Khóa luận xác định mối liên quan giữa đa hình đơn rs3738423 của gen NPHS2 với chỉ số proteincreatinin niệu ở bệnh nhân mắc hội chứng thận hư tiên phát tại bệnh viện nhi trung ương

TỔ NG QUAN TÀI LI Ệ U

H ộ i ch ứ ng th ận hư tiên phát

Hội chứng thận hư (HCTH) là tình trạng xảy ra khi có tổn thương cấu trúc hoặc chức năng của cầu thận, với các triệu chứng điển hình như phù nề, tăng protein niệu, giảm protein máu và tăng lipid máu HCTH có thể do nhiều nguyên nhân, trong đó có các bệnh lý ngoài thận như tiểu đường và lupus, dẫn đến tổn thương cầu thận, được gọi là HCTH thứ phát Tuy nhiên, nguyên nhân phổ biến nhất thường là tổn thương khu trú tại thận, được gọi là HCTH nguyên phát.

Hội chứng thận hư nguyên phát là một bệnh cầu thận mạn tính phổ biến ở trẻ em, bắt nguồn từ thận và thường được chẩn đoán qua việc loại trừ các nguyên nhân khác Bệnh có thể kéo dài nhiều tháng hoặc nhiều năm, với các đợt triệu chứng bột phát xen kẽ thời kỳ thuyên giảm.

Hội chứng thận hư kháng corticosteroid là tình trạng không có sự cải thiện sau khi điều trị bằng phác đồ corticosteroid chuẩn Mặc dù chỉ chiếm khoảng 20% tổng số bệnh nhân mắc hội chứng thận hư, nhưng loại hội chứng này rất khó điều trị và có tới 36-50% bệnh nhân có nguy cơ tiến triển đến suy thận trong vòng 10 năm.

Hội chứng thận hư tiên phát ở trẻ em có tỷ lệ mắc khác nhau tùy thuộc vào giới tính, độ tuổi, chủng tộc và cơ địa của từng trẻ Tại Việt Nam, độ tuổi phổ biến mắc bệnh là 8,7 ± 3,5 tuổi, với tỷ lệ bé trai mắc bệnh cao gấp đôi so với bé gái, đạt tỷ lệ 2/1.

Theo nghiên cứu tại Canada từ năm 1993 đến 2014, tỷ lệ mắc bệnh ở bé trai và bé gái là khoảng 2:1 Tỷ lệ mắc mới hàng năm ở trẻ em từ 1 đến 18 tuổi là 2,4 trên 100.000 đối với người gốc châu Âu, 15,83 đối với người gốc Nam Á và 1,81 đối với người gốc Đông/Đông Nam Á.

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

Hội chứng thận hư tiên phát kháng corticosteroid là vấn đề quan trọng trong lâm sàng do điều trị kéo dài và tiềm ẩn nhiều biến chứng nguy hiểm Tỷ lệ kháng corticosteroid thay đổi theo vùng địa lý và thời gian, với khoảng 30% ở Ấn Độ và Pakistan Nghiên cứu năm 2012 tại Ba Lan cho thấy tỷ lệ kháng corticosteroid ở trẻ em mắc HCTH tăng từ 15,8% lên 31,4% trong giai đoạn 1986-2005 Tại Nam Phi, tỷ lệ kháng thuốc được ghi nhận là 27,3% Ở Việt Nam, tỷ lệ kháng thuốc ở trẻ mắc hội chứng thận hư cũng có sự khác biệt tùy theo thời gian và nghiên cứu.

Theo nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sáng, tỷ lệ HCTH kháng thuốc là 12,4% [8], nghiên cứu của Dương Thị Thúy Nga là 20% [5], trong khi đó nghiên cứu của

Trong nghiên cứu của Phạm Văn Đếm và các cộng sự, có 258 trẻ kháng thuốc trong tổng số 458 trẻ mắc hội chứng thận hư điều trị nội trú tại khoa Thận - Lọc máu của Bệnh viện Nhi Trung Ương, chiếm tỷ lệ 56,3%.

1.1.3 Cơ chế sinh b ệ nh h ọ c HCTHTP

Hội chứng thận hư tiên phát xảy ra khi màng lọc cầu thận tăng tính thấm đối với protein, đặc biệt là albumin Khi thực hiện điện di protein niệu, khoảng 70% thành phần là albumin, dẫn đến khái niệm protein niệu chọn lọc Albumin trong huyết thanh có điện tích âm, khiến nó khó có thể vượt qua màng lọc cầu thận do bị cản trở bởi lớp điện tích âm trên bề mặt màng lọc.

Màng lọc cầu thận là một cấu trúc hình tổ ong gồm ba lớp, bao gồm lớp nội mô mao mạch cầu thận với các lỗ lọc có đường kính từ 500-1000 Å, lớp màng đáy dày khoảng 3200 Å và có điện tích âm, cùng với hàng tế bào podocyte, là lớp tế bào biểu mô của bao Bowman Chức năng chính của hàng rào này là lọc các chất từ huyết tương, góp phần vào quá trình tạo ra nước tiểu.

"Nước tiểu đầu" có thành phần tương tự huyết thanh, chỉ khác ở chỗ thiếu protein Màng lọc cầu thận có tính thấm chọn lọc cao, dựa vào kích thước, điện tích và hình dạng của các phân tử Các phân tử không mang điện và có bán kính nhỏ hơn 70 Å sẽ dễ dàng qua màng này.

Màng lọc cầu thận có khả năng ngăn chặn các phân tử có bán kính lớn hơn 4,0nm và mang điện tích âm, do đó chúng khó có thể đi vào nước tiểu đầu Khi màng lọc bị tổn thương, lỗ lọc có thể mở rộng hoặc mất điện tích âm, dẫn đến việc các protein nhỏ và mang điện tích âm dễ dàng qua hàng rào này Hiện tại, nhiều giả thuyết đã được đưa ra về vấn đề này, tuy nhiên vẫn còn nhiều tranh cãi.

Với sự tiến bộ trong sinh học phân tử, các nhà khoa học đã phát hiện ra mối liên hệ giữa tế bào podocyte và hội chứng thận hư Podocyte là loại tế bào có cấu trúc thân và nhiều chân, bao quanh các mao mạch cầu thận, tạo ra các kẽ lọc với đường kính khoảng 70-75 Å, được gọi là cấu trúc khe lọc.

