Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xác định được tỉ lệ đa hình thái đơn rs3738423 của gen NPHS2 ở bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát. Xác định được mối liên quan giữa đa hình thái đơn rs3738423 với chỉ số protein/creatinine niệu ở bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu gồm 149 bệnh nhân nhi người Việt Nam mắc HCTHTP điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung Ương tự nguyện tham gia nghiên cứu
Từ tháng 09/2015 đến tháng 06/2016, các bệnh nhân điều trị tại khoa Thận - Tiết Niệu của Bệnh viện Nhi Trung Ương được chẩn đoán HCTHTP theo tiêu chuẩn của KDIGO năm 2012, với tiêu chí protein niệu ≥.
50 mg/kg/24 giờ hoặc Protein niệu/Creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol, Albumin máu ≤ 25 gam/lít, Protid máu ≤ 56 gam/lít [27, 28]
- Không mắc các bệnh hệ thống và các bệnh về cầu thận khác
- Tự nguyện tham gia nghiên cứu
- HCTH thứ phát: tìm thấy nguyên nhân (Ví dụ: lupus ban đỏ hệ thống, ban xuất huyết dị ứng, ngộ độc…)
- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu
✓ Chia nhóm bệnh nhân Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện, chọn ra 03 nhóm gồm:
- Nhóm nhạy cảm (n= 58): Gồm 58 bệnh nhi mắc HCTHTP nhạy cảm với corticosteroid
- Nhóm kháng thuốc sớm (n= 56): Gồm 56 bệnh nhi mắc HCTHTP kháng sớm với thuốc corticosteroid
- Nhóm kháng thuốc muộn (n= 35): Gồm 35 bệnh nhi mắc HCTHTP kháng muộn với thuốc corticosteroid
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 9/2015 đến tháng 3/2017 tại khoa Thận - Lọc máu và phòng xét nghiệm sinh hóa của Bệnh viện Nhi Trung Ương, nơi chuyên chẩn đoán, điều trị và quản lý bệnh nhân Phân tích gen được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Y dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu là nghiên cứu tiến cứu, mô tả, theo dõi dọc
Các chỉ tiêu nghiên cứu
Dữ liệu lâm sàng bao gồm các thông tin quan trọng như tuổi, giới tính, lý do nhập viện, bệnh sử và tiền sử bệnh, cũng như các chỉ số cơ thể như cân nặng, chiều cao và huyết áp Ngoài ra, tình trạng sốt và phù cũng cần được ghi nhận, cùng với các thông tin khám lâm sàng liên quan đến hệ tuần hoàn, hô hấp, tiêu hóa và tiết niệu.
- Dữ liệu cận lâm sàng: Nồng độ protein niệu 24 giờ, tỷ lệ protein/creatinin niệu; nồng độ ure, creatinin, protein và albumin máu
- Dữ liệu đa hình đơn nucleotid rs3738423
Hóa chất dùng cho tách ADN tổng số: E.Z.N.A blood ADN Mini kit (hãng Omega-Biotek)
Hóa chất dùng cho điện di: Ultra Pure Agarose (hãng Invitrogen); TAE 1X;
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate from Affymetrix, along with 6X DNA loading dye and GeneRuler 100 bp Plus DNA ladder (code: SM0321) from ThermoScientific, are essential reagents for molecular biology applications Additionally, the Lambda DNA/HindIII marker (code: SM0103) from ThermoScientific, Tris base from Bio Basic, and acetic acid from Merck are important components for effective DNA analysis and experimentation.
The chemicals used for PCR include primers synthesized by IDT, USA; Pfu DNA polymerase from Thermo Scientific; a 2 mM dNTP mix also from Thermo Scientific; and deionized water supplied by Omega Biotek.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Eppendorf pipettes are available in various ranges, including 0.5 µl to 10 µl, 10 µl to 100 µl, and 100 µl to 1000 µl, all from Thermo Additionally, Thermo offers tips in sizes of 10 µl, 200 µl, and 1000 µl The article also highlights Thermo's 1.7 ml Eppendorf tubes and 0.2 ml PCR tubes Key laboratory equipment includes the Cole-Parmer electrophoresis system (USA), the Prime Thermal Cycler PCR machine (UK), and the Panasonic -30°C refrigerator (Japan) Other essential tools are the Hettich EBA 21 centrifuge (Germany), VELP Scientifica shaker (Europe), Cole-Parmer gel imager (USA), and the NP80 Nanophotometer (Germany).
Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu xét nghiệm sinh hóa nước tiểu 24h yêu cầu thu thập toàn bộ nước tiểu trong 24 giờ Bô đựng nước tiểu cần có nắp đậy, được rửa sạch và sát khuẩn bằng 5ml dung dịch HCl đậm đặc Trước khi lấy mẫu, bệnh nhân cần vệ sinh sạch sẽ bộ phận sinh dục-tiết niệu Bắt đầu từ 6 giờ sáng hôm sau, bệnh nhân đi tiểu bỏ đi và ghi lại thời gian Trong suốt 24 giờ, tất cả nước tiểu, kể cả khi đại tiện, phải được gom vào bô Cuối cùng, vào 6 giờ sáng hôm sau, bệnh nhân đi tiểu lần cuối vào bô Đo thể tích nước tiểu 24h và lấy 5ml để làm xét nghiệm, bảo quản bằng dung dịch thymol 10% (5ml).
