết quả được biểu diễn dưới dạng

M ± SE (M: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn) được sử dụng để so sánh giá trị trung bình giữa các lô thông qua phân tích one-way ANOVA Nếu phương sai đồng nhất, áp dụng hậu kiểm LSD; nếu phương sai không đồng nhất, sử dụng Dunnett’s T3 để so sánh mẫu thử với mẫu chứng Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

KẾT QUẢ

BÀN LUẬN