Khe lọc slit diaphragm hiện nay được cấu thành từ các phức hợp protein như nephrin, podocin, FAT1, FAT2, và CD2AP, gắn kết với các sợi actin nội bào, có vai trò quan trọng trong chức năng lọc cầu thận Sự đột biến hoặc mất chức năng của các gen mã hóa các protein này có thể dẫn đến tình trạng protein niệu Do khả năng phân chia và tái tạo hạn chế, tổn thương ở tế bào podocyte rất khó hồi phục; khi số lượng tế bào podocyte bị tổn thương vượt quá 20%, cầu thận dễ dàng tiến triển tới xơ hóa và suy giảm chức năng thận.

Hình 1.1 T ế bào podocyte bình thườ ng và b ệ nh lý A: Podocyte bình thường với nhiều chân giả; B: Podocyte bệnh lý ở bệnh nhân

HCTH dẹt và ít chân giả [51]

Hội chứng thận hư được coi là một rối loạn miễn dịch tế bào, do sự lắng đọng các phức hợp miễn dịch tại cầu thận, gây tổn hại lớp điện tích âm của màng lọc cầu thận, dẫn đến việc dễ dàng cho phép các phân tử mang điện tích âm như albumin lọt qua Quan điểm này được củng cố bởi việc HCTH thường xuất hiện sau khi bệnh nhân tiếp xúc với các chất gây dị ứng Hơn nữa, corticosteroid là thuốc chính trong điều trị HCTH, và có bằng chứng cho thấy u lympho Hodgkin cùng với các loại u lympho tế bào T khác có thể gây ra hội chứng thận hư, với sự thuyên giảm bệnh sau khi điều trị hóa trị liệu.

Gần đây, protein CD80 (B70-1), một yếu tố quan trọng trong việc kích hoạt tế bào T, đã được phát hiện ở các tế bào podocyte bất thường, điều này càng làm vững chắc thêm quan điểm về vai trò của nó Protein này cũng được xem là một mục tiêu nghiên cứu tiềm năng cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân mắc hội chứng thận hư (HCTH).

Đa hình di truyề n NPHS2

1.2.1 V ị trí, c ấ u trúc, vai trò gen NPHS2

Vào năm 2000, Boute và các cộng sự đã phát hiện vị trí của gen NPHS2 ở người (MIM # 604766, GenBank NM 014625.2) Gen này có chiều dài khoảng 25 Kb, bao gồm 8 exon và nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 1 tại vị trí 1q25-q31.

Hình 1.2 Gen NPHS2 trên vai dài nhi ễ m s ắ c th ể s ố 1 ở v ị trí 25.2

( Nguồn: Genome Decoration Page/ NCBI)

Gen NPHS2 mã hóa cho podocin, một protein gắn màng có trọng lượng phân tử 42 kD, được cấu tạo từ 383 acid amin Podocin chủ yếu được tìm thấy ở thận, nơi có vai trò quan trọng trong việc lọc chất thải từ máu và loại bỏ chúng qua nước tiểu Protein này hiện diện trong các tế bào podocyte, tồn tại dưới dạng oligo trên màng lipid kép và tập trung nhiều ở khu vực slit diaphragm, cho phép tương tác với các protein khác như CD2AP và nephrin.

Podocyte là tế bào biểu mô có hình dạng chân với các tua nhỏ, tạo ra khe lọc nhỏ (slit diagram) có đường kính khoảng 70-75 Å Đây là hàng rào cuối cùng trong ba lớp cấu thành màng lọc cầu thận, bao gồm lớp tế bào nội mô mao mạch và màng đáy Gần đây, các đột biến di truyền ảnh hưởng đến tế bào podocyte đã thu hút nhiều sự chú ý và được xác định là nguyên nhân chính dẫn đến hội chứng thận hư kháng corticosteroid.

Cấu trúc màng lọc cầu thận bao gồm lớp tế bào podocyte, nơi các protein podocin, CD2AP và nephrin tập trung tại khu vực slit diaphragm, tương tác để điều chỉnh chức năng lọc Đến nay, đã có 24 đột biến đơn gen được phát hiện liên quan đến hội chứng thận hư kháng corticosteroid, trong đó có các gen như NPHS1, NPHS2 và PLCe1.

Nhiều nghiên cứu cho thấy đột biến gen NPHS2 là phổ biến nhất ở bệnh nhân mắc hội chứng thận hư kháng corticosteroid, với tỷ lệ từ 10-30% Theo nghiên cứu của Sadowski, khoảng 29,5% gia đình có hội chứng này mang đột biến đơn gen, trong đó 1/3 là đột biến trên gen NPHS2 Năm 2017, nghiên cứu của Joshi trên trẻ em Ấn Độ cho thấy tỷ lệ đột biến gen NPHS2 lên đến 35,3% Các nhà khoa học đã xác định được tổng cộng 126 đột biến trên gen NPHS2, bao gồm 53 đột biến sai nghĩa và 17 đột biến vô nghĩa.

11 đột biến thêm đoạn, 26 đột biến mất đoạn, 16 đột biến ở vị trí cắt nối, 2 đột biến mất và 1 đột biến ở mã kết thúc [19]

Các đột biến chủ yếu tập trung từ exon 1 đến exon 6, cho thấy mối liên hệ chặt chẽ với HCTHTP, trong khi các đột biến ở exon 7 và 8 chưa có mối liên quan rõ ràng.

Hình 1.4 M ộ t s ố độ t bi ế n trên gen NPHS2 [53]

Cấu trúc hai chiều của protein podocin được mô tả với vùng tương đồng với stomatin được đánh dấu bằng màu đen Các đột biến chưa xác định được thể hiện bằng chữ in nghiêng, trong khi các đột biến vô nghĩa được gạch chân.

1.2.2 Đa hình đơn rs3738423 c ủ a gen NPHS2 Đa hình đơn rs3738423 (tên khác là S96S hay 288C>T) là sự thay thế nucleotide C thành nucleotide T tại vị trí 16170 trên exon 2 của gen NPHS2 Chính sự thay thế này đã tạo nên đa hình rs3738423 có 3 kiểu gen: kiểu gen đồng hợp kiểu dại (CC), kiểu gen dị hợp tử (CT) và kiểu gen đồng hợp tửđột biến (TT) Đa hình này lần đầu được phát hiện bởi Mei- Chen Wu và cộng sự vào năm 2001

Nghiên cứu cho thấy tần số alen C và T của đa hình rs3738423 trên quần thể người Đài Loan khỏe mạnh lần lượt là 0,94 và 0,06, với tần số kiểu gen CC: CT: TT là 0,88: 0,12: 0,0, tuân theo định luật Hardy Weinberg Đáng chú ý, tần số này cũng tương tự ở các bệnh nhi tại châu Âu.

Trong một nghiên cứu khác trên 44 bệnh nhân mắc HCTH đã được chẩn đoán mô bệnh học thể FSGS của Caridi năm 2001 tại Italia thì tần sốalen đột biến

Năm 2005, Zihua Yu đã tiến hành nghiên cứu trên 23 trẻ mắc hội chứng thận hư kháng thuốc, phát hiện 1 trẻ có kiểu gen đồng hợp TT và 1 trẻ có kiểu gen dị hợp CT tại SNP rs3738423 Tuy nhiên, ông không ghi nhận sự khác biệt về kiểu gen và tần số alen giữa nhóm trẻ này và 53 trẻ đối chứng khác.

Năm 2009, nghiên cứu của Spyridon Megremis trên 22 trẻ mắc HCTH kháng thuốc ở Hy Lạp thấy rằng tỷ lệalen đột biến T của SNP rs3738423 là 2,2%

Trong khi đó, tỷ lệ này ở nhóm chứng 100 bệnh nhân là 1% [39]

Cũng cùng năm 2009, Li Zhu nghiên cứu trên 214 trẻ mắc HCTH vùng phía

Nghiên cứu tại Bắc Trung Quốc cho thấy 35 trường hợp dị hợp tử CT và 5 trường hợp đồng hợp tử TT ở SNP rs3738423 trong chẩn đoán mô bệnh học MCD Tuy nhiên, rs3738423 không có ảnh hưởng đến mô bệnh học MCD và không liên quan đến protein niệu của bệnh nhân.

Năm 2012, trên 97 bệnh nhi HCTH, Jun Li thấy có 7 trường hợp dị hợp tử

Nghiên cứu của Jun Li và các cộng sự chỉ ra rằng biến thể SNP rs3738423 với kiểu gen CT có khả năng bảo vệ đối với bệnh nhân gốc Trung Quốc, trong khi không có tác dụng tương tự ở nhóm bệnh nhân gốc Malaysia.

Năm 2015, nghiên cứu của Dedi Rachmadi trên 59 bệnh nhi mắc hội chứng thận hư (HCTH) tại Indonesia phát hiện 4 trường hợp mang kiểu gen dị hợp tử CT ở SNP rs3738423 Tuy nhiên, đa hình này không có mối liên hệ với lâm sàng hay tình trạng kháng thuốc của bệnh nhân HCTH.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Đối tượ ng nghiên c ứ u

Nghiên cứu gồm 149 bệnh nhân nhi người Việt Nam mắc HCTHTP điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung Ương tự nguyện tham gia nghiên cứu

- Các bệnh nhân điều trị ở khoa Thận - Tiết Niệu bệnh viện Nhi Trung Ương từtháng 09/2015 đến tháng 06/2016 được chẩn đoán HCTHTP theo tiêu chuẩn của KDIGO năm 2012: Protein niệu ≥

50 mg/kg/24 giờ hoặc Protein niệu/Creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol, Albumin máu ≤ 25 gam/lít, Protid máu ≤ 56 gam/lít [27, 28]

- Không mắc các bệnh hệ thống và các bệnh về cầu thận khác

- Tự nguyện tham gia nghiên cứu

- HCTH thứ phát: tìm thấy nguyên nhân (Ví dụ: lupus ban đỏ hệ thống, ban xuất huyết dịứng, ngộđộc…).

- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

✓ Chia nhóm bệnh nhân Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện, chọn ra 03 nhóm gồm:

- Nhóm nhạy cảm (n= 58): Gồm 58 bệnh nhi mắc HCTHTP nhạy cảm với corticosteroid

- Nhóm kháng thuốc sớm (n= 56): Gồm 56 bệnh nhi mắc HCTHTP kháng sớm với thuốc corticosteroid

- Nhóm kháng thuốc muộn (n= 35): Gồm 35 bệnh nhi mắc HCTHTP kháng muộn với thuốc corticosteroid

Địa điể m và th ờ i gian nghiên c ứ u

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 9/2015 đến tháng 3/2017 tại khoa Thận - Lọc máu và phòng xét nghiệm sinh hóa của Bệnh viện Nhi Trung Ương, nơi chuyên chẩn đoán, điều trị và quản lý bệnh nhân Phân tích gen được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Y dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Phương pháp nghiên cứ u

Phương pháp nghiên cứ u là nghiên cứu tiến cứu, mô tả, theo dõi dọc

Dữ liệu lâm sàng bao gồm các thông tin quan trọng như tuổi, giới tính, lý do nhập viện, bệnh sử và tiền sử bệnh Ngoài ra, cần ghi nhận cân nặng, chiều cao, huyết áp, tình trạng sốt và phù Các thông tin khám sức khỏe liên quan đến tuần hoàn, hô hấp, tiêu hóa và tiết niệu cũng rất cần thiết để đánh giá tình trạng bệnh nhân.

- Dữ liệu cận lâm sàng: Nồng độ protein niệu 24 giờ, tỷ lệ protein/creatinin niệu; nồng độ ure, creatinin, protein và albumin máu

- Dữ liệu đa hình đơn nucleotid rs3738423

Hóa chất dùng cho tách ADN tổng số: E.Z.N.A blood ADN Mini kit (hãng Omega-Biotek)

Hóa chất dùng cho điện di: Ultra Pure Agarose (hãng Invitrogen); TAE 1X;

Ethylene diamine tetra acetic Acid (EDTA) Disodium Salt Dihydrate from Affymetrix, along with 6X ADN loading dye and GeneRuler 100 bp Plus ADN Ladder (code: SM0321) from ThermoScientific, and Lambda ADN/HindIII Marker (code: SM0103) also from ThermoScientific, are essential reagents for molecular biology experiments Additionally, Tris base from Bio Basic and acetic acid from Merck are important components for buffer preparation and pH adjustment in various applications.