Mẫu xét nghiệm sinh hóa máu cần được lấy vào buổi sáng khi người bệnh chưa ăn Lấy 1,5 - 2ml máu tĩnh mạch và cho vào ống nghiệm chứa Heparin để chống đông Bệnh phẩm cần được vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm để tiến hành phân tích.
Mẫu phân tích gen cần lấy 2ml máu toàn phần trong ống nghiệm chống đông EDTA và bảo quản ở -20 oC cho đến khi sử dụng Ống chứa máu phải ghi đầy đủ thông tin bao gồm mã bệnh nhân, tên, tuổi và ngày lấy mẫu Tất cả thông tin liên quan đến mẫu máu của bệnh nhân cần được lưu trữ trong sổ bàn giao mẫu và nhật ký thí nghiệm tách DNA tổng số.
Phân tích định lượng sinh hóa máu và nước tiểu
Bệnh phẩm được phân tích tại khoa Sinh hóa, bệnh Viện Nhi Trung Ương
Bệnh nhân được xét nghiệm tại những mốc thời gian khác nhau: vào viện, ra viện,
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU The study analyzed key biochemical indicators at one month and six months post-discharge, including urine protein concentration, urine protein/creatinine ratio, blood protein levels, serum albumin, and serum creatinine, using the automated biochemical analysis system AU2700 (Beckman Coulter).
Phân tích đa hình gen NPHS2
Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình khuyến cáo của hãng Quy trình tách chiết DNA được trình bày ở Phụ lục 1
Để kiểm tra và định lượng DNA tách chiết, DNA được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,7% với đệm TAE 1X Cụ thể, 5 µl DNA được trộn với 1 µl đệm tra mẫu có chứa ethidium bromide (50 µg/ml) Quá trình điện di diễn ra ở hiệu điện thế 90 volt trong 1 giờ, và các băng DNA được phát hiện dưới ánh sáng UV.
Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tách chiết được xác định thông qua việc đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280) ADN đạt độ tinh sạch cao khi tỷ lệ OD 260/OD 280 nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2,0.
Quy trình kiểm tra chất lượng DNA bằng điện di được trình bày ở Phụ lục
Chúng tôi đã sử dụng phần mềm PerlPrimer phiên bản 1.1.1 để tự thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR, cụ thể là mồi nhân dòng exon 2, và đã đặt tổng hợp hóa học tại công ty IDT ở Mỹ.
Nhân dòng exon 2 của gen NPHS2 bằng phương pháp PCR, nguyên tắc của PCR là tạo ra một lượng lớn DNA cần phân tích từ DNA khuôn thông qua hoạt động của enzyme ADN polymerase để tổng hợp sợi mới Chất lượng sản phẩm PCR được đánh giá bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Bảng 2.1 Thành phần và chu trình nhiệt PCR nhân dòng exon 2 của gen NPHS2
Thể tích (àL) Điều kiện (chu trình nhiệt) dNTP (2mM) 2,5 * Biến tính đầu: 95 o C trong 3’
Mồi xuụi (10 pmol/àl) 0,75 Mồi ngược (10 pmol/àl) 0,75
Xác định kiểu gen exon 2 của gen NPHS2 đã được thực hiện thông qua giải trình tự, với 20 mẫu sản phẩm được gửi tới hãng IDT tại Malaysia Kết quả giải trình tự sau đó được phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên bản 7.1.9 để xác định kiểu gen cho từng bệnh nhân.
Sau khi nhận được kết quả giải trình tự, việc đọc kiểu gen được thực hiện bằng cách xác định từng nucleotide qua các đỉnh màu sắc đặc trưng: A hiển thị bằng màu xanh lá cây, C bằng màu xanh da trời, G bằng màu đen và T bằng màu đỏ Nếu tại vị trí của một nucleotide chỉ có một đỉnh màu xuất hiện, điều này cho thấy bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp Ngược lại, nếu có hai đỉnh màu, bệnh nhân sẽ có kiểu gen dị hợp.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Trẻ mắc HCTHTP nhập viện (N9) Điều trị tấn công 4 tuần Liều prednisolon 2mg/kg/24h
Có thuyên giảm không ? Điều trị duy trì 4-8 tuần
Liều prednisolon 1,5mg/kg/48h Điều trị tiếp 2 tuần Liều prednisolon 2mg/kg/24h
- Hoặc có tái phát nhưng vẫn đáp ứng thuốc
- Thuyên giảm không hoàn toàn
- Tái phát và kháng thuốc trong những đợt điều trị sau
Không thuyên giảm (Protein/creatinin
Kháng thuốc sớm nV Đặc điểm chung Chỉ số sinh hóa
Giải trình tự exon 2 Xác định rs3738423
Phân tích mối liên quan
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20.0
Phân tích phương sai (ANOVA) được chia thành hai loại: một nhân tố và hai nhân tố, trong khi kiểm định Chi-Square (χ²) được sử dụng cho các trường hợp tương ứng Kết quả với p 0,05.
