Khóa luận phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát

TỔ NG QUAN TÀI LI Ệ U

T Ổ NG QUAN V Ề H Ộ I CH Ứ NG TH ẬN HƯ TIÊN PHÁT

Hội chứng thận hư là một biểu hiện phổ biến của bệnh cầu thận nguyên phát, diễn ra kéo dài nhiều năm với các đợt bột phát và thời kỳ thuyên giảm Hội chứng này được đặc trưng bởi sự tổn thương ở cầu thận, dẫn đến các triệu chứng lâm sàng và sinh hóa như phù, protein niệu cao, giảm protein máu, rối loạn lipid máu và khả năng đái ra mỡ.

Hội chứng thận hư tiên phát là tình trạng không có nguyên nhân rõ ràng, thường khởi phát từ 3 tháng tuổi trở lên Bệnh lý này có ba hình thái tổn thương cầu thận: tổn thương tối thiểu, xơ cứng hoặc hyalin hoá cục bộ và tăng sinh gian mạch lan toả Hội chứng này thường gặp ở trẻ em trong độ tuổi tiền học đường và học đường, đặc biệt từ 5 đến 10 tuổi.

Hội chứng thận hư kháng steroid (Steroid-resistant nephrotic syndrome

SRNS (Hội chứng thận hư kháng corticosteroid) là tình trạng bệnh nhân không đạt được sự thuyên giảm sau khi điều trị bằng liệu pháp corticosteroid tiêu chuẩn Tình trạng này chiếm khoảng 10% - 15% trường hợp hội chứng thận hư ở trẻ em và có nguy cơ tiến triển đến giai đoạn cuối của bệnh thận trong vòng 10 năm Khi đó, bệnh nhân thường cần điều trị bằng lọc máu và ghép thận, dẫn đến chi phí điều trị rất cao.

Tỷ lệ mắc hội chứng thận hư tiên phát (HCTHTP) thay đổi theo độ tuổi, giới tính, chủng tộc và địa lý Ở Việt Nam, độ tuổi mắc bệnh trung bình ở trẻ em là 8,7 ± 3,5 tuổi, trong khi nhiều nghiên cứu quốc tế cho thấy trẻ em trước tuổi đi học thường mắc bệnh nhiều hơn Tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ nam cao gấp đôi so với trẻ nữ (2:1), và trẻ em Châu Á có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn trẻ em Châu Âu (6:1) Trẻ em Châu Phi ít mắc HCTHTP, nhưng khi mắc thường có tình trạng kháng corticosteroid Tại Mỹ, tỷ lệ mắc mới hàng năm ước tính từ 2,0 đến 2,7 trên 100.000 ca, trong khi tỷ lệ hiện mắc là 16 trên 100.000 người Ở Anh, tỷ lệ mắc mới hàng năm ở trẻ em gốc Á cao gấp 6 lần so với trẻ em Châu Âu.

Tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Vĩnh Ninh, tỷ lệ trẻ em mắc hội chứng thận hư (HCTH) dao động từ 0.5% đến 1% trong tổng số bệnh nhi điều trị nội trú, trong khi đó, tại Bệnh viện Nhi Trung Ương, tỷ lệ này gần 2% và chiếm 40% tổng số bệnh nhân của khoa thận.

Hình 1.1 T ỉ l ệ m ắ c h ộ i ch ứ ng th ận hư ở m ộ t s ố nướ c trên th ế gi ớ i [27]

1.1.2 Cơ chế sinh bệnh học

Cơ chế sinh bệnh học của hội chứng thận hư tiên phát (HCTHTP) vẫn chưa được hiểu rõ, nhưng nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng có sự rối loạn chức năng của tế bào lympho T, dẫn đến sự rối loạn trong đáp ứng miễn dịch Sự xuất hiện của các protein, đặc biệt là albumin trong nước tiểu, liên quan đến biến đổi cấu trúc màng lọc, làm mở rộng lỗ lọc và mất điện tích âm của màng đáy Một số bệnh nhân có điện tích dương trong huyết tương, cho phép các phân tử protein này trung hòa điện tích âm trên thành mao mạch cầu thận Ngoài ra, yếu tố di truyền cũng được cho là có vai trò trong cơ chế sinh bệnh học của HCTHTP Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự thay đổi của các phân tử creatin trên chân lồi của tế bào biểu mô có chân, như nephrin, podocin và α-actin, cũng góp phần vào sự xuất hiện protein niệu.

Hình 1.2 Cơ chế bệnh học HCTH [53]

Hầu hết bệnh nhân mắc hội chứng thận hư (HCTH) kháng corticosteroid không xác định được nguyên nhân Tuy nhiên, nghiên cứu cho thấy khoảng 25-33% trường hợp HCTH kháng corticosteroid ở trẻ em hoặc HCTH bẩm sinh có liên quan đến các yếu tố di truyền ảnh hưởng đến sự biệt hóa và chức năng của tế bào podocyte.

1.1.3 Biến chứng của liệu pháp corticosteroid trong điều trị HCTHTP

Những bằng chứng về rối loạn miễn dịch là cơ sở để sử dụng corticosteroid và các thuốc ức chế miễn dịch khác trong điều trị HCTHTP

Trước khi corticosteroid được áp dụng, nhiều bệnh nhân mắc hội chứng thận hư (HCTH) đã tử vong hoặc nhanh chóng tiến triển đến giai đoạn cuối của bệnh thận Kể từ năm 1950, corticosteroid đã trở thành phương pháp điều trị chính, giúp giảm tỷ lệ tử vong ở trẻ em mắc HCTH xuống còn khoảng 3% Thuốc này có tác dụng giảm viêm ở cầu thận, góp phần làm giảm hoặc loại bỏ hoàn toàn các triệu chứng của bệnh.

Trẻ em mắc hội chứng thận hư (HCTH) giai đoạn đầu có tỷ lệ đáp ứng với liệu pháp corticosteroid lên đến 90% Tuy nhiên, bệnh có nguy cơ tái phát cao, do đó cần phải theo dõi lâu dài và tuân thủ phác đồ điều trị một cách nghiêm ngặt Ngoài ra, việc điều trị bằng corticosteroid trong thời gian dài có thể dẫn đến nhiều biến chứng nghiêm trọng.

- Thần kinh, tâm thần: rối loạn tâm thần, trầm cảm

- Tim mạch: tăng huyết áp, suy tim mất bù

- Tiêu hóa: bệnh lý dạ dày – tá tràng (loét, chảy máu, thủng), viêm tụy

- Nội tiết: hội chứng Cushing, chậm phát triển ở trẻ em

- Chuyển hóa: tăng glucose máu, đái tháo đường, mất kali

- Cơ xương khớp: loãng xương, hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi, yếu cơ, nhược cơ.

- Mắt: Glaucoma, đục thủy tinh thể dưới bao

- Da: trứng cá, teo da, ban, tụmáu, đỏ mặt, chậm liền sẹo

- Tai biến do ngừng thuốc đột ngột: suy thượng thận cấp

Nhiều nghiên cứu về hội chứng thận hư (HCTH) đã chỉ ra rằng tỷ lệ bệnh nhân kháng thuốc dao động từ 10% đến 20%, và con số này có xu hướng gia tăng theo thời gian Kết quả nghiên cứu của Lê Nam Trà và các cộng sự cũng xác nhận tình trạng này, nhấn mạnh sự cần thiết phải tìm kiếm các phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân HCTH.

Trong một nghiên cứu về 42 trẻ mắc hội chứng thận hư kháng corticosteroid, việc điều trị bằng methylprenisolon liều cao truyền tĩnh mạch cho thấy tỷ lệ thuyên giảm hoàn toàn đạt 33,3%, thuyên giảm một phần 30,9% và không đáp ứng 35,7% Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng đột biến gen mã hóa các protein cấu trúc màng lọc cầu thận có thể là nguyên nhân gây kháng thuốc, với di truyền khả năng đáp ứng và không đáp ứng với corticosteroid ngày càng được công nhận Câu hỏi về cơ chế dẫn đến hiện tượng kháng corticosteroid muộn ở những bệnh nhân ban đầu đáp ứng với thuốc cũng đang được đặt ra Do đó, xét nghiệm gen di truyền trở thành công cụ quan trọng trong việc xác định các đột biến liên quan đến hội chứng thận hư và tính kháng steroid, từ đó hướng đến các phương pháp điều trị hiệu quả và giảm thiểu các trường hợp sinh thiết thận không cần thiết trong tương lai.

1.1.4 Tổng quan về gen liên quan đến hội chứng thận hư tiên phát

Trong hơn hai thập kỷ qua, nghiên cứu về cơ sở phân tử của hội chứng thận hư (HCTH) kháng corticosteroid đã được thực hiện trên cả các trường hợp di truyền và ngẫu nhiên Các đột biến trong gen mã hóa protein ở tế bào biểu mô có chân (podocyte) đã được xác định là nguyên nhân chính gây ra HCTH kháng corticosteroid di truyền Đến nay, đã phát hiện các đột biến ở 10 gen, bao gồm NPHS1, NPHS2, PLCE1, CD2AP, ACTN4, TRPC6, INF2, MYO1E.

PTPRO và ARHGDIA) liên quan đến các dạng khác nhau của HCTH kháng corticosteroid đã được mô tả và 11 gen khác cũng được xác định là có liên

V NU quan (WT1, LMX1B, LAMB2, ITGB4, SCARB2, COQ2, PDSS2, MTTL1,

Các nghiên cứu toàn cầu đã chỉ ra rằng các gen SMARCA, MYH9 và NXF5 là những nguyên nhân phổ biến nhất gây ra hội chứng thận hư (HCTH) kháng corticosteroid.

- Đột biến gen NPHS1 mã hóa nephrin của tế bào podocyte, thường gặp ở lứa tuổi nhỏ, đặc biệt trong HCTH bẩm sinh thể Phần Lan [31, 36]

Đột biến gen NPHS2, chịu trách nhiệm mã hóa protein podocin trong tế bào podocyte, thường xuất hiện ở người lớn và có liên quan đến hội chứng thận hư kháng thuốc mang tính chất gia đình Tại Châu Âu và Trung Đông, khoảng 10-30% trẻ em mắc hội chứng thận hư kháng thuốc có đột biến này, trong khi tỷ lệ này thấp hơn ở trẻ em Mỹ gốc Phi.

Gen WT1 đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự sản xuất protein liên quan đến sự phát triển của thận và hệ sinh dục Đột biến trong gen WT1, liên quan đến khối u Wilms, thường xuất hiện ở bệnh nhân mắc hội chứng thận hư tiên phát kháng corticosteroid.

T Ổ NG QUAN V Ề GEN NPHS2

Gen NPHS2 ở người được xác định vị trí vào năm 2000, có độ dài khoảng 25 kb trên vai dài nhiễm sắc thể số 1 (1q25-q31) và bao gồm 8 exon

Gen NPHS2 nằm trên nhiễm sắc thể số 1 và mã hóa protein podocin Cấu trúc của gen bao gồm các exon được biểu thị bằng hình chữ nhật màu đen, trong khi các intron được thể hiện bằng đường gạch nối giữa các exon Vùng không dịch mã (UTR) cũng được chỉ ra trong cấu trúc này Hình ảnh cung cấp cái nhìn tổng quan về cấu trúc protein podocin (Nguồn: Genetics in Medicine)

NPHS2 mã hóa protein podocin, chủ yếu được biểu hiện ở tế bào podocyte trong cầu thận, nơi mà tế bào này bao quanh bề mặt ngoài của màng lọc Podocyte, với cấu trúc đặc biệt, tạo ra các chân bám vào màng đáy, tạo ra các lỗ lọc có đường kính khoảng n Å cho dịch lọc đi qua Podocin, một protein màng có 383 axit amin và trọng lượng 42 kD, thuộc họ stomatin và có cấu trúc giống như kẹp tóc, với cả hai đầu nằm trong tế bào chất Protein này tồn tại dưới dạng oligo trên màng lipid kép và tập trung tại các khe của màng lọc cầu thận, nơi nó tương tác với các protein khác như CD2AP và nephrin.

Tế bào biểu mô có chân trên màng đáy của cầu thận đóng vai trò quan trọng trong việc tương tác với các protein cấu tạo nên tế bào, góp phần vào chức năng của thận (Nguồn: Diagnostic Pathology: Kidney diseases E-Book by Robert B Colvin, Anthony Chang).

1.2.2 Đa hình di truyền gen NPHS2

Kruglyak và Nickerson (2001) ước tính rằng hai hệ gen người bình thường trung bình có trình tự nucleotit giống nhau tới 99,9% Trong phần khác biệt di truyền còn lại, khoảng 90% là các đa hình đơn nucleotit (SNP) SNP là đột biến thay thế một nucleotit trong trình tự ADN với tần số lớn hơn 1% trong quần thể Nhiều nghiên cứu cho thấy hầu hết các SNP phổ biến chỉ có hai alen và khoảng 2/3 các SNP trong hệ gen người có nguồn gốc từ các đột biến đồng hoán SNP có ý nghĩa quan trọng vì nó là loại biến dị di truyền phổ biến và ổn định, với hơn 99,9% trình tự hệ gen giống nhau, trong khi sự biến đổi của phần còn lại có ảnh hưởng lớn đến cách con người phản ứng với bệnh tật và các yếu tố môi trường.

Các SNP nằm trong vùng mã hóa của gen có thể thay đổi cấu trúc và chức năng của protein, là một trong những yếu tố quan trọng trong chẩn đoán bệnh và lý giải sự khác biệt trong đáp ứng thuốc giữa các cá nhân Những điểm đa hình nucleotit này mở ra tiềm năng lớn trong nghiên cứu tác động của chúng đến con đường sinh bệnh học Mặc dù tác động của từng SNP riêng lẻ tương đối yếu, nhưng sự kết hợp của chúng có thể làm tăng đáng kể nguy cơ mắc bệnh Ngoài ra, các SNP còn liên quan đến khả năng đáp ứng thuốc, hấp thụ và chuyển hóa thuốc, cũng như các phân tử khác Do đó, nghiên cứu mối liên hệ giữa các SNP và sự hình thành bệnh là cần thiết để xác định các chỉ thị di truyền đặc trưng cho từng quần thể.

Kỹ thuật sinh học phân tử cho phép phân tích nhanh chóng và hiệu quả kiểu gen của hàng trăm ngàn cá nhân thông qua việc xác định hàng trăm ngàn SNP, nhờ vào cấu trúc đơn giản chỉ với một nucleotit Các nhà di truyền học kỳ vọng sẽ hoàn thiện bản đồ SNP liên quan đến bệnh lý trong tương lai, từ đó giải mã chức năng gen ở từng cá thể, giúp dự đoán nguy cơ mắc bệnh và cung cấp lời khuyên phù hợp trong việc phòng bệnh cho mỗi cá nhân.

Nhiều dạng đa hình gen NPHS2 đã được xác định, trong đó chủ yếu là các SNP (Hình 1.5)

Hình 1.5 Các độ t bi ế n trên podocin

Các nhà khoa học đã phát hiện 89 đột biến điểm trên 8 exon của gen NPHS2, trong đó 56 đột biến từ exon 1 đến exon 6 có liên quan chặt chẽ tới hội chứng HCTHTP, trong khi 33 đột biến ở exon 7 và 8 chưa có mối liên hệ rõ ràng nào với hội chứng này Ngoài ra, một số nghiên cứu cũng đã xem xét các đột biến trên intron của NPHS2, nhưng chưa xác định được mối liên hệ rõ ràng giữa các đột biến này với HCTHTP kháng thuốc.

Đã có 37 biến thể đa hình của gen NPHS2 được xác định, bao gồm 22 SNP trong vùng mã hóa, trong đó 8 SNP gây ra sự thay đổi axit amin và 14 SNP không ảnh hưởng đến cấu trúc axit amin Ngoài ra, còn có 45 đột biến khác nằm trong vùng không mã hóa, với 13 thay đổi ở intron, 26 thay đổi ở vùng promoter và 6 thay đổi ở vùng 3 UTR Đặc biệt, đột biến p.R229Q (c.686G>A) là một ví dụ điển hình, trong đó nucleotit G tại vị trí 686 trong exon 5 được thay thế bằng A, dẫn đến sự thay đổi axit amin từ arginine sang glutamine.

[21] Vì vậy, các đặc điểm sinh học của chuỗi peptit được mã hóa đã thay đổi

Nghiên cứu invitro cho thấy podocin đã giảm đáng kể liên kết với nephrin

[63] Tỷ lệ xuất hiện alen p.R229Q (c.686G> A) phụ thuộc vào dân tộc: 0,03- 0,13 ở châu Âu [25, 42, 63], và 0,005-0,025 ở các cá nhân từ gốc Phi Châu

Các biến thể p.A61V (c.182C>T) và p.A242V (c.725C>T) là những SNP ảnh hưởng đến protein mã hóa, chủ yếu được tìm thấy ở người Mỹ gốc Phi với tần suất lần lượt là 0,015 và 0,076, theo dự án giải mã gen NHLBI Năm 2011, nghiên cứu của Ren Q và Yu Sy trên 35 bệnh nhân nhi và 30 người đối chứng khỏe mạnh đã phát hiện 3 SNP: 288C>T thể dị hợp ở exon 2, 945T>C thể đồng hợp và 1038A>G thể dị hợp ở exon 8.

CÁC NGHIÊN C Ứ U V Ề ĐA HÌNH DI TRUYỀ N GEN NPHS2 Ở B Ệ NH NHÂN M Ắ C HCTHTP

Nghiên cứu toàn cầu đã chỉ ra rằng đa hình di truyền gen NPHS2 có liên quan đến hội chứng thận hư ở các nhóm bệnh nhân khác nhau Năm 2000, Boute và các cộng sự lần đầu tiên phát hiện ra đột biến gen NPHS2, cho thấy sự tồn tại của đột biến gen lặn trên nhiễm sắc thể thường ở bệnh nhân.

Mỹ và hệ thống kháng thuốc đã chỉ ra rằng tần số đột biến gen NPHS2 khác nhau giữa các quần thể, cho thấy ảnh hưởng quan trọng của chủng tộc Nghiên cứu về các đa hình di truyền của gen NPHS2 đã xác nhận rằng chúng có tác động đáng kể đến sự phát triển của các bệnh liên quan.

Với các đặc điểm lâm sàng khác nhau, bệnh nhân V NU có thể gặp phải tình trạng protein niệu xuất hiện sớm, tiến triển nhanh chóng đến bệnh thận giai đoạn cuối, cùng với sự khác biệt rõ rệt về thể mô bệnh học.

Nghiên cứu về đột biến gen NPHS2 cho thấy sự không đồng thuận về exon nào ảnh hưởng nhiều nhất đến hội chứng thận hư (HCTH) và đột biến nào là nghiêm trọng nhất Berdeli (2007) đã khảo sát 295 trẻ em mắc HCTHTP kháng thuốc tại Thổ Nhĩ Kỳ, phát hiện 41 trường hợp (13,8%) có tiền sử gia đình và 254 trường hợp (86,2%) là ngẫu nhiên Phân tích 8 exon của gen NPHS2 cho thấy 53 đột biến, trong đó có 37 đột biến mới, với tỷ lệ phát hiện tổng cộng là 24,7% Nghiên cứu của Basiratnia (2013) trên 99 trẻ em tại Tây Nam Iran đã đề xuất phác đồ điều trị mới cho nhóm kháng corticosteroid dựa trên các đột biến gen NPHS2 Joshi và cộng sự (2013) chỉ ra sự đa dạng về đột biến gen NPHS2 ở các chủng người và quốc gia khác nhau, từ đó khuyến nghị một cách tiếp cận hệ thống để kiểm tra di truyền cho từng bệnh nhân HCTH kháng thuốc nhằm hỗ trợ bác sĩ trong việc lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp.

Một số nghiên cứu đã phân tích các exon của gen NPHS2 ở bệnh nhân mắc hội chứng thận hư kháng steroid nhưng không phát hiện đột biến nào Nghiên cứu của Dedi Rachmadi và cộng sự năm 2015 tại Indonesia cho thấy không có mối liên quan giữa các đa hình di truyền ở exon 1, 2 và 8 với biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân (p>0,05) và không tìm thấy đột biến mới Tuy nhiên, chỉ có 28 trên 59 mẫu được giải trình tự thành công do hạn chế về thời gian và tài chính, điều này cho thấy có thể các exon khác của gen NPHS2 có thể đóng vai trò trong cơ chế sinh bệnh học của hội chứng thận hư kháng.

V NU corticosteroid chưa được chứng minh trong nghiên cứu này và cần thực hiện các nghiên cứu tiếp theo

Tại Việt Nam, nghiên cứu về bệnh nhân mắc hội chứng thận hư tiên phát (HCTHTP) chủ yếu tập trung vào đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và đánh giá hiệu quả điều trị Tuy nhiên, hiện tại chưa có nghiên cứu nào công bố về đa hình di truyền của gen NPHS2 trong nhóm bệnh nhân này.

Nghiên cứu của chúng tôi nhằm phát triển phương pháp phân tích gen NPHS2, phục vụ cho chẩn đoán và điều trị Hội chứng thận hư (HCTH) cho từng cá thể Đây là một xu hướng điều trị hứa hẹn, mang lại kết quả tối ưu hơn trong tương lai.

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀ N ĐƠN NUCLEOTIT

Gần 300 gen đã được phân tích chi tiết về SNP qua nhiều phương pháp và nhóm người khác nhau SNP được phát hiện vào năm 1980 thông qua enzyme giới hạn, xác định sự thay đổi độ dài của các đoạn ADN Đến năm 1990, SNPs đã thay thế STR (short tandem repeat) như một dấu chuẩn trong nghiên cứu liên kết STR là các đoạn ADN lặp lại từ 2-6 bp, có tính bảo tồn cao và đặc trưng cá thể Phân tích STR thường được dùng trong các nghiên cứu về rối loạn đơn gen, nhưng sau này đã chuyển sang nghiên cứu các bệnh đa yếu tố như loãng xương, tiểu đường, tim mạch, rối loạn tâm thần và ung thư, những bệnh có tần suất cao hơn Quan điểm điều trị hiện nay cũng chú trọng đến ảnh hưởng của di truyền trong đáp ứng thuốc Các bệnh đa yếu tố này liên quan đến nhiều biến đổi gen, mỗi biến đổi đóng góp một phần nhỏ vào tác động tổng thể, và các nghiên cứu với kích thước mẫu lớn giúp phát hiện các biến đổi nhỏ trong gen hiệu quả hơn.

SNP được chọn làm dấu chuẩn vì tính phong phú và độ ổn định cao hơn so với STR Nhiều SNP là các trình tự chức năng, đặc biệt khi chúng xuất hiện trong các gen.

Vùng NU chứa trình tự mã hóa hoặc quy định trong gen, cho phép kiểm tra mối liên hệ trực tiếp giữa kiểu hình và sự thay đổi chức năng của gen.

Nghiên cứu mối liên quan giữa SNP và bệnh lý có thể thực hiện bằng hai phương pháp: phân tích trực tiếp một SNP trong trình tự chức năng kết hợp với đặc trưng bệnh, hoặc sử dụng SNP làm dấu chuẩn cho mất cân bằng liên kết (LD) Theo lý thuyết, mô phỏng máy tính cho thấy LD không mở rộng quá 3 kb trong quần thể người, dẫn đến việc chỉ khoảng 500.000 SNP được sử dụng cho phân tích Tuy nhiên, hiểu biết về tần số tái tổ hợp của genome cho phép phân loại dấu chuẩn, rút ngắn thời gian và kích thước mẫu Việc sử dụng nhiều dấu chuẩn đồng thời đòi hỏi lượng mẫu lớn để phát hiện ảnh hưởng di truyền nhỏ có ý nghĩa thống kê, tạo ra thách thức về kinh tế cho các nghiên cứu quy mô lớn Do đó, hiện nay, phương pháp phân tích gen ứng cử viên dựa trên chức năng sinh học và kiểu hình bệnh đang trở nên phổ biến.

Việc xác định và mô tả số lượng lớn SNP là rất cần thiết để sử dụng chúng như một công cụ di truyền Khoảng vài trăm ngàn SNP sẽ được yêu cầu để xây dựng các bộ dấu chuẩn tối ưu cho nghiên cứu Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định các đa hình di truyền trên ADN, bao gồm kĩ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (RFLP), kĩ thuật sử dụng đầu dò ADN, kỹ thuật đa hình cấu tạo sợi đơn (SSCP), giải trình tự, sắc kí lỏng cao áp biến tính (DHPLC), và chip ADN (SNP microarray).

V NU Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism, viết tắt là RFLP)

RFLP, hay tính đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn, là phương pháp phân tích ADN dựa vào sự khác nhau về kích thước các phân đoạn ADN khi bị cắt bởi enzyme giới hạn Nguyên lý của phương pháp này là enzyme giới hạn nhận diện trình tự ADN đặc hiệu, cắt ADN thành các mảnh có chiều dài khác nhau, sau đó phân tách chúng bằng điện di trên gel agarose/polyacrylamide và chuyển qua màng bằng phương pháp lai Southern blot Trên màng, các đầu dò ADN giúp xác định các đoạn ADN có thể bắt cặp bổ sung RFLP thể hiện sự khác biệt về chiều dài các đoạn giới hạn giữa các mẫu, mỗi đoạn được gọi là alen và có giá trị trong phân tích di truyền Phân tích RFLP thường được kết hợp với kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen cần nghiên cứu, giúp giảm chi phí và ảnh hưởng đến sức khỏe của người nghiên cứu, dẫn đến việc gọi là PCR-RFLP Tùy thuộc vào mục đích và đặc điểm của gen, phương pháp PCR-RFLP có thể được thực hiện theo nhiều cách khác nhau, từ đơn giản hóa đến kết hợp với các phương pháp khác.

Phương pháp phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (Single strand conformation polymorphism, viết tắt là SSCP)

Một phương pháp đơn giản khác được sử dụng trong nghiên cứu đột biến điểm là phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) của phân tử ADN

Cấu trúc không gian ba chiều của phân tử ADN sợi đơn phụ thuộc vào trình tự nucleotit và môi trường xung quanh Khi điều kiện môi trường không thay đổi, bất kỳ sự thay đổi nào trong trình tự nucleotit sẽ dẫn đến sự thay đổi trong cấu hình của sợi đơn Trong quá trình điện di trên gel polyacrylamide không biến tính, các cấu hình khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, từ đó tạo ra sự phân tách rõ rệt.

Nhiệt độ và pH thấp trong môi trường V NU hỗ trợ khả năng phân tách, giúp duy trì cấu hình của các phân tử ADN và dễ dàng phân biệt các trình tự khác nhau.

Phương pháp phân tích ADN dị sợi kép (DHPLC) là một kỹ thuật hiện đại thay thế việc sử dụng gel và điện di để phân tách ADN Thay vào đó, ADN được phân tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ở nhiệt độ cao Sau khi hạ nhiệt độ, các mạch ADN sẽ liên kết với nhau, tạo thành ADN dị sợi kép với các cặp ghép đôi không chính xác Những phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép ADN bình thường, giúp phát hiện các biến thể di truyền một cách hiệu quả.

DHPLC là một kỹ thuật hiệu quả, đơn giản và tự động trong việc đưa mẫu vào Nhờ vào những cải tiến gần đây trong phần mềm dự đoán đường cong biến tính, phương pháp này đạt độ nhạy cao và khả năng tái sử dụng tốt.

Công nghệ VDA nổi bật với nhiều ưu điểm và tỷ lệ phát hiện cao, cho phép xác định các SNP thông qua quá trình lai sản phẩm PCR với mảng array Quá trình này sử dụng đầu dò oligonucleotit trên chip thủy tinh, giúp đo lường sự khác biệt trong liên kết lai giữa oligonucleotit phù hợp và không phù hợp.

Phương pháp giải trình tự

Phần lớn các phương pháp hiện nay được sử dụng để sàng lọc đột biến điểm và SNP là bước đầu trong quá trình xác định Để khẳng định chính xác sự tồn tại của đột biến hay biến đổi, cần phải thực hiện giải trình tự trực tiếp Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự hiện đại đều dựa trên công trình của Sanger và cộng sự.

Phương pháp dideoxyribonucleotide, hay còn gọi là phương pháp dideoxy, được phát triển vào năm 1977 Phương pháp này bắt đầu với một trình tự Sanger giới hạn tại một vị trí cụ thể trên chuỗi ADN, sử dụng oligonucleotide ngắn có trình tự bổ sung với mẫu ADN tại vị trí đó Quá trình kéo dài các mồi oligonucleotide diễn ra nhờ enzyme ADN polymerase.

Trong hỗn hợp phản ứng, các deoxynucleotit A, T, G, C được sử dụng, bao gồm một loại di-deoxynucleotit để ngắt quá trình kéo dài chuỗi Các đoạn ADN ngắn mới tổng hợp sẽ được điện di trên gel polyacrylamide, và hình ảnh thu được sẽ được phân tích để xác định trình tự ADN.

Ngày nay, giải trình tự tự động được áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm, sử dụng enzyme ADN polymerase và hợp chất hóa học để sàng lọc SNPs hiệu quả cao Phương pháp này đã được cải tiến với công nghệ huỳnh quang, cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên toàn bộ hệ gen với độ nhạy cao Giải trình tự cung cấp thông tin chi tiết về loại đột biến, vị trí và hậu quả, nhưng yêu cầu sản phẩm khuếch đại ADN phải tinh khiết và sử dụng hóa chất, thiết bị đắt tiền Mặc dù có hạn chế, giải trình tự vẫn là phương pháp tối ưu để xác định tất cả các đa hình trên phân đoạn cần phân tích, đặc biệt hữu ích cho các nghiên cứu liên quan đến bệnh lý chưa xác định Ngoài ra, nó còn giúp xác định sự xuất hiện của đột biến và cung cấp dữ liệu kiểu gen đầy đủ cho các đối tượng nghiên cứu.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

V Ậ T LI Ệ U NGHIÊN C Ứ U

Mẫu máu toàn phần chống đông EDTA của 149 bệnh nhân nhi người

Việt Nam mắc HCTHTP được lấy từ Bệnh viện Nhi Trung Ương

Tiêu chu ẩ n l ự a ch ọ n b ệ nh nhân:

Các bệnh nhân được chẩn đoán HCTHTP theo tiêu chuẩn của KDIGO năm 2012: Protein niệu ≥ 50 mg/kg/24 giờ hoặc Protein niệu/Creatinin niệu ≥

200 mg/mmol, Albumin máu ≤ 25 g/lít, Protid máu ≤ 56 g/lít [48]

Không mắc các bệnh hệ thống và các bệnh về cầu thận khác; Tự nguyện tham gia nghiên cứu

Tiêu chu ẩ n lo ạ i tr ừ b ệ nh nhân:

HCTH thứ phát: tìm thấy nguyên nhân (Ví dụ: lupus ban đỏ hệ thống, ban xuất huyết dị ứng, ngộđộc…).

Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

Hóa ch ấ t dùng cho tách ADN t ổ ng s ố

E.Z.N.A blood ADN Mini kit (hãng Omega-Biotek)

Hóa ch ất dùng cho điệ n di

Ultra Pure Agarose (hãng Invitrogen); TAE 1X; Ethylene diamine tetra acetic Acid, (EDTA) Disodium Salt, Dihydrate (hãng Affymetrix); 6X ADN loading dye (hãng ThermoScientific); GeneRuler 100 bpPlus ADN Ladder (code:

SM0321, hãng ThermoScientific); Lambda ADN/HindIII Marker (code:

SM0103, hãng ThermoScientific); Tris base (hãng Bio basic); Acid acetic (hãng Merck)

Hóa ch ấ t dùng cho PCR

Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng IDT, Mỹ; Pfu ADN polymerase (hãng Thermo Scientific); dNTPMix 2 mM (hãng Thermo Scientific); Nước khử ion (hãng Omega Biotek)

Eppendorf pipettes with ranges of 0.5 µl - 10 µl, 10 µl - 100 µl, and 100 µl - 1000 µl, along with Thermo tips of 10 µl, 200 µl, and 1000 µl, are essential laboratory tools Additionally, Thermo provides 1.7 ml Eppendorf tubes and 0.2 ml PCR tubes The Cole-Parmer electrophoresis system from the USA and the Prime Thermal Cycler PCR machine from the UK are crucial for molecular biology applications For storage, the Panasonic -30°C refrigerator from Japan is recommended, while the Hettich EBA 21 centrifuge from Germany, VELP Scientifica shaker from Europe, Cole-Parmer gel imager from the USA, and the NP80 Nanophotometer from Germany are vital for various laboratory processes.

2.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 9/2015 đến tháng 3/2017 tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Y dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, nhằm phân tích gen.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện tại Bệnh viện Nhi Trung ương, nơi đối tượng nghiên cứu được lựa chọn liên tiếp cho đến khi quy trình đạt ổn định Đề tài sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger và tối ưu hóa quy trình PCR với các điều kiện như nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ ADN khuôn Mức độ tối ưu được đánh giá thông qua kết quả điện di trên gel agarose Kết quả giải trình tự cho phép tính toán tần số kiểu gen và tần số alen của các SNP, sau đó so sánh tần số alen thu được với tần số lý thuyết theo định luật Hardy-Weinberg khi quần thể ở trạng thái cân bằng.

Phép thử Khi bình phương, được thực hiện bằng phần mềm Excel, là công cụ quan trọng để phân tích kết quả và xử lý số liệu trong nghiên cứu gen Phép thử này giúp đánh giá xem tần số alen thu được có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với tần số alen lý thuyết theo định luật Hardy-Weinberg hay không.

2.2.1 Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm

Mẫu máu toàn phần (2 ml) được lấy từ tĩnh mạch của bệnh nhân nhi mắc HCTHTP tại Bệnh viện Nhi Trung Ương, sau đó được đưa vào ống chứa EDTA và bảo quản lạnh ở nhiệt độ -20 o C cho đến khi sử dụng.

Ống chứa máu phải được ghi rõ thông tin bao gồm mã bệnh nhân, tên, tuổi và ngày lấy mẫu Tất cả thông tin liên quan đến mẫu máu của bệnh nhân cần được lưu trữ trong sổ bàn giao mẫu và nhật ký thí nghiệm tách ADN tổng số.

2.2.2 Tách chiết và kiểm tra chất lượng ADN tổng số

Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình khuyến cáo của hãng Quy trình tách chiết ADN được trình bày ở Phụ lục 1

Ki ểm tra và định lượ ng ADN tách chi ế t

ADN được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,7% với đệm TAE 1X Mẫu ADN được trộn với đệm tra chứa ethidium bromide (50 µg/ml) và điện di được thực hiện ở hiệu điện thế 90 volt trong 1 giờ Các băng ADN được quan sát dưới ánh sáng UV.

Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tách chiết được xác định thông qua việc đo mật độ hấp thụ quang tại bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280) Để ADN được coi là có độ tinh sạch cao, giá trị OD 260/OD 280 cần nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2,0.

Quy trình kiểm tra chất lượng ADN bằng điện di được trình bày ở Phụ lục 2 Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR

Chúng tôi đã sử dụng phần mềm PerlPrimer phiên bản 1.1.1 để tự thiết kế các mồi nhân dòng cho exon 2, 3 và 4, và đã đặt tổng hợp hóa học tại công ty IDT (Mỹ) Đối với các cặp mồi nhân dòng exon 1, 5 và 6, chúng tôi đã sử dụng trình tự được công bố bởi Basiratnia vào năm 2013 Trình tự các mồi được thể hiện trong Bảng 1.