PCR chemicals include primers synthesized by IDT, USA; Pfu DNA polymerase from Thermo Scientific; 2 mM dNTP Mix also from Thermo Scientific; and deionized water provided by Omega Biotek.

Eppendorf pipettes are available in various ranges, including 0.5 µl to 10 µl, 10 µl to 100 µl, and 100 µl to 1000 µl, all from Thermo Additionally, Thermo offers tips in sizes of 10 µl, 200 µl, and 1000 µl Other essential laboratory supplies include 1.7 ml Eppendorf tubes and 0.2 ml PCR tubes, both from Thermo For electrophoresis needs, the Cole-Parmer system from the USA is recommended The Prime Thermal Cycler PCR machine from the UK and a Panasonic -30°C refrigerator from Japan are also key equipment for efficient laboratory operations.

Bản); Máy li tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen (Đức); Máy lắc VELP Scientifica (Châu Âu); Máy soi gel Cole-Parmer (Mỹ) ; Máy quang phổ NP80 Nanophotometer (Đức)

Phương pháp lấ y m ẫ u và b ả o qu ả n m ẫ u

Mẫu xét nghiệm sinh hóa nước tiểu 24h yêu cầu thu thập toàn bộ nước tiểu trong 24 giờ Bô đựng nước tiểu cần có nắp đậy, được rửa sạch và sát khuẩn bằng 5ml dung dịch HCl đậm đặc Trước khi lấy mẫu, bệnh nhân cần vệ sinh sạch sẽ vùng sinh dục-tiết niệu Vào lúc 6 giờ sáng, bệnh nhân đi tiểu lần đầu tiên và bắt đầu ghi thời gian Trong suốt ngày và đêm, tất cả nước tiểu, kể cả khi đại tiện, phải được gom vào bô Vào 6 giờ sáng hôm sau, bệnh nhân đi tiểu lần cuối và đo thể tích nước tiểu trong 24 giờ Cuối cùng, lấy 5ml nước tiểu để xét nghiệm và bảo quản bằng dung dịch thymol 10% (5ml).

Mẫu xét nghiệm sinh hóa máu cần được lấy vào buổi sáng khi chưa ăn, với lượng máu từ 1,5 - 2ml lấy từ tĩnh mạch và chứa trong ống nghiệm chống đông Heparin Bệnh phẩm phải được vận chuyển ngay lập tức đến phòng xét nghiệm để tiến hành phân tích.

Để phân tích gen, cần lấy 2ml máu toàn phần trong ống nghiệm có chất chống đông EDTA và bảo quản ở nhiệt độ -20°C cho đến khi sử dụng Mẫu máu phải được ghi rõ thông tin bao gồm mã bệnh nhân, tên, tuổi, và ngày lấy mẫu Tất cả thông tin liên quan đến mẫu máu của bệnh nhân cần được lưu trữ trong sổ bàn giao mẫu và nhật ký thí nghiệm tách DNA tổng số.

Phân tích định lượng sinh hóa máu và nướ c ti ể u

Bệnh phẩm được phân tích tại khoa Sinh hóa, bệnh Viện Nhi Trung Ương

Bệnh nhân được xét nghiệm tại những mốc thời gian khác nhau: vào viện, ra viện,

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU The study involved patients who were discharged after one month and six months Key biochemical parameters analyzed included urine protein concentration, urine protein/creatinine ratio, blood protein levels, serum albumin, and serum creatinine, utilizing the AU2700 automatic biochemical analyzer (Beckman Coulter).

Phân tích đa hình gen NPHS2

Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình khuyến cáo của hãng Quy trình tách chiết DNA được trình bày ở Phụ lục 1

Kiểm tra và định lượng DNA tách chiết được thực hiện bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,7% với đệm TAE 1X Trong quy trình, 5 μl DNA được trộn với 1 μl đệm tra mẫu chứa ethidium bromide (50 μg/ml) Điện di diễn ra ở hiệu điện thế 90 volt trong 1 giờ, và các băng DNA được phát hiện dưới ánh sáng UV.

Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tách chiết được xác định thông qua việc đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280) Một mẫu ADN được coi là tinh khiết khi tỷ lệ OD 260/OD 280 nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2,0.

Quy trình kiểm tra chất lượng DNA bằng điện di được trình bày ở Phụ lục

Chúng tôi đã sử dụng phần mềm PerlPrimer phiên bản 1.1.1 để thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR, tập trung vào exon 2, và đã đặt hàng tổng hợp hóa học mồi tại công ty IDT (Mỹ).

Nhân dòng exon 2 của gen NPHS2 bằng phương pháp PCR, nguyên tắc chính của PCR là tạo ra số lượng lớn các đoạn DNA cần phân tích từ DNA khuôn thông qua hoạt động của enzyme ADN polymerase Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra chất lượng bằng cách điện di trên gel agarose 1%.

Bảng 2.1 Thành phần và chu trình nhiệt PCR nhân dòng exon 2 của gen NPHS2

(àL) Điều kiện (chu trỡnh nhiệt) dNTP (2mM) 2,5 * Biến tính đầu: 95 o C trong 3’

Mồi ngược (10 pmol/àl) 0,75 Nước khử ion 13,5

Xác định kiểu gen exon 2 của gen NPHS2 được thực hiện thông qua giải trình tự, với 20 mẫu sản phẩm được gửi đến hãng IDT tại Malaysia Kết quả giải trình tự sau đó được phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên bản 7.1.9 để xác định kiểu gen của từng bệnh nhân.

Cách đọc kiểu gen từ kết quả giải trình tự là mỗi nucleotide được biểu thị bằng một đỉnh có màu sắc đặc trưng: A là màu xanh lá cây, C là màu xanh da trời, G là màu đen, và T là màu đỏ Nếu tại vị trí của mỗi nucleotide chỉ xuất hiện một đỉnh màu, bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp Ngược lại, nếu có hai đỉnh màu xuất hiện, đó là kiểu gen dị hợp.

Trẻ mắc HCTHTP nhập viện (N9) Điều trị tấn công 4 tuần

Có thuyên giảm không ? Điều trị duy trì 4-8 tuần

Liều prednisolon 1,5mg/kg/48h Điều trị tiếp 2 tuần

- Hoặc có tái phát nhưng vẫn đáp ứng thuốc

- Thuyên giảm không hoàn toàn

- Tái phát và kháng thuốc trong những đợt điều trị sau

Không thuyên giảm (Protein/creatinin

Kháng thuốc sớm nV Đặc điểm chung

Giải trình tự exon 2 Xác định rs3738423

Phân tích mối liên quan

X ử lý s ố li ệ u

Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20.0

Phân tích phương sai (ANOVA) một nhân tố và hai nhân tố, cùng với kiểm định Chi-Square (χ²), được áp dụng trong các trường hợp tương ứng Kết quả p 0,05

Tuổi khởi phát bệnh trung bình và tuổi trung bình của bệnh nhi tại thời điểm nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Tuổi khởi phát trung bình và tuổi trung bình hiện tại

Tuổi trung bình của bệnh nhân trong nghiên cứu là 5,8 ± 3,7 tuổi, với độ tuổi dao động từ 2 tháng đến 16 tuổi Tuổi khởi phát bệnh được ghi nhận là 4,2 ± 2,8 tuổi, với khoảng thời gian từ 2 tháng đến 14 tuổi Đặc biệt, bệnh nhân nhỏ tuổi nhất thuộc nhóm kháng thuốc sớm.

Tuổi khởi phát ở các nhóm bệnh nhân, được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Tuổi khởi phát trung bình ở các nhóm bệnh nhân

Bệnh nhân Sốlượng (n) Tuổi khởi phát

Tuổi khởi phát trung bình ở nhóm bệnh nhân NC là 4,4 ± 2,5, nhóm bệnh nhân KTS là 3,8 ± 3,1, và nhóm bệnh nhân KTM là 4,4 ± 2,8 Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về tuổi khởi phát giữa ba nhóm bệnh nhân với chỉ số p > 0,05.

Bàn luận về đặc điểm chung

Nghiên cứu cho thấy hội chứng thận hư phổ biến hơn ở nam giới so với nữ giới, với tỷ lệ nam/nữ lần lượt là 2,7/1 trong nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sáng, 2/1 của Trần Hữu Minh Quân, 2,8/1 của Chang và 2,5/1 của Wong.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, độ tuổi khởi phát bệnh trung bình là 4,2 ± 2,8 tuổi, không có sự khác biệt so với các nghiên cứu khác Cụ thể, Đoàn Thị Thắm ghi nhận độ tuổi khởi phát từ 1-8 tuổi, trong khi Patrick Niaudet cho thấy từ 2-7 tuổi Điều này cho thấy rằng độ tuổi khởi phát và độ tuổi trung bình của bệnh nhân mắc HCTHTP chủ yếu nằm trong giai đoạn tiền học đường và học đường.

K ế t qu ả c ậ n lâm sàng

Trong hội chứng thận hư, các triệu chứng lâm sàng như cao huyết áp và phù, cùng với các chỉ số cận lâm sàng như protein máu, albumin máu, protein niệu và tỷ lệ protein/creatinine niệu, đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán, theo dõi và điều trị bệnh Bệnh nhân được phân loại thành ba nhóm theo mức độ đáp ứng với corticosteroid: nhóm nhạy cảm (NC), nhóm kháng thuốc sớm (KTS) và nhóm kháng thuốc muộn (KTM) Việc theo dõi diễn ra tại nhiều thời điểm, bao gồm lúc nhập viện, xuất viện, một tháng và sáu tháng sau khi xuất viện Kết quả xét nghiệm sinh hóa máu và nước tiểu sẽ được trình bày qua các biểu đồ dưới đây.

Bi ểu đồ 3.2 Giá tr ị trung bình c ủ a protein máu c ủ a các nhóm b ệ nh nhân NC (hình trám), KTS (hình vuông) và KTM (hình tam giác) t ạ i các th ời điể m

Kí hiệu * thể hiện giá trị p giữa nhóm NC và nhóm KTS : * pT) của exon 2

Không có alen đột p biến Có alen đột biến

Sự tương tác giữa alen đột biến rs3738423 C>T trên exon 2 và mức độ đáp ứng thuốc corticosteroid không có ảnh hưởng đến protein niệu, với các chỉ số p > 0,05 tại các thời điểm xét nghiệm.

Bảng 3.14 Chỉ số albumin máu theo mức độ đáp ứng corticosteroid và alen đột biến rs3738423 của exon 2

Protein/creatinin niệu (mg/mmol) ( ± SE)

Phân nhóm rs3738423 (C>T) của exon 2

Không có alen đột p biến Có alen đột biến

Sự tương tác giữa alen đột biến rs3738423 C>T trên exon 2 và mức độ đáp ứng thuốc corticosteroid đã làm thay đổi tỷ lệ protein/creatinin niệu tại thời điểm vào viện và ra viện, với các giá trị p tương ứng là 0,002 và 0,000 Các bệnh nhân mang alen đột biến trong nhóm KTS có chỉ số protein/creatinin niệu cao gần gấp đôi so với những bệnh nhân không mang alen đột biến Ngược lại, ở nhóm NC và KTM, bệnh nhân mang alen đột biến lại có chỉ số protein/creatinin niệu thấp hơn so với những bệnh nhân không mang alen này.