Bàn luận về đặc điểm chung
Nghiên cứu cho thấy hội chứng thận hư phổ biến hơn ở nam giới so với nữ giới, với tỷ lệ nam/nữ trong các nghiên cứu như Nguyễn Ngọc Sáng là 2,7/1, Trần Hữu Minh Quân là 2/1, Chang là 2,8/1 và Wong là 2,5/1.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tuổi khởi phát bệnh trung bình là 4,2 ± 2,8 tuổi, không có sự khác biệt so với các nghiên cứu khác Cụ thể, độ tuổi khởi phát của bệnh nhi mắc HCTHTP trong nghiên cứu của Đoàn Thị Thắm là từ 1-8 tuổi, còn của Patrick Niaudet là từ 2-7 tuổi Điều này cho thấy độ tuổi khởi phát và độ tuổi trung bình của bệnh nhân mắc HCTHTP chủ yếu nằm trong giai đoạn tiền học đường và học đường.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Kết quả cận lâm sàng
Trong hội chứng thận hư, các chỉ số cận lâm sàng như protein máu, albumin máu, protein niệu và protein/creatinine niệu rất quan trọng cho việc chẩn đoán, theo dõi và điều trị Bệnh nhân được phân chia thành ba nhóm dựa trên mức độ đáp ứng với corticosteroid: nhóm nhạy cảm (NC), nhóm kháng thuốc sớm (KTS) và nhóm kháng thuốc muộn (KTM) Việc theo dõi được thực hiện tại nhiều thời điểm, bao gồm lúc vào viện, ra viện, sau 1 tháng và sau 6 tháng ra viện Kết quả xét nghiệm sinh hóa máu và nước tiểu sẽ được trình bày qua các biểu đồ.
Biểu đồ 3.2 Giá trị trung bình của protein máu của các nhóm bệnh nhân NC (hình trám), KTS (hình vuông) và KTM (hình tam giác) tại các thời điểm
Kí hiệu * thể hiện giá trị p giữa nhóm NC và nhóm KTS : * pT) của exon 2
Không có alen đột p biến Có alen đột biến
Sự tương tác giữa alen đột biến rs3738423 C>T trên exon 2 và mức độ đáp ứng với thuốc corticosteroid không ảnh hưởng đến protein niệu trong các lần xét nghiệm, với các chỉ số p > 0,05.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3.4.4 Chỉ số protein/creatinin niệu
Bảng 3.14 Chỉ số albumin máu theo mức độ đáp ứng corticosteroid và alen đột biến rs3738423 của exon 2
Protein/creatinin niệu (mg/mmol) ( ± SE)
Phân nhóm rs3738423 (C>T) của exon 2
Không có alen đột p biến Có alen đột biến
Sự tương tác giữa alen đột biến rs3738423 C>T trên exon 2 và mức độ đáp ứng thuốc corticosteroid đã ảnh hưởng đến tỷ lệ protein/creatinin niệu tại thời điểm vào viện và ra viện, với các giá trị p lần lượt là 0,002 và 0,000 Bệnh nhân mang alen đột biến trong nhóm KTS có chỉ số protein/creatinin niệu cao gần gấp đôi so với bệnh nhân không mang alen đột biến Ngược lại, bệnh nhân mang alen đột biến trong nhóm NC và KTM lại có chỉ số protein/creatinin niệu thấp hơn so với những bệnh nhân không mang alen đột biến trong cùng nhóm.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Bàn luận về đa hình thái đơn rs3738423 với các chỉ số sinh hóa
Sự tương tác giữa alen đột biến rs3738423 C>T trên exon 2 và mức độ đáp ứng thuốc corticosteroid không ảnh hưởng đến các chỉ số protein máu, albumin máu, protein niệu, nhưng lại tác động đến chỉ số protein/creatinin niệu tại thời điểm nhập viện và xuất viện Đặc biệt, đa hình thái đơn rs3738423 có tác dụng bảo vệ bệnh nhân trong nhóm NC và KTM bằng cách giảm protein/creatinin niệu, trong khi lại làm tăng chỉ số này ở nhóm bệnh nhân KTS Điều này gợi ý rằng đột biến tại vị trí rs3738423 có thể bảo vệ những bệnh nhân có đáp ứng thuốc ban đầu, nhưng lại làm tình trạng xấu đi ở bệnh nhân không đáp ứng Nghiên cứu của Junli cũng cho thấy đa hình này bảo vệ bệnh nhân gốc Trung Quốc, nhưng không có tác dụng tương tự ở nhóm bệnh nhân từ phía Bắc và phía Đông Trung Quốc, có thể do sự khác biệt về tần số alen hoặc biến thể di truyền giữa các miền.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU