Nghiên cứu quá trình phân hủy sinh học mủ cao su thải

TỔ NG QUAN

TỔNG QUAN NGÀNH CÔNG NGHIỆP SƠ CHẾ MỦ CAO SU

1.1.1 Lịch sử cây cao su và tình hình phát triển

Cao su (Hevea brasiliensis) là cây thân gỗ thuộc họ Đại kích (Euphorbiaceae) và có vai trò kinh tế quan trọng nhờ vào nhựa mủ-latex, nguồn nguyên liệu chính cho sản xuất cao su tự nhiên.

Cây cao su có thể cao trên 30 m và chứa nhựa mủ màu trắng hoặc vàng trong các mạch nhựa mủ ở vỏ cây, tạo thành xoắn ốc theo hướng tay phải với góc khoảng 30 độ Sau khi cây đạt 5-6 tuổi, quá trình thu hoạch nhựa mủ bắt đầu bằng cách rạch vuông góc với mạch nhựa mủ để nhựa chảy ra mà không làm hại cây Nhựa mủ được thu thập trong các bát nhỏ trong quá trình cạo mủ cao su Cây cao su già hơn sản xuất nhiều nhựa mủ hơn, nhưng sẽ ngừng sản xuất khi đạt tuổi 26-30 năm.

Cây cao su ban đầu chỉ mọc tại khu vực rừng mưa Amazon Cách đây gần

Trong suốt 10 thế kỷ, thổ dân Mainas đã sử dụng nhựa cây để tẩm vào quần áo nhằm chống ẩm ướt và tạo ra những quả bóng vui chơi trong các dịp lễ hội.

Họ gọi chất nhựa này là Caouchouk, theo Thổ ngữ Mainas nghĩa là “Nước mắt của cây” (cao là gỗ, uchouk là chảy ra hay khóc) [2]

Sự gia tăng nhu cầu và phát minh công nghệ lưu hóa vào năm 1839 đã kích thích sự phát triển mạnh mẽ của ngành cao su, đặc biệt làm giàu cho các thành phố Manaus và Belsem ở Brasil Việc thử nghiệm trồng cao su bên ngoài Brasil bắt đầu từ năm 1873, dẫn đến việc cây cao su được nhân giống rộng rãi tại các thuộc địa Anh Hiện nay, phần lớn diện tích trồng cao su tập trung ở Đông Nam Á và một số khu vực ở Châu Phi nhiệt đới.

Bùi Thị Trang 4 CNSH11B.KH

Theo thống kê của Hiệp hội nghiên cứu cao su Quốc tế -International

Theo nghiên cứu của Nhóm Nghiên cứu Cao su (IRSG), tính đến cuối năm 2011, Châu Á là khu vực tiêu thụ cao su thiên nhiên lớn nhất thế giới, chiếm tới 69,7% tổng nhu cầu toàn cầu Châu Âu đứng thứ hai với 13,5%, trong khi Bắc Mỹ chiếm 10,7% nhu cầu cao su thiên nhiên.

Nhóm 5 nước sản xuất cao su thiên nhiên lớn nhất thế giới là Thái Lan, Indonesia, Malaysia, Ấn Độ và Việt Nam (chiếm 82.39% trong tổng sản lượng sản xuất của thế giới, nhóm 5 quốc gia tiêu thụ cao su thiên nhiên lớn nhất thế giới là Trung Quốc (33.5%), Mỹ (9.5%), Ấn Độ (8.7%), Nhật Bản (6.6%) và Malaysia (4.6%) Bốn quốc gia xuất khẩu cao su thiên nhiên lớn nhất thế giới hiện nay là Thái Lan (gần 3 triệu tấn), Indonesia (2.13 triệu tấn), Malaysia (0.95 triệu tấn) và Việt Nam (0.82 triệu tấn), chiếm 87.35% tổng sản lượng xuất khẩu cao su thiên nhiên toàn cầu [1]

Từ năm 2000 đến 2011, tốc độ tăng trưởng diện tích trồng cao su thiên nhiên bình quân đạt 2,45% mỗi năm Hiện nay, tổng diện tích trồng cao su thiên nhiên trên toàn cầu ước tính đạt 9,57 triệu ha, tăng 3,5% so với năm 2010.

Cây cao su được người Pháp đưa vào Việt Nam lần đầu tiên tại vườn thực vật Sài Gòn năm 1878 nhưng không sống sót Đến năm 1892, 2000 hạt cao su từ Indonesia được nhập về, trong đó 1600 cây sống được phân phối cho các trạm thực vật, nổi bật là 1000 cây giao cho trạm Ong Yệm ở Bình Dương và 200 cây cho bác sĩ Yersin trồng thử ở Suối Dầu, gần Nha Trang Năm 1907, công ty cao su đầu tiên mang tên Suzannah được thành lập tại Dầu Giây, Đồng Nai, đánh dấu sự khởi đầu cho hàng loạt đồn điền và công ty cao su do người Pháp quản lý, chủ yếu tập trung ở Đông Nam Bộ như SIPH, SPTR, CEXO, Michelin, cùng với một số đồn điền tư nhân của người Việt.

Đến cuối năm 2011, Việt Nam xếp thứ 5 toàn cầu về sản lượng khai thác cao su thiên nhiên, chiếm khoảng 7.4% tổng sản lượng thế giới, và đứng thứ 4 về xuất khẩu cao su thiên nhiên, với thị phần đạt 9.7%.

Trong giai đoạn 2005-2011 diện tích trồng cao su của Việt Nam liên tục

Bùi Thị Trang 5 CNSH11B.KH cho biết, diện tích trồng cao su tại Việt Nam chủ yếu tập trung ở hai khu vực Đông Nam Bộ và Tây Nguyên Theo Quyết định số 750/QĐ-TTG và Quyết định số 124/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ, diện tích trồng cao su cả nước sẽ được duy trì ổn định ở mức 800.000 ha vào năm 2015 và có tầm nhìn đến năm 2020.

Bảng 1.1 Diện tích quy hoạch các vùng trồng cao su tại Việt Nam

Khu vực DT trồng mới (ha) DT quy hoạch 2020(ha) Đông Nam Bộ 25,000 390,000

Duyên hải Nam Trung Bộ 10,000-15,000 40,000

1.1.2 Thành phần và cấu trúc mủnước (latex)

Mủ nước (latex) là dung dịch trắng đục hoặc hơi vàng chảy ra từ cây cao su khi cạo, bao gồm các hạt cao su nhỏ lơ lửng trong nước Các hạt cao su có hình cầu, tạo thành một huyền phù keo Thành phần hóa học của mủ nước rất đặc biệt và quan trọng trong ngành công nghiệp cao su.

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của mủ nước [3] Độ pH của mủ nước: pH = 6.6-7

Thành phần trên sẽ thay đổi theo giống cây, tuổi cây, tình trạng chăm sóc, khí hậu, thổ nhưỡng…

Thành phần % Theo khối lượng

Cấu trúc của latex bao gồm hai phần chính: phần lỏng và phần rắn Phần lỏng chủ yếu là nước, kết hợp với một số hóa chất hòa tan trong nước, được gọi là serum.

Phần rắn trong serum bao gồm hạt cao su nguyên chất và các chất không tan trong nước, tạo thành hạt huyền phù lơ lửng Các hạt huyền phù này có cấu trúc hai lớp: lớp bên trong chứa cao su nguyên chất, trong khi lớp bên ngoài bao gồm protein và lipid, giúp các hạt không dính vào nhau Khi lớp ngoài này bị phá hủy, hiện tượng đông tụ sẽ xảy ra.

Tỷ trọng của mủ nước trong khoảng 0.8-0.975g/ml Tỷ trọng của cao su 0.914g/ml, tỷ trọng của serum 1.02g/ml [3]

1.1.3 Phân biệt cao su thiên nhiên và cao su tổng hợp

Cao su thiên nhiên là một polymer có nguồn gốc từ mủ cao su, với isoprene (C5H8) là monomer ban đầu Các phân tử isoprene liên kết với nhau qua phản ứng trùng ngưng tại vị trí 1,4, tạo thành chuỗi dài có cấu trúc đặc trưng.

Hình 1.1 Cấu tạo cao su thiên nhiên [3]

Cao su tổng hợp được sản xuất thông qua phản ứng trùng ngưng các cấu trúc đơn như 1,3-butadien, cloropren và isobutylen, cùng với một lượng nhỏ isoprene để tạo liên kết chuỗi Việc điều chỉnh tỷ lệ các cấu trúc này cho phép tạo ra phản ứng đồng trùng hợp, từ đó tạo ra các loại cao su tổng hợp với các đặc tính vật lý, cơ học và hóa học đa dạng.

MỦ THẢI CAO SU THIÊN NHIÊN

Mủ cao su được phân chia thành nhiều loại, bao gồm mủ nước, mủ chén và mủ đất Trong số đó, mủ nước được coi là loại tốt nhất, được thu trực tiếp từ thân cây trong khoảng thời gian quy định mỗi ngày Để đảm bảo chất lượng mủ nước không bị giảm sút trước khi đưa về nhà máy, người thu mủ thường sử dụng chất chống đông và thực hiện các biện pháp ngăn chặn sự oxy hóa Việc phân loại mủ nước được thể hiện trong bảng 1.3.

HCOOH/CH3COOH Nước rửa bể Đánh đông

H2O, CH4 Nước xả, mủ vụn

Nước xả, mủ vụn Nước xả, mủ vụn Sàn rung

Máy sấy Làm nguội, Ép Sản phẩm

Mủ tạp, bao gồm các loại như mủ đất, mủ chén, và mủ vỏ, thường chứa nhiều tạp chất như đất, cát và các chất lạ khác Trước khi được đưa về nhà máy, mủ tạp thường đã đông lại Phân loại mủ tạp được trình bày chi tiết trong bảng 1.4.

Bảng 1.3 Bảng phân loại mủ nước [3]

Chỉ tiêu Loại 1 Loại 2 Loại 3

Tạp chất Rất trắng Có lẫn vỏ cây, lá cây Có lẫn vỏ cây, lá cây

Màu Trắng sữa Hơi vàng Vàng

Trạng thái Lỏng tự nhiên, qua lưới 60

Chấm đông li ti, qua lưới 40 Đông lợn cợn

NH3 0.01-0.03% tính theo trọng lượng latex

Bảng 1.4 Bảng phân loại mủ tạp [3]

Chỉ tiêu Loại 1 Loại 2 Loại 3

Màu sắc Trắng Vàng xám Xám đen

Tạp chất Ít lẫn vỏ cây, lá cây

Lẫn nhiều vỏ cây, lá cây

Lẫn nhiều vỏ cây, đất cát Trạng thái cao su Mềm, xốp Cứng Cứng có mùi hôi

Thời gian tồn trữ 1 tháng

Mủ thải trong quá trình sản xuất chủ yếu phát sinh từ các công đoạn như đánh đông, cán, cắt và kéo sản phẩm Mặc dù mủ thải được thu gom để tái chế, vẫn còn một lượng mủ chưa được thu gom tồn tại trong nước thải của quá trình sơ chế Ước tính cho thấy lượng mủ thải này có ảnh hưởng đáng kể đến môi trường.

Bùi Thị Trang 9 CNSH11B.KH chế chiếm khoảng 2-3% tổng nguyên liệu đầu vào (số liệu thực tế tại nhà máy sơ chế cao su Cẩm Thủy).

VI SINH VẬT PHÂN HỦY CAO SU

1.3.1 Sự phân hủy cao su bởi vi khuẩn và xạ khuẩn

Trong suốt 100 năm qua, nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy mủ cao su thải đã đạt được nhiều tiến bộ, với một số vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân hủy cao su được phát hiện Tuy nhiên, quá trình phân hủy sinh học vẫn diễn ra chậm Một thành tựu quan trọng trong nghiên cứu này là phương pháp phân lập vi sinh vật trên đĩa thạch hai lớp, với lớp dưới là môi trường muối khoáng và lớp trên là cao su Sự phát triển của một số chủng vi sinh vật trên cao su thiên nhiên đã dẫn đến việc giảm đáng kể khối lượng cao su và trọng lượng phân tử trung bình của polymer Dù vậy, không phải tất cả các vi khuẩn có khả năng phân hủy cao su đều được phát hiện.

Vi sinh vật phân hủy mủ cao su được chia thành hai nhóm dựa trên khả năng sinh trưởng và các đặc tính khác nhau Nhóm đầu tiên là xạ khuẩn, có khả năng phân giải khi được nuôi cấy trên môi trường thạch mủ cao su và chuyển hóa các polyisoprene Hầu hết các xạ khuẩn trong nhóm này, như Streptomyces và Micromonosporas, phát triển tương đối yếu trên cao su tự nhiên và cao su tổng hợp.

Nhóm thứ 2 của vi sinh vật không có vòng phân giải và không phát triển trên môi trường thạch mủ cao su, nhưng lại phát triển trên cao su như một chất kết dính cần thiết Các chủng trong nhóm này, thuộc họ corynebacterium-Nocardia-Mycobacterium, phát triển mạnh trên polyisoprene Đáng chú ý, một số chủng mới phân hủy cao su, như Gordonia polyisoprenivorans, cũng thuộc nhóm này.

VH2 và Y2K, cùng với chủng G.wesfalica Kb1 và Mycobacterium fortuitum NF4, đã được phân lập gần đây Các loài thuộc chi Gordonia nổi bật với khả năng phân hủy cao su Mặc dù sự phân hủy sinh học của cao su lưu hóa có thể diễn ra, nhưng quá trình này gặp nhiều khó khăn hơn so với cao su tự nhiên.

Một số chủng vi khuẩn và xạ khuẩn phân hủy mủ cao su thải

 Phân hủy cao su bởi Gordonia sp

Sự xuất hiện của oligomers isoprene chứa nhóm aldehyde và ketone sau khi nuôi cấy găng tay cao su với G polyisoprenivorans và một số vi khuẩn khác cho thấy sự phân hủy của polyisoprene Số lượng liên kết đôi trong chuỗi polyisoprene giảm, được chứng minh qua việc nhuộm với thuốc thử Schiff và phân tích bằng quang phổ hồng ngoại, cho thấy sự phân cắt các phân tử polyisoprene đã xảy ra.

Phân tích đột biến plasmid của chủng G westfalica Kb1 cho thấy chủng này không còn khả năng phát triển trên cao su thiên nhiên như nguồn cacbon duy nhất Các gen tại vị trí 101 kbp của megaplasmid chứa 105 khung đọc mở, đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy cao su.

 Phân hủy cao su bởi Nocardia sp 835A

Nocardia sp 835A là chủng vi khuẩn đầu tiên được nghiên cứu chi tiết về khả năng phân hủy cao su, phát triển tốt trên cả cao su thiên nhiên và cao su tổng hợp Các thí nghiệm cho thấy găng tay cao su mất đến 75% khối lượng sau 2 tuần và 100% sau 8 tuần nuôi cấy Phân tích sản phẩm phân hủy bằng sắc ký lọc gel cho thấy hai phân đoạn với trọng lượng phân tử lần lượt là 1x10^4 và 1,6x10^3 Da, tương ứng với 114 và 19 phân tử isoprene Cả hai phân đoạn này đều được xác định là dẫn xuất của dolichol aldehyde thông qua phân tích quang phổ hồng ngoại và cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR).

( 13 C-NMR), chúng gồm các nhóm aldehyde và ketone và có công thức sau đây:

OHC-CH2[CH2-C(-CH3)SH-CH2]n-CH2-C(O)-CH3

Tuy nhiên, những nghiên cứu phân hủy sinh học cao su của chủng này không được tiếp tục ở mức độ hóa sinh cũng như mức độ phân tử [9]

 Phân hủy cao su của Streptomyces sp

Các loài thuộc chi Streptomyces được nghiên cứu nhiều trong quá trình phân hủy sinh học cao su Hàm lượng protein trong môi trường nuôi cấy S coelicolor 1A với mủ cao su thiên nhiên đã tăng từ 240 μ/ml lên 620 μ/ml sau 10 tuần Phân tích GPC sau 6 tuần cho thấy cao su còn lại có phổ phân bố khối lượng từ khoảng 800 kDa đến 2x10^4 Da Nghiên cứu sản phẩm phân hủy cao su đã phát hiện một số hợp chất, trong đó có ba hợp chất đáng chú ý.

Bùi Thị Trang 11 CNSH11B.KH đã được xác định bằng quang phổ 1 H-NMR hai chiều với các hợp chất gồm: axit 2,6-dimethyl-10-oxo-undec-6-enoic, 5,6-methyl-undec-5-ene-2,9-dione, và 5,9-6,10-dimethyl-pentadec-5,6,9-diene-2,13-dione Tuy nhiên, chủng này đã trải qua quá trình xử lý đột biến bằng tia.

UV thì không còn KNPH cao su [20]

Chủng Streptomyces sp K30 là một loại vi khuẩn có khả năng phân hủy cao su (KNPH) cao, và sau khi trải qua quá trình đột biến bằng tia UV, vẫn duy trì được khả năng này Gen lcp trong chủng Streptomyces sp K30 được xác định là yếu tố quan trọng trong quá trình phân hủy cao su Việc tách dòng gen lcp từ chủng Streptomyces sp K30 và biểu hiện thành công trên chủng S lividans TK23 đã mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc ứng dụng vi khuẩn này trong xử lý cao su.

Chủng này vẫn giữ được KNPH cao su [23]

 Phân hủy cao su bởi Xanthomonas sp 35Y

Chủng vi khuẩn Xanthomonas sp 35Y là một loại vi khuẩn gram âm, có khả năng phân giải cao su thiên nhiên, giảm tới 60% trọng lượng sau 7 ngày nuôi cấy Các sản phẩm phân hủy của nó bao gồm các hợp chất có trọng lượng phân tử dưới 10^4 và 10^3, với khoảng 113 đơn vị isoprene và chỉ 2 đơn vị tương ứng Phân tích 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy các sản phẩm phân hủy này có cấu trúc phân tử tương tự như sản phẩm từ chủng Nocardia sp 835A Hơn nữa, phân tích sắc khí (GC) và khối phổ (MS) xác định rằng các hợp chất ở phân đoạn có trọng lượng phân tử thấp là acetonyldiprenylacetoaldehyde.

Chủng Xanthomonas sp 35Y có chứa gen roxA được cho là chìa khóa của sự phân hủy cao su của nhóm vi khuẩn gram âm [14, 28]

1.3.2 Sự phân hủy cao su bởi nấm

Năm 1980, Kuwiakowska đã thực hiện thí nghiệm với cao su tổng hợp, phát hiện rằng hơn 40% khối lượng cao su bị giảm khi chôn các miếng cao su trong môi trường ẩm, tạo điều kiện cho nấm phát triển trên bề mặt.

Năm 1982, các nghiên cứu về sự phân hủy của cis-1,4-polyisoprene bởi nấm đã được công bố, trong đó các tác giả đã trình bày các thí nghiệm với chủng nấm mốc Penicillium variabile Chủng nấm này được phân lập từ các miếng cao su thiên nhiên và cao su tổng hợp đã bị phân hủy.

Bùi Thị Trang 12 CNSH11B.KH đã tiến hành thí nghiệm chôn các bào tử dưới đất, sau đó cấy chúng lên các tấm cao su đã được sấy khô Các tấm cao su này được đặt trong môi trường ẩm để thúc đẩy sự phát triển của sinh khối Qua 14 ngày quan sát tế bào protein, không thể xác định mối tương quan giữa sự gia tăng sinh khối của nấm và sự sụt giảm khối lượng của các tấm cao su.

Các phương pháp phân tích quang phổ trên miếng cao su bị phân hủy bởi nấm không phát hiện sự thay đổi nào về cấu trúc hóa học Các tác giả cho rằng nấm chỉ tấn công vào các chuỗi polymer đoạn cuối, tạo ra chuỗi trung gian và phát triển nhờ vào sản phẩm này Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng một số chủng nấm như Fusarium solani, Cladosporium cladosporioides và Paecilomyces lilacinus không thể phân lập trên môi trường thạch agar khi cao su là nguồn cacbon duy nhất Sau 20 ngày nuôi cấy trong môi trường lỏng và trên thạch có phủ mủ cao su, đã ghi nhận sự sụt giảm 20% khối lượng cao su Kết quả cho thấy các chủng nấm này sẽ ngừng phân hủy sau một thời gian.

30 ngày và không có sự gia tăng về sinh khối [26].

CON ĐƯỜNG PHÂN HỦY MỦ CAO SU

Hiện nay, hai enzyme quan trọng trong quá trình phân hủy cao su thiên nhiên đã được phát hiện Đầu tiên là enzyme Lcp (latex-clearing protein), mã hóa bởi gen lcp, được tìm thấy trong chủng Streptomyces sp K30 Enzyme này giúp phân hủy poly(cis-1,4-isoprene) thành các dẫn xuất oligo(cis-1,4-isoprene) chứa nhóm aldehyde, ketone và acid thông qua enzyme Oxidoreductase OxiAB, được mã hóa bởi gen oxiAB, bên cạnh gen lcp Nghiên cứu gần đây của Yikmis và cộng sự (2008) cho thấy enzyme Lcp tham gia vào quá trình chuyển vị trí nối đôi arginine trong phân hủy Gen lcp cũng được phát hiện trong Nocardia farcinia E1, Gordonia polyisopreneivorans VH2 và Gordinia westfalica Kb1, cho thấy vai trò của chúng trong chuyển hóa poly(cis-1,4-isoprene).

Enzyme RoxA (rubber-cleavage-oxygenase) được phát hiện trong chủng Xanthomonas sp 35Y, có vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy mủ cao su bằng cách cắt nối đôi poly(cis-1,4-isoprene) thành các dẫn xuất oligo(cis-1,4-isoprene) chứa nhóm aldehyde và ketone, như 12-oxo-4,8-dimethyltrideca-4,8-diene-1-al Mặc dù RoxA và Lcp có chức năng tương tự, nhưng trình tự amino axit của chúng lại khác biệt.

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KNPH MỦ CAO SU BỞI VI SINH VẬT

1.5.1 Quan sát sự phát triển của vi sinh vật trên bề mặt thạch MSM có bổ sung DPNR và nhuộm Schiff sản phẩm phân hủy

Vi sinh vật phát triển mạnh trên bề mặt thạch của môi trường khoáng MSM bổ sung DPNR, với vòng sáng xung quanh khuẩn lạc là dấu hiệu nhận biết vi sinh vật có khả năng phân hủy mủ cao su Imai và cộng sự (2011) đã phân lập thành công các chủng vi sinh vật như Streptomyces sp LCIC4, Actinoplanes sp OR16 và Methylibium sp NS21 từ mẫu đất, cho thấy khả năng phân hủy cao đối với cả cao su thiên nhiên và cao su tổng hợp.

Quá trình phân hủy cao su tạo ra các sản phẩm như aldehyte và ketone Để phát hiện sự xuất hiện của chúng, thuốc nhuộm Schiff được sử dụng như một phương pháp nhận biết hiệu quả.

Bùi Thị Trang 14 CNSH11B.KH đã nghiên cứu về aldehyte và ketone thông qua cơ chế bắt màu của thuốc nhuộm Schiff, đây cũng là dấu hiệu nhận biết vi sinh vật có khả năng sản xuất polyme cao su Yikmis và cộng sự (2008) đã sử dụng đặc điểm này để xác định Streptomyces sp K30, cho thấy chủng này vẫn duy trì khả năng sản xuất cao su sau khi trải qua đột biến.

Nghiên cứu của Broker và cộng sự (2008) đã xác định rằng chủng Streptomyces lividans TK23 tái tổ hợp có khả năng tạo ra KNPH mủ cao su tốt thông qua kết quả nhuộm Schiff Tuy nhiên, không phải tất cả các chủng có KNPH tốt đều bắt màu thuốc nhuộm Schiff, vì có thể chúng đã phân hủy poly(cis-1,4-isoprene) thành các sản phẩm thấp hơn Imai và cộng sự (2011) đã tiến hành nhuộm Schiff các sản phẩm phân hủy từ các chủng Streptomyces sp LCIC4, Actinoplanes sp OR16 và Methylibium sp NS21, cho thấy chỉ có Methylibium sp NS21 bắt màu thuốc nhuộm Schiff, trong khi hai chủng còn lại không tạo ra màu sắc.

1.5.2 Quan sát sự thay đổi bề mặt của cao su bằng mắt thường và kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Sự thay đổi bề mặt của miếng cao su sau khi bổ sung vi sinh vật có thể được nhận biết bằng mắt thường, khi vi sinh vật bám trên bề mặt để sinh trưởng và phát triển Sử dụng chụp hiển vi điện tử quét với độ phóng đại lớn sẽ xác nhận rõ ràng sự thay đổi này so với mẫu kiểm chứng Nghiên cứu của Claudia Gallert (2000) đã chỉ ra sự biến đổi bề mặt của miếng găng tay cao su sau 70 ngày nuôi cấy với Streptomyces La7 bằng phương pháp SEM.

Năm 2006, nghiên cứu đã đánh giá khả năng phân hủy của các chủng Gordonia polyisoprenivorans VH2, Norcadia takedensis WE30 và Norcadia nova L1b thông qua việc quan sát sự thay đổi bề mặt cao su sau 5 tuần nuôi cấy bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) Tương tự, Watcharakul và cộng sự vào năm 2012 cũng đã sử dụng SEM để nhận diện sự thay đổi bề mặt của miếng găng tay cao su sau 4 tuần nuôi cấy với Streptomyces coelicolor CH13.

1.5.3 Khảo sát sự giảm khối lượng của cao su sau thời giannuôi cấy

Khối lượng cao su giảm là minh chứng rõ ràng nhất cho khả năng phân hủy sinh học của vi sinh vật Nghiên cứu của Tsuchii và cộng sự vào năm 1996 đã chỉ ra ảnh hưởng của kích thước đến quá trình này.

Bùi Thị Trang 15 CNSH11B.KH đã nghiên cứu sự giảm khối lượng của găng tay cao su thuộc chủng Norcadia sp 835A, cho thấy rằng KNPH của những miếng găng tay này tỷ lệ thuận với diện tích bề mặt trên mỗi đơn vị khối lượng Khi nuôi cấy với các miếng găng tay mỏng và rộng, chủng này phát triển nhanh chóng và phân hủy hiệu quả, trong khi các miếng ngắn và hẹp phân hủy chậm hơn Claudia Gallert (2000) đã áp dụng phương pháp tương tự để đánh giá KNPH của Streptomyces La7, với kết quả cho thấy khối lượng găng tay giảm 30% sau 70 ngày nuôi cấy Watcharakul và cộng sự (2012) cũng đã khảo sát điều kiện tối ưu cho quá trình phân hủy găng tay cao su của Streptomyces coelicolor CH13 bằng cách đánh giá sự giảm khối lượng găng tay ở các điều kiện khác nhau.

1.5.4 Khảo sát sự tăng sinh khối trong quá trìnhnuôi cấy với cao su

Vi sinh vật có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trong môi trường chứa nguồn cacbon là cao su, cho thấy chúng có khả năng đồng hóa hoặc phân hủy cao su thành các sản phẩm có khối lượng thấp hơn, ngoại trừ vi sinh vật tự dưỡng Sự phát triển mạnh mẽ của vi sinh vật chứng tỏ khả năng phân hủy cao su của chúng Phương pháp xác định nitơ tổng số sử dụng Kjeldahl và xác định phần trăm cũng được áp dụng trong nghiên cứu này.

CO2 thải ra trong quá trình hô hấp là một chỉ số quan trọng để đánh giá sự phát triển của vi sinh vật Nghiên cứu của Ibrahim và cộng sự vào năm 2006 đã chỉ ra rằng khí CO2 có thể được sử dụng để phân tích hoạt động của chủng Norcadia farcinia.

Nghiên cứu của Watcharakul và cộng sự (2012) về Thermomonospora curvata đã áp dụng phương pháp KNPH để đánh giá sự tăng sinh khối của chủng Streptomyces coelicolor CH13 trong quá trình nuôi cấy với cao su.

1.5.5 Bước đầu khảo sát các sản phẩm tạo thành của quá trình phân hủy

Sản phẩm từ quá trình phân hủy mủ cao su vẫn còn là điều chưa được khám phá hoàn toàn Tuy nhiên, có nhiều phương pháp khác nhau để xác định các sản phẩm này.

GPC là phương pháp giúp đánh giá mức độ phân hủy của các chủng dựa vào hình ảnh xuất hiện khi chạy sắc ký lọc gel, từ đó có thể dự đoán kích thước sản phẩm một cách chính xác.

Bùi Thị Trang 16 CNSH11B.KH đã tiến hành phân hủy tương ứng với hình ảnh đó, từ đó cho phép so sánh khả năng phân hủy giữa các chủng Nghiên cứu của Ibrahim và cộng sự vào năm 2006 đã sử dụng GPC để phân tích sản phẩm từ quá trình phân hủy mủ cao su bởi các chủng Norcadia farcinia và Thermomonospora curvata Ngoài ra, Broker và cộng sự vào năm 2008 cũng đã đánh giá khả năng phân hủy của các chủng này.

Streptomyces lividans TK23 tái tổ hợp sau 8 tuần nuôi cấy với 0.25% cao su và 0.5% glucose cũng đã dùng GPC để xác định khối lượng của sản phẩm phân hủy

[11] Imai và cộng sự, 2011 dùng GPC để phân tích sản phẩm của quá trình phân hủy găng tay cao su bởi các chủng Streptomyces sp LCIC4, Actinoplanes sp

Chủng OR16 và Methylibium sp NS21 có khả năng phân hủy cao su thiên nhiên và cao su tổng hợp Phân tích GPC cho thấy sau 50 ngày nuôi cấy, chủng LCIC4 tạo ra sản phẩm với trọng lượng phân tử 23 KDa, trong khi OR16 tạo sản phẩm 12 KDa, và NS21 vẫn giữ sản phẩm khoảng 400 KDa, tương ứng với poly(cis-1,4-isoprene) Kết quả cho thấy NS21 phân hủy yếu hơn so với LCIC4 và OR16 sau 50 ngày, nhưng đến 70 ngày, NS21 xuất hiện sản phẩm với trọng lượng phân tử 13 KDa.

VẬ T LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1.1 Mẫu nước thải, mủ thải, đất lấy từ nhà máy chế biến mủ cao su Cẩm

Mẫu nước thải, mủ thải, đất được lấy từ các địa điểm khác nhau trong nhà máy (thời gian 10/2010 – 8/2011)

2.1.1.2 Mẫu nước bùn hoạt hóa trong bể nuôi chứa mủ cao su (Enrichment)

Bể bùn hoạt hóa vi sinh vật là một bể sục khí quy mô phòng thí nghiệm có dung tích từ 3-4 lít, chứa hỗn hợp vi sinh vật được lấy từ nước và đất tại nhà máy chế biến mủ cao su Cẩm Thủy - Thanh Hóa Bể được sục khí liên tục 24/24, đồng thời bổ sung đầy đủ khoáng chất theo công thức môi trường mineral salt medium (MSM) và mủ cao su thiên nhiên để cung cấp nguồn cacbon cho vi sinh vật Các chất khoáng được bổ sung định kỳ hàng tháng nhằm đảm bảo sự phát triển tối ưu của vi sinh vật Để thống nhất trong việc gọi tên, mẫu nước bùn hoạt hóa trong bể nuôi chứa cao su sẽ được gọi là mẫu Enrichment.

Hình 2.1 Bể bùn hoạt hóa Enrichment

2.1.2 Cơ chất thử KNPH cao su của vi sinh vật

2.1.2.1 Cao su tổng hợp (SR: Synthetic Rubber)

Cao su tổng hợp: Poly(cis-1,4-isoprene) (Sigma-Aldrich, St Loui, Mo.)

2.1.2.2 Găng tay cao su thiên nhiên (LG: Latex Glove)

Găng tay cao su thiên nhiên: Merufa (Công ty cao su y tế, Bình Dương)

2.1.2.3 Cao su loại protein dạng lỏng (Deproteinized natural rubber: DPNR)

Hình 2.2 Quy trình tạo cao su loại protein

2.1.2.4 Cao su loại protein dạng màng

DPNR lỏng được đổ vào đĩa petri và sấy ở nhiệt độ 50°C cho đến khi đạt khối lượng không đổi, từ đó xác định hàm lượng cao su khô (DRC) bằng cách cân trước và sau Tiếp theo, cắt thành các miếng có kích thước 1x1 cm với khối lượng từ 20-25 mg.

 Máy lắc ổn nhiệt (Shellab, Mỹ), máy ổn nhiệt (Grant, Anh)

 Máy li tâm lạnh (Eppendorf, Đức)

 Máy li tâm Eppendorf – centrifuge 5417R (Eppendorf, Đức)

 Máy Vortex - Minishaker (KikaWorks, Asia)

 Nồi hấp tiệt trùng (Hirayama, Nhật)

 Tủ cấy vô trùng (Esco, Anh)

 Máy đo pH (Mettler Toledo, MP 220, Thuỵ Sĩ)

 Hộp peptri, ống nghiệm và bình tam giác 250ml, bình schott

Ly tâm tách cream 10,000 vòng/phút, t o phòng

 Kính hiển vi điện tử

Bảng 2.1 Môi trường khoáng MSM

Môi trường LB 1/5 (Luria-Bertani Broth)

Bảng 2.2 Môi trường hoạt hóa LB 1/5

 Chuẩn bị 2 bình Scott có chứa 200 và 400ml môi trường muối khoáng (MSM) + 15% Agar

 Đổ bình 400 ml ra các đĩa thạch khoảng 16 ml/đĩa, tạo lớp 1(đáy)

 Bổ sung 1 ml mủ cao su (latex) vào bình 200 ml giữ ở 50 o C

 Bổ sung 15 ml cyclohemide được lọc với màng lọc 0.2 àm

 Đổ bình 200 ml lên các đĩa thạch có lớp 1 khoảng 8 ml/đĩa tạo lớp 2

 Làm khô trong tủ vô trùng

 Hóa chất dùng tách chiết DNA như: enzyme Protein K, lyzozyme,… (Merck, Nhật)

 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR: Mồi rP2, 907, 518, Master mix…(Sigma, Nhật)

 Các loại hóa chất khác dùng trong phân lập, nuôi cấy…(Merck, Nhật)

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu

Thạch MSM 2 lớp Vòng sáng quanh khuẩn lạc Đánh giá khả năng phân hủy:

Một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng phân hủy:

Mẫu nước thải Mẫu mủ thải Mẫu Enrichment

Nhà máy sơ chế mủ cao su Cẩm Thủy

Chủng vi sinh vật phân hủy cao su

Mẫu nước thải, mủ thải và đất được thu thập từ nhà máy sơ chế mủ cao su Cẩm Thủy trong khoảng thời gian từ 10/2010 đến 8/2011, sau đó được pha loãng và nuôi cấy trên môi trường MSM 2 lớp với 0.5% DPNR Các chủng vi sinh vật phát triển tốt trên bề mặt thạch và có vòng sáng quanh khuẩn lạc được lựa chọn và làm sạch qua nhiều lần cấy chuyển Những chủng vi sinh vật phân hủy cao su này được xác định tên bằng kỹ thuật sinh học phân tử 16S rDNA và gen lcp Tiếp theo, các chủng được thử nghiệm khả năng phân hủy cao su tự nhiên (KNPH) với DPNR lỏng, SR, DPNR màng và găng tay cao su thiên nhiên Dựa vào kết quả thử nghiệm, nghiên cứu sẽ khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến KNPH của mẫu DPNR từ chủng NMD1 và mẫu Enrichment.

2.2.2.1 Phân lập vi sinh vật có KNPH mủ cao su

Phương pháp phân lập trên môi trường rắn sử dụng môi trường thạch hai lớp, trong đó cao su là nguồn carbon duy nhất.

 Mẫu lỏng: Pha loãng 1 ml mẫu nước thải trong 9ml nước cất vô trùng, trộn đều

 Mẫu rắn: Pha loãng 3 g mẫu mủ thải rắn trong 9ml nước cất vô trùng, trộn đều

Cấy chang là quá trình cấy đều 100 µl mẫu rắn hoặc lỏng lên môi trường thạch hai lớp, thực hiện trên ngọn lửa đèn cồn trong tủ cấy vô trùng Sau đó, mẫu được nuôi ở nhiệt độ 30°C và theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc.

Cấy ria là quá trình chuyển các khuẩn lạc, bao gồm cả khuẩn lạc có vòng và không vòng, từ môi trường thạch cao su sang đĩa thạch mới Các thao tác cấy chuyển cần được thực hiện nhiều lần và phải được tiến hành dưới ngọn lửa và trong tủ cấy vô trùng để đảm bảo môi trường sạch sẽ Sau khi cấy chuyển, mẫu được nuôi ở nhiệt độ 30 độ C và theo dõi sự phát triển.

 Cấy các chủng vi sinh vật lên đĩa thạch cao su 2 lớp

 Làm mẫu kiểm chứng song song với mẫu thí nghiệm

 Sử dụng 3 ml thuốc thử Schiff nhỏ lên mặt môi trường của đĩa

 Để tĩnh 30 phút cho đến khi thu được màu đỏ tía

 Dùng dung dịch Sulfite để rửa mặt thạch 2 lần

 Vi sinh vật được cấy trên đĩa thạch LB 1/5, được nuôi ở 30 0 C, 3 ngày

Để chuẩn bị tiêu bản vi sinh vật, đầu tiên lấy một vòng que cấy vi sinh vật từ đĩa thạch Sau đó, nhỏ một giọt nước cất đã được thanh trùng lên tiêu bản và dàn đều vi khuẩn trong nước Cuối cùng, sử dụng ngọn lửa đèn cồn để làm khô tiêu bản.

Nhuộm mẫu bằng dung dịch tím violet trong 1 phút, sau đó rửa bằng nước cất Tiếp theo, nhuộm bằng Lugol trong 1 phút và rửa bằng cồn 96 độ, rồi rửa lại bằng nước cất đã thanh trùng Cuối cùng, nhuộm bằng Fuchsin trong 30-60 giây, rửa lại bằng nước cất và để khô trước khi soi dưới vật kính dầu (100x).

 Khảo sát khảnăng phát triển trong MSM có bổ sung DPNR lỏng

 Chuẩn bị ống nghiệm sạch, khô có nắp đậy (nắp thông khí) bọc kín bằng giấy bên trong chứa khoảng 5ml MSM và thanh trùng 121 0 C, 20 phút

 Bổ sung vào ống nghiệm 0.5% DPNR và 10% (v/v) vi sinh vật đã được hoạt hóa trong LB 1/5 lỏng trong 3 ngày

 Quan sát, đánh giá khả năng phát triển sau 14 ngày nuôi ở 30 0 C

2.2.2.2 Định tên các chủng lựa chọn bằng kĩ thuật sinh học phân tử 16S-rDNA

Khuẩn lạc được kích hoạt trong môi trường LB 1/5 ở nhiệt độ 30 độ C với tốc độ lắc 150 rpm trong 3-4 ngày Sau đó, 2ml canh trường được ly tâm ở tốc độ 10,000 rpm trong 10 phút ở 4 độ C để thu nhận sinh khối ướt, chuẩn bị cho quá trình tách chiết DNA.

 Thờm 400àl đệm TE và 20àl enzyme lysozyme, đảo trộn nhẹ nhàng sau đó ủ 37 0 C trong 1h

 Thờm 30àl SDS 10% và 10àl enzyme protein kinase, đảo trộn nhẹ nhàng ủ 37 0 C trong 1h

 Thờm 100àl NaCl 5M đảo trộn đều sau đú thờm 80àl CTAB/NaCl

Bùi Thị Trang 25 CNSH11B.KH đảo trộn và ủ 65 0 C trong 10 phút

 Thờm 750 àl CIAA sau đú li tõm 10,000 rpm trong 5 phỳt

 Hỳt 400 àl dịch nổi sang ống eppendof mới sau đú thờm 400 àl isopropanol, đảo trộn nhẹ nhàng, li tâm 10,000 rpm trong 5 phút, đổ dịch nổi

 Thờm 1000 àl cồn 70%, đảo trộn mạnh bằng vortex, li tõm 10,000 rpm trong 2 phút, đổ dịch nổi

Li tâm nhanh để loại bỏ dịch còn lại, sau đó mở ống trong khoảng 5 phút Tiến hành hòa tan kết tủa DNA trong 50 µl H2O deion hóa và ủ ở nhiệt độ 65°C trong 5 phút.

 Kiểm tra chất lượng DNA bằng đo quang và điện di trên gel agarose 0,8%

 Thành phần của phản ứng PCR 16S rDNA:

DNA (nồng độ ~100 ng/àl) 1 àl

 Phản ứng được tiến hành với chu trình nhiệt như sau:

Tinh sạch sản phẩm sau PCR theo Kit Primer 5 (Beckman Coulter)

Cột tinh sạch được bảo quản trong ống 2ml, sau đó thêm 500 µl đệm BL vào cột Tiến hành ly tâm ở tốc độ 12,000 rpm trong 1 phút tại nhiệt độ phòng, rồi đổ dịch từ cột trở lại ống.

 Thờm 50 àl sản phẩm sau PCR và 250 àl đệm PD vào ống eppendof

Bùi Thị Trang 26 CNSH11B.KH mới, cho hỗn hợp này lên cột, ủ 2 phút, li tâm 12,000 rpm trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, đổ dịch cho lại cột vào ống

 Thờm 700 àl đệm PW lờn cột, li tõm 12,000 rpm trong 1 phỳt ở nhiệt độ phòng, đổ dịch cho lại cột vào ống

 Thờm 500 àl đệm PW lờn cột, li tõm 12,000 rpm trong 1 phỳt ở nhiệt độ phòng nhằm loại bỏ hết đệm rửa, đổ dịch cho lại cột vào ống

 Mở nắp để khụ, chuyển cột sang eppendof mới, thờm 50 àl nước deion thanh trùng lên cột ủ 2 phút li tâm 12,000 rpm trong 1 phút ở nhiệt độ phòng

PCR giải trình tự sử dụng DTCS Quick Start Kit (Beckman Coulter)

 Thành phần của phản ứng PCR giải trình tự

Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự

 Chuyển toàn bộ dung dịch phản ứng PCR giải trình tự vào ống đã có hỗn hợp dung dịch dừng phản ứng với các thành phần:

100mM Na2EDTA pH 8.0 2 àl

 Thờm 60 àl cồn lạnh 95% vào ống, vortex, li tõm 14,000 rpm trong 15

Bùi Thị Trang 27 CNSH11B.KH phút ở 4 0 C Cẩn thận hút bỏ dung dịch

 Rửa DNA tủa bằng cỏch thờm vào 200 àl cồn 70% lạnh, li tõm 14,000 rpm trong 10 phút ở 4 0 C Cẩn thận hút bỏ dung dịch Thực hiện 2 lần

 Để khụ tự nhiờn sau đú hũa tan DNA tủa vào trong 40àl đệm SLS

Tiến hành giải trình tự trên máy GenomeLab GeXP (Beckman Coulter – Mỹ)

 Chuyển toàn bộ dung dịch DNA hòa tan trong SLS từ bước tinh sạch vào giếng tương ứng trên đĩa chạy mẫu

 Nhỏ 1 giọt dầu lên trên tránh bay mẫu

 Đặt đĩa vào máy giải trình tự, gọi chương trình và nhấn Start

So sánh trình tự 16S rDNA của các chủng với ngân hàng dữ liệu gen bằng chương trình BLAST

Xây dựng cây phân loại dựa vào phần mềm CLUSTAL W theo phương pháp neighbor-joining

2.2.2.3 Khảo sát gen lcp của các chủng vi sinh vật lựa chọn

 Thành phần của phản ứng PCR nhân gen lcp:

DNA (nồng độ ~100ng/àl) 1 àl

Tinh sạch sản phẩm sau PCR theo Kit Primer 5(Beckman Coulter)

PCR giải trình tự sử dụng DTCS Quick Start Kit (Beckman Coulter)

2.2.2.4 Đánh giá khả năng phát triển, phân hủy cao su của các chủng lựa chọn

 Đánh giá khảnăng phát triển và phân hủy DPNR

Chuẩn bị bình tam giác 250 ml có nắp silicon thông khí, bọc kín bằng giấy bạc và tiến hành thanh trùng ở nhiệt độ 121 độ C trong 20 phút Nếu dưới đáy bình có nước, cần phải sấy khô trước khi thực hiện bước tiếp theo.

 Chuẩn bị 50 ml MSM, thanh trùng 121 0 C, 20 phút

 Bổ sung vào bình tam giác 0.5% DPNR và 10%v/v vi sinh vật đã được hoạt hóa trong LB 1/5 lỏng trong 3 ngày

 Quan sát, đánh giá khảnăng phát triển, mức độ phân hủy sau 14 ngày nuôi ở 30 0 C

Sau 30 ngày nuôi cấy, hãy thêm 50 ml pentan vào bình mà không cần thay môi trường nuôi Lắc mạnh bình trong 1-2 ngày để đảm bảo cao su hòa tan hoàn toàn vào pentan Lưu ý bịt kín bình trong quá trình lắc để tránh tình trạng pentan bay hơi.

 Cho hỗn hợp vào bình tách chiết để thu lấy pha pentan phía bên trên

 Dùng Na2SO4 để hút hết nước trong pha pentan vừa thu

 Lọc pentan bằng giấy lọc, lấy dịch trong

 Đem dịch lọc đi cô quay chân không, chuyển hết mẫu vào lọ penicillin và gửi mẫu chạy GPC

 Đánh giá KNPH cao su tổng hợp

 Chuẩn bị bình tam giác 250 ml có nắp đậy silicon (nắp thông khí), bọc

Bùi Thị Trang, sinh viên lớp CNSH11B.KH, thực hiện quy trình thanh trùng bằng cách kín bằng giấy bạc ở nhiệt độ 121 độ C trong 20 phút Trước khi tiến hành bước tiếp theo, cần đảm bảo rằng đáy bình không có nước, nếu có thì phải sấy khô.

 Chuẩn bị 50 ml MSM, thanh trùng 121 0 C, 20 phút

 Pha cao su tổng hợp trong pentan: 5 g/200 ml pentan, lắc đều cho cao su tan hết trong trai thủy tinh kín Bảo quản ở 4 0 C

Để tạo bề mặt cao su tổng hợp, trước tiên, hãy trải 5 ml dịch cao su tổng hợp đã hòa tan trong pentan xuống đáy bình tam giác 250 ml trong tủ cấy vô trùng Sau đó, lắc nhẹ để phân bố đều dung dịch cao su trên bề mặt bình và để bình đứng yên cho đến khi pentan bay hơi hoàn toàn Kết quả thu được là một lớp polyisoprene mỏng ở đáy bình.

 Thêm 50 ml MSM đã thanh trùng ở trên vào bình tam giác

 Lấy một khuẩn lạc đã được phân lập cấy vào 10ml môi trường LB 1/5 và đem nuôi ở 30 0 C, 150 rpm, 1-2 ngày

Lấy 0.5 ml canh trường LB và cho vào bình tam giác chứa 50 ml MSM và polyisoprene Quan sát bình hàng ngày để theo dõi sự phát triển của vi khuẩn.

 Làm tương tự với mẫu kiểm chứng là 0.5 ml LB1/5 vô trùng

Sau khi nuôi cấy đủ thời gian, hãy thêm 50 ml pentan vào bình nuôi mà không loại bỏ môi trường nuôi Tiến hành lắc mạnh trong 1-2 ngày để đảm bảo cao su hòa tan hoàn toàn vào pentan Trong quá trình lắc, cần bịt kín bình để ngăn chặn sự bay hơi của pentan.

 Cho hỗn hợp vào bình tách chiết để thu lấy pha pentan

 Dùng Na2SO4 để hút hết nước trong pha pentan vừa thu

 Lọc pentan bằng giấy lọc, lấy dịch trong

 Đem dịch lọc đi cô quay chân không, chuyển hết mẫu vào lọ penicillin và gửi mẫu chạy GPC

 Chụp hiển vi điện tử quét SEM

Găng tay cao su được cố định trong hỗn hợp 2.5% glutaraldehyde và 2% formaldehyde trong đệm 0.1 M cacodylate và loại nước bằng cách tăng từ từ

Bùi Thị Trang 30 CNSH11B.KH nồng độ Acetone tới 100% Sau khi sấy mẫu được phủ một platine và được chụp bằng máy hiển vi S-4800 (Hitachi, Japan)

 Đánh giá khảnăng phát triển và phân hủy găng tay cao su thiên nhiên

Tiêu đề	Nghiên Cứu Quá Trình Phân Hủy Sinh Học Mủ Cao Su Thải
Tác giả	Bùi Thị Trang
Người hướng dẫn	PGS. TS. Nguyễn Lan Hương
Trường học	Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội
Chuyên ngành	Công Nghệ Sinh Học
Thể loại	luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2013
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	80
Dung lượng	2,11 MB