Bàn luận về đa hình thái đơn rs3738423 với các chỉ số sinh hóa

Sự tương tác giữa alen đột biến rs3738423 C>T trên exon 2 và mức độ đáp ứng thuốc corticosteroid không ảnh hưởng đến các chỉ số protein máu, albumin máu, protein niệu, nhưng lại tác động đến chỉ số protein/creatinin niệu tại thời điểm nhập viện và xuất viện Đặc biệt, đa hình thái đơn rs3738423 có tác dụng bảo vệ bệnh nhân trong nhóm NC và KTM bằng cách giảm protein/creatinin niệu, trong khi lại làm tăng chỉ số này ở nhóm bệnh nhân KTS Điều này gợi ý rằng đột biến tại vị trí rs3738423 có thể bảo vệ những bệnh nhân đáp ứng thuốc ban đầu, nhưng lại làm tình trạng bệnh nhân không đáp ứng trở nên tồi tệ hơn Nghiên cứu của Junli cũng cho thấy đa hình này bảo vệ các bệnh nhân gốc Trung Quốc, nhưng không có tác dụng tương tự ở nhóm bệnh nhân từ miền Bắc và miền Đông Trung Quốc, có thể do sự khác biệt về tần số alen hoặc biến thể di truyền giữa các miền.

Nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện trên 149 bệnh nhân HCTHTP trong đó có 58 trường hợp nhạy cảm corticoid, 56 trường hợp kháng thuốc sớm,

35 trường hợp kháng thuốc muộn được điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung Ương từ 09/2015 đến 03/2017, chúng tôi rút ra những kết luận sau:

1 Đa hình đơn chủ yếu ở ba nhóm nhạy cảm, kháng thuốc sớm, kháng thuốc muộn là CC với tỷ lệ lần lượt là 81,03%, 76,79% và 80% Đa hình TT chỉ gặp 2 trường hợp, nằm ở nhóm nhạy cảm và kháng thuốc muộn Chính vì vậy alen C chiếm tỷ lệ cao ở các nhóm với tỷ lệ alen C/T là 0,9/0,1 ở nhóm nhạy cảm, ở nhóm kháng thuốc sớm là 0,88/0,12 và nhóm kháng thuốc muộn là 0,89/0,11

2 Đa hình thái đơn rs3738423 có tác dụng làm giảm chỉ số protein/creatinin niệu ở nhóm bệnh nhạy cảm và kháng thuốc muộn, nhưng lại làm tăng chỉ số này ở nhóm bệnh nhân kháng thuốc sớm

Nghiên cứu hiện tại với cỡ mẫu hạn chế chưa xác định rõ ảnh hưởng của đa hình di truyền rs3738423 của gen NPHS2 lên các chỉ số sinh hóa ở bệnh nhân Để khẳng định mối liên quan này, cần tiến hành nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn trong quần thể bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát.

Ngoài ra có thể tiến hành phân tích sự tương tác giữa các SNP khác của gen

NPHS2 liên quan đến tình trạng kháng corticosteroid trong bệnh lý hội chứng thận hư Nghiên cứu sự tương tác giữa gen NPHS2 với các gen khác như NPHS1, WT1, CD2AP, ACTN4 nhằm phát triển một panel xét nghiệm di truyền sẽ hỗ trợ trong điều trị hội chứng thận hư kháng corticosteroid.

1 Phạm Văn Đếm, Nguyễn Thị Quỳnh Hương và Nguyễn Thu Hương (2015),

"Một số yếu tố dịch tễ lâm sàng Hội chứng thận hư tại Khoa Thận và Lọc máu,

Bệnh viện Nhi Trung ương năm 2015", Tạp chí Y học Thực hành, 624(45-53

2 Phạm Thu Hiền, Trịnh Thị Phương Dung, Trần Thị Chi Mai (2012), "Tiện ích của chỉ sốprotein/cretinin nước tiểu trong đánh giá protein niệu ở hội chứng thận hư trẻ em", Tạp chí nghiên cứu y học, 80(3), 35-39

3 Phạm Trung Kiên (2016), Giáo trình Nhi khoa, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội

4 Trần Đình Long (2012), Bệnh học thận tiết niệu sinh dục và lọc máu trẻ em,

5 Dương Thị Thúy Nga (2011), Nhận xét kết quả điều trị hội chứng thận hư tiên phát kháng corticosteroid tại khoa Thận - Tiết niệu bệnh viện Nhi Trung Ương, Luận văn thạc sỹ y học, Đại học Y Hà Nội

6 Trần Hữu Minh Quân, Loan Huỳnh Thoại và Quang Nguyễn Ðức (2014),

"Đặc điểm hội chứng thận hư kháng steroid tại bệnh viện Nhi Đồng I", Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 18(4), 80-86

7 Nguyễn Ngọc Sáng (1987), Nhận xét vềđặc điểm lâm sàng và sinh học qua

52 trường hợp HCTHTP thể kháng thuốc ở trẻ em, Luận văn tốt nghiệp bác sĩ nội trú bệnh viện, Đại học Y Hà Nội

8 Nguyễn Ngọc Sáng (1999), Đánh giá hiệu quả điều trị bằng Methylprednisolon và những thay đổi miễn dịch trước và sau điều trị hội chứng thận hư tiên phát ở trẻ em, Luận án tiến sĩ y học, Đại học Y Hà Nội

9 Đoàn Thị Thắm (2012), Nhận xét kết quả điều trị hội chứng thận hư tiên phát, Luận văn thạc sỹ y học, Đại học Y Hà Nội

10 Abitbol Carolyn, Zilleruelo Gaston, Frendlich Michael, et al (1990),

"Quantitation of proteinuria with urinary protein/creatinine ratios and random testing with dipsticks in nephrotic children", The Journal of pediatrics, 116(2),

11 Adamson O, Trachtman H and Tejani A (1986), "Urinary protein electrophoresis patterns in childhood idiopathic nephrotic syndrome", The International journal of pediatric nephrology, 7(4), 181-186

12 Akchurin Oleh and Reidy Kimberly J (2015), "Genetic causes of proteinuria and nephrotic syndrome: impact on podocyte pathobiology", Pediatric Nephrology, 30(2), 221-233

13 Audard Vincent, Larousserie F, Grimbert P, et al (2006), "Minimal change nephrotic syndrome and classical Hodgkin's lymphoma: report of 21 cases and review of the literature", Kidney international, 69(12), 2251-2260

14 Bakker Winston W, Van Dael Catharina Ml, Pierik Leonie Jwm, et al

(2005), "Altered activity of plasma hemopexin in patients with minimal change disease in relapse", Pediatric Nephrology, 20(10), 1410-1415

15 Banaszak Beata and Banaszak Paweł (2012), "The increasing incidence of initial steroid resistance in childhood nephrotic syndrome", Pediatric Nephrology, 27(6), 927-932

16 Banh Tonny Hm, Hussain-Shamsy Neesha, Patel Viral, et al (2016), "Ethnic differences in incidence and outcomes of childhood nephrotic syndrome", Clinical

Journal of the American Society of Nephrology, 11(10), 1760-1768

17 Bhimma Rajendra, Adhikari Miriam and Asharam Kareshma (2006),

"Steroid-resistant nephrotic syndrome: the influence of race on cyclophosphamide sensitivity", Pediatric Nephrology, 21(12), 1847-1853

18 Biswas Arnab, Kumar R, Chaterjee A, et al (2009), "Quantitation of proteinuria in nephrotic syndrome by spot urine protein creatinine ratio estimation in children", Mymensingh medical journal: MMJ, 18(1), 67-71

19 Bouchireb Karim, Boyer Olivia, Gribouval Olivier, et al (2014), "NPHS 2 Mutations in Steroid‐Resistant Nephrotic Syndrome: A Mutation Update and the Associated Phenotypic Spectrum", Human mutation, 35(2), 178-186

20 Boute Nicolas, Gribouval Olivier, Roselli Séverine, et al (2000), "NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome", Nature genetics, 24(4), 349

21 Brenner Barry M, Hostetter Thomas H and Humes H David (1978),

"Molecular basis of proteinuria of glomerular origin", New England Journal of Medicine, 298(15), 826-833

22 Caridi Gianluca, Bertelli Roberta, Carrea Alba, et al (2001), "Prevalence, genetics, and clinical features of patients carrying podocin mutations in steroid- resistant nonfamilial focal segmental glomerulosclerosis", Journal of the American Society of Nephrology, 12(12), 2742-2746

23 Chang Jei-Wen, Tsai Hsin-Lin, Wang Hsin-Hui, et al (2009),

"Clinicopathological features and prognosis of Chinese children with idiopathic nephrotic syndrome between different age groups", European journal of pediatrics, 168(10), 1189-1194

24 Day Clara J, Cockwell Paul, Lipkin Graham W, et al (2002),

"Mycophenolate mofetil in the treatment of resistant idiopathic nephrotic syndrome", Nephrology Dialysis Transplantation, 17(11), 2011-2013

25 Ding Wen Y and Saleem Moin A (2012), "Current concepts of the podocyte in nephrotic syndrome", Kidney research and clinical practice, 31(2), 87-93

26 Gbadegesin Rasheed and Smoyer William E (2008), Nephrotic syndrome, Elsevier Inc

27 Glomerulonephritis Kdigo Clinical Practice Guideline For (2012), "Steroid- sensitive nephrotic syndrome in children", Kidney International Supplements 2, chapter 3, 163-171

28 Glomerulonephritis Kdigo Clinical Practice Guideline For (2012), "Steroid- sensitive nephrotic syndrome in children", Kidney International Supplements 2, chapter 4, 162-176

29 Ha Tae-Sun (2013), "Roles of adaptor proteins in podocyte biology", World journal of nephrology, 2(1), 1

30 Hahn Deirdre, Hodson Elisabeth M, Willis Narelle S, et al (2015),

"Corticosteroid therapy for nephrotic syndrome in children", Cochrane Database of Systematic Reviews, 3)

31 Joshi Bhoomi B, Mistry Kinnari N, Gang Sishir, et al (2017),

"Characterization of NPHS2 gene polymorphisms associated to steroid resistance nephrotic syndrome in Indian children", Gene, 628(134-140

32 Junli Huang (2012), Genetics of nephrotic syndrome in singapore pediatrics patients, Doctoral dissertation, National University Singapore

33 Kang Hee Gyung and Cheong Hae Il (2015), "Nephrotic syndrome: what's new, what's hot?", Korean journal of pediatrics, 58(8), 275-282

34 Karle Stephanie M, Uetz Barbara, Ronner Vera, et al (2002), "Novel mutations in NPHS2 detected in both familial and sporadic steroid-resistant nephrotic syndrome", Journal of the American Society of Nephrology, 13(2), 388-

35 Koskimies O, Vilska J, Rapola J, et al (1982), "Long-term outcome of primary nephrotic syndrome", Archives of disease in childhood, 57(7), 544-548

36 Lennon Rachel, Singh Anurag, Welsh Gavin I, et al (2008), "Hemopexin induces nephrin-dependent reorganization of the actin cytoskeleton in podocytes",

37 Lombel Rebecca M, Gipson Debbie S and Hodson Elisabeth M (2013),

"Treatment of steroid-resistant nephrotic syndrome in children: new guidelines from KDIGO", Pediatric Nephrology, 28(3), 409–414

38 Mccarthy Hugh J, Bierzynska Agnieszka, Wherlock Matt, et al (2013),

"Simultaneous sequencing of 24 genes associated with steroid-resistant nephrotic

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU syndrome", Clinical Journal of the American Society of Nephrology, 8(4), 637-

39 Megremis Spyridon, Mitsioni Andromachi, Mitsioni Artemis G, et al

(2009), "Nucleotide variations in the NPHS2 gene in Greek children with steroid- resistant nephrotic syndrome", Genetic testing and molecular biomarkers, 13(2), 249-256

40 Mekahli Djalila, Liutkus Aurelia, Ranchin Bruno, et al (2009), "Long-term outcome of idiopathic steroid-resistant nephrotic syndrome: a multicenter study",

41 Mubarak Muhammed, Lanewala Ali, Kazi Javed Iqbal, et al (2009),

"Histopathological spectrum of childhood nephrotic syndrome in Pakistan",

42 Niaudet Patrick (2004), "Podocin and nephrotic syndrome: implications for the clinician", 15(3), 832-834

43 Pavenstadt Hermann, Kriz Wilhelm and Kretzler Matthias (2003), "Cell biology of the glomerular podocyte", Physiological reviews, 83(1), 253-307

44 Rachmadi Dedi, Melani Ani and Monnens Leo (2015), "NPHS2 gene mutation and polymorphisms in indonesian children with steroid-resistant nephrotic syndrome", Open Journal of Pediatrics, 5(01), 27