B ả ng 1 Trình t ự m ồ i nhân dòng gen NPHS2

Exon Trình tự mồi (5’ –3’) Độ dài sản phẩm dự kiến

1 GCA GCG ACT CCA CAG GGA CT 414 bp

TCC ACC TTA TCT GAC GCC CC

3 CTA GGA TCA TTC TTA TGC CA 238 bp

4 TCC CTG TTT ATA CCTATT GTC

CCC ATT CCC TAG ATT GCC

5 AAA GGA GCC CAA GAA TCA AG 292 bp AAA TAT TTC AGC ATA TTG GCC

6 GTT TAG GCA TGC TCT CCT C 228 bp

2.2.3 Nhân dòng 6 exon của gen NPHS2 bằng PCR

Nguyên tắc của PCR là nhân bản một lượng lớn các đoạn ADN từ ADN khuôn thông qua hoạt động của enzyme ADN polymerase, giúp tổng hợp các sợi ADN mới Các yếu tố cơ bản cần thiết để thực hiện phản ứng PCR bao gồm nhiệt độ, thời gian và các thành phần hóa học cần thiết cho quá trình tổng hợp.

- Sợi khuôn ADN, tổng hợp chuỗi mới theo nguyên tắc bổ sung

- Hai đoạn mồi xác định vị trí bắt đầu và kết thúc của đoạn ADN cần khuếch đại

- Các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP

- Môi trường đệm cung cấp ion Mg 2+ giúp enzyme hoạt động tối ưu.

Chúng tôi thực hiện các thí nghiệm tối ưu hóa quy trình tổng hợp chuỗi mới để đảm bảo nhân dòng đặc hiệu và ổn định Các yếu tố được điều chỉnh bao gồm nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ ADN khuôn Chất lượng sản phẩm PCR được đánh giá thông qua phương pháp điện di trên gel.

Trình tự lý thuyết và độ dài của các exon từ 1 đến 6 của gen NPHS2 được mô tả chi tiết, với trình tự mồi được đánh dấu màu vàng Thông tin tham khảo có thể tìm thấy trên NCBI với mã NG_007535.1.

4981 gtcccccggg cacgccacgc ggacccgcag cgactccaca gggactgcgc tcccgtgccc

5041 ctagcgctcc cgcgctgctg ctccagccgc ccggcagctc tgaggatgga gaggagggcg

5101 cggagctcct ccagggagtc ccgcgggcga ggcggcagga ctccgcacaa ggagaacaag

5161 agggcaaagg ccgagaggag cggcggaggc cgcgggcgcc aggaggctgg gcccgagccg

5221 tcgggctccg gacgggcggg gaccccgggg gagccccgag cgcccgccgc cacggtggtg

5281 gacgtggatg aggtccgagg ctccggcgag gagggcaccg aggtggtggc gctgttggag

5341 agcgagcggc ccgaggaagg tacggattca gcaccactat ctgctacttt tccaggtggt

5401 aactaagggg cgtcagataa ggtggaaagg gtcatcccca cgagacccac tgaagccaga

16021 tttgacttat tctaatattt ccagcaaagt ctccaagttg tgccaactcc aataccaaga

16081 attggaccaa cagatgctag tcagtgaata cagtgaagtt tcaatataat tattcttttg

16141 ctttaatttt tttaaggtac caaatcctcc ggcttagggg cctgtgagtg gcttcttgtc

16201 ctcatttccc tgctcttcat catcatgacc ttcccttttt ccatctggtt ctgcgtaaag

16261 gtgagattcc ataaggaccc aataggtaat ttcctgaggc ctctcactgg ccacaccatg

16321 cccattctca cttctgtttt ctggtacatg ttattgctcc atgtggaatg ccctcacccc

19501 tctgatatct aggatcattc ttatgccaag gccttttgaa gactttttct ttctgggagt

19561 gatttgaaag gattaaattt ctctttaggt tgtacaagag tatgaaagag taattatatt

19621 ccgactggga catctgcttc ctggaagagc caaaggccct ggtaaaaaaa cactcttttt

19681 tttctaaaca cctctctcct gacttgccaa tttcttcaac ccatgcagat ttgtaatatg

19741 gacctcagat taaatgaagt aacttgattc atgatatctg aattttccaa tctgttactt

20941 atgactaaaa ggaccacaca gcccagtttg ctgggaataa tccctgttta tacctattgt

21001 cctggattac atattataat atataatagt gctctccttt taccctcagg tggaggtggg

21061 atgggccaat ggtctgtaat tagaggctaa gaaaagtaat gtagtgtgca acctgacccc

21121 agaaaggtga aacccaaaca gccttcatgc tagctattta tctgtcactt cctcctcctc

21181 tcttttaggt cttttctttt ttttgccctg cctggatacc taccacaagg ttgaccttcg

21241 tctccaaact ctggagatac cttttcatga ggtaagccaa atgatggctt ttgctttctc

21301 tatacatttt ccatggtcta cctaccgtgg acaaaatgat tatttatact caaaaatagg

21361 aaagaaaaat aatgatatgg actacatcat aacttaaaac ttttgtgcat caaaggacac

21421 aattaacaga gtgcaaaggc aatctaggga atgggggaaa atatttgcaa atcatatctc

23641 aacacattta gttcctctaa ccccacatag gaaaggagcc caagaatcaa gcctgtcatc

23701 caaacttttt tctgcctaga tcgtgaccaa agacatgttt ataatggaga tagatgccat

23761 ttgctactac cgaatggaaa atgcctctct tctcctaagc agtcttgctc atgtatctaa

23821 agctgtgcaa ttccttgtgc aaaccactat gaagcgtctc ctagcacatc gatccctcac

23881 tgaaattctt ctagagagga agagcatcgc ccaagatgca aaggtactta gataaacata

26341 acaatggcca ccagggttta ggcatgctct cctcccacct ggaggctccc actgacatct

26401 gaattcttct ttccacaggt tgccttggat tcagtgacct gtatttgggg aatcaaagtg

26461 gagagaatag aaatgtgggt aggaaattaa ctagcaagaa ctgtatgata aaggaaaata

26521 ttctggtttc attttaaatt tttcatttga aaaattattt tcactgagta ctatagccat

26581 atcagcataa atttataaaa aagagaaaca aatcacctaa tatcttacag ccataacaca

2.2.4 Xác định kiểu gen 6 exon của gen NPHS2 bằng giải trình tự

Hai mươi mẫu sản phẩm đã được gửi đi để giải trình tự tại IDT (Malaysia) Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên bản 7.1.9 nhằm xác định kiểu gen cho từng bệnh nhân.

Cách đọc kiểu gen sau khi có kết quả giải trình tự được thực hiện như sau: mỗi nucleotit được biểu thị bằng một đỉnh với màu sắc đặc trưng: A màu xanh lá cây, C màu xanh da trời, G màu đen và T màu đỏ Tại vị trí của mỗi nucleotit, nếu chỉ có một đỉnh màu xuất hiện, bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp; trong khi đó, nếu có hai đỉnh màu, đó là kiểu gen dị hợp.

2.2.5 Xác định tần số của các SNP thuộc gen NPHS2

Tần số kiểu gen và alen được tính toán bằng công thức xác định, trong đó giả sử kiểu gen X có hai dạng alen là C và T, với ba kiểu gen là CC, CT và TT.

- Tần số của mỗi kiểu gen:

- Tần số của mỗi alen:

Tần số alen C: f (C) = f (CC) + f (CT)

Tần số alen T: f (T) = f (TT) + f (CT) Trong đó, f (CC), f (TT), f (CT): tần số các kiểu gen CC, TT, CT

Quy trình nghiên cứu được tóm tắt thành sơ đồ Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghi ệ m nghiên c ứ u

ĐẠO ĐỨ C NGHIÊN C Ứ U

Nghiên cứu tuân thủ quy định đạo đức trong thiết kế thử nghiệm lâm sàng của Bộ Y tế, đảm bảo bệnh nhân được thông báo đầy đủ về mục đích, lợi ích và tác động bất lợi của nghiên cứu Bệnh nhân tham gia sẽ ký bản đồng thuận và có quyền rút lui bất cứ lúc nào Thông tin cá nhân của bệnh nhân được bảo mật tuyệt đối và chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu.

Thu nhận 149 mẫu máu toàn phần bệnh nhi mắc HCTHTP

Tách chiết ADN tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini kit Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN

Lựa chọn cặp mồi nhân gen

Exon 2, 3 và 4: tự thiết kế mồi sử dụng phần mềm PerlPrimer version 1.1

Exon 1, 5 và 6: sử dụng trình tự công bố bởi Basiratnia năm 2013

PCR nhân dòng 6 exon Tối ưu các thành phần tham gia phản ứng và chu trình nhiệt

Xác định kiểu gen của SNP Giải trình tự Đọc kết quả bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9

Xác định tần số của các SNP nằm trong 6 exon

Tính toán tần số và so sánh với các nghiên cứu đã công bố trên NCBI

V NU đích nghiên cứu Nghiên cứu này được Hội đồng Đạo đức Bệnh viện Nhi

Trung Ương phê duyệt với số ID 796/BVNTW-VNCSKTE và đã được sự đồng ý của tất cả bệnh nhân và cha mẹ họ.

KẾT QUẢ

TÁCH CHI Ế T ADN T Ổ NG S Ố

ADN tổng số từ 149 mẫu máu của bệnh nhân được tách theo kit của Omega-Biotek, sản phẩm ADN tổng số được điện di trên gel agarose 0,7%

Kết quả điện di cho thấy rằng từ mẫu máu của các bệnh nhân, các sản phẩm ADN tổng số đều xuất hiện một băng ADN rõ nét, tương ứng với băng 23,1 kb của marker (Hình 3.1).

Hình 3.1 K ế t qu ả điệ n di ADN t ổ ng s ố trên gel agarose 2% Làn M: Lamda DNA/HindIII marker Làn 01-12: mẫu ADN tổng số thu của bênh nhân có mã sốtương ứng

Kết quả đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm cho thấy nồng độ ADN thu từ 149 mẫu máu dao động từ 31 - 350 ng/µl, với chỉ số OD260/OD280 nằm trong khoảng từ 1,7 đến 2,1 Axit nucleic có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 260 nm nhờ sự hiện diện của bazơ purin và pyrimidin, cho phép xác định nồng độ ADN thông qua giá trị hấp thụ quang A260 Một đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ 50 ng/ml cho dung dịch ADN sợi đôi Đồng thời, đo ở bước sóng 280 nm cho phép đánh giá mức độ tinh sạch của ADN thông qua chỉ số OD260/OD280 Kết quả cho thấy ADN tổng số thu được ít bị đứt gãy, với một băng duy nhất, đảm bảo độ tinh sạch và đủ điều kiện cho các phản ứng nhân dòng tiếp theo.

NHÂN DÒNG 6 EXON C Ủ A GEN NPHS2 B Ằ NG PCR

Chúng tôi đã nghiên cứu và xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng PCR bằng cách thử nghiệm 10 nhiệt độ khác nhau, xung quanh nhiệt độ gắn mồi lý thuyết Kết quả cho thấy sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả của phản ứng PCR.

Kết quả từ hình 3.2 cho thấy băng ADN ở exon 1 rõ nét nhất tại nhiệt độ 54,5 o C đến 66,5 o C; exon 2 từ 50,8 o C đến 58,1 o C; exon 3 từ 50,9 o C đến 58,1 o C; exon 4 từ 51,0 o C đến 59,1 o C; exon 5 từ 53,4 o C đến 57,3 o C và exon 6 tại 56,3 o C Dựa trên các kết quả này, chúng tôi đã chọn nhiệt độ gắn mồi là 56 o C, vì nó nằm trong khoảng nhiệt độ cho phép ADN hiện lên một băng rõ nét ở cả 6 exon.

Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu trên 6 exon của gen NPHS2 Trong hình