45 Reiser Jochen, Von Gersdorff Gero, Loos Martin, et al (2004), "Induction of B7-1 in podocytes is associated with nephrotic syndrome", The Journal of clinical investigation, 113(10), 1390-1397

46 Roy Ranjit Ranjan, Islam Md Rafiqul, Jesmin Tahmina, et al (2013),

"Prognostic Value of Biochemical and Hematological Parameters in Children with Nephrotic Syndrome", Journal of Shaheed Suhrawardy Medical College, 5(2), 95-

47 Sadowski Carolin E, Lovric Svjetlana, Ashraf Shazia, et al (2015), "A single-gene cause in 29.5% of cases of steroid-resistant nephrotic syndrome",

48 Savin Virginia J, Sharma Ram, Sharma Mukut, et al (1996), "Circulating factor associated with increased glomerular permeability to albumin in recurrent focal segmental glomerulosclerosis", New England Journal of Medicine, 334(14), 878-883

49 Schwarz Karin, Simons Matias, Reiser Jochen, et al (2001), "Podocin, a raft-associated component of the glomerular slit diaphragm, interacts with CD2AP and nephrin", The Journal of clinical investigation, 108(11), 1621-1629

50 Tory Kálmán, Menyhárd Dóra K, Woerner Stéphanie, et al (2014),

"Mutation-dependent recessive inheritance of NPHS2-associated steroid-resistant nephrotic syndrome", Nature genetics, 46(3), 299

51 Tryggvason Karl, Patrakka Jaakko and Wartiovaara Jorma (2006),

"Hereditary proteinuria syndromes and mechanisms of proteinuria", New England

52 Wada Takehiko and Nangaku Masaomi (2015), "A circulating permeability factor in focal segmental glomerulosclerosis: the hunt continues", Clinical kidney journal, 8(6), 708-715

53 Weber Stefanie, Gribouval Olivier, Esquivel Ernie L, et al (2004), "NPHS2 mutation analysis shows genetic heterogeneityof steroid-resistant nephrotic syndrome and lowpost-transplant recurrence", Kidney international, 66(2), 571-

54 Weening Jan J (2004), "Role of the immune system in the pathogenesis of idiopathic nephrotic syndrome", Clinical Science, 107(2), 125-136

55 Wharram Bryan L, Goyal Meera, Wiggins Jocelyn E, et al (2005),

"Podocyte depletion causes glomerulosclerosis: Diphtheria toxin–induced podocyte depletion in rats expressing human diphtheria toxin receptor transgene",

56 Wong William (2007), "Idiopathic nephrotic syndrome in New Zealand children, demographic, clinical features, initial management and outcome after twelve‐month follow‐up: Results of a three‐year national surveillance study",

Journal of paediatrics and child health, 43(5), 337-341

57 Wu Mei‐Chen, Wu Jer‐Yuarn, Lee Cheng‐Chun, et al (2001), "A novel polymorphism (c288C> T) of the NPHS2 gene identified in a Taiwan Chinese family", Human mutation, 17(1), 81-82

58 Yu Zihua, Ding Jie, Huang Jianping, et al (2005), "Mutations in NPHS2 in sporadic steroid-resistant nephrotic syndrome in Chinese children", Nephrology Dialysis Transplantation, 20(5), 902-908

59 Zhu Li, Yu Lei, Wang Chen‐Dan, et al (2009), "Genetic effect of the NPHS2 gene variants on proteinuria in minimal change disease and immunoglobulin A nephropathy", Nephrology, 14(8), 728-734

Phụ lục 1 Quy trình tách chiết ADN tổng số sử dụng E.Z.N.A blood DNA

1 Rã đông mẫu máu trên đá và để hóa chất ở nhiệt độ phòng

2 Lắc đều ống mỏu Chuyển 250 àl mẫu vào ống ly tõm vụ trựng

3 Thờm 25 àl OB Protease Solution và 250 àl BL Buffer Vortex trong 10 giây

4 Ủ 65 o C trong 10 phút Chú ý: Sau khi ủđược 5 phút, vortex trong 15 giây

5 Thờm 260 àl Ethanol 100%, vortex trong 20 giõy

6 Ly tâm 1000 vòng/ phút trong 15 giây để đảm bảo mẫu không dính trên thành và nắp ống

7 Chèn HiBind ADN Mini Column vào Collection Tube 2ml

8 Chuyển toàn bộ mẫu vào cột (để pipet ở mức 790 àl)

9 Ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 1 phút

10.Bỏ dịch lọc và Collection Tube

11.Lắp HiBind ADN Mini Column vào Collletion Tube 2ml mới

13.Ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 1 phút

14.Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Colletion Tube

15.Thờm 700 àl ADN Wash Buffer

17.Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Colletion Tube

18.Lặp lại các bước 14 đến 16 cho bước rửa thứ 2 với ADN Wash Buffer

19.Ly tâm HiBind ADN Mini Column 14.000 vòng/ phút trong 2 phút để làm khô cột

20.Chuyển HiBind ADN Mini Column vào ống ly tâm 2ml mới

21.Thờm 100 àl Elution Buffer (đó làm ấm đến 65 o C) Ủ 65 o C trong 5 phỳt

22.Ly tâm tại 14.000 vòng/ phút trong 1 phút

23.Thờm 50 àl Elution Buffer trong 5 phỳt ở nhiệt độ phũng

24.Ly tâm tại 14.000 vòng/ phút trong 1 phút

25.Thu vào bảo quản ADN ở -20 o C

Phụ lục 2 Quy trình kiểm tra chất lượng ADN thông qua điện di

Bước 1: Chuẩn bị gel agarose

Pha agarose trong bột đệm TAE 1X để tạo dung dịch gel agarose 1,5% Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn, sau đó để nguội xuống 50 – 60 °C và đổ vào khay điện di đã cài sẵn răng lược để tạo giếng nhỏ Sau khoảng 30 phút, khi gel đã đông, gỡ răng lược ra và đặt bản gel nằm ngang trong bể điện di Đổ đệm TAE 1X vào bể điện di, đảm bảo mực đệm ngập cách mặt gel 1-2 mm.

Định dạng
Số trang	65
Dung lượng	682,23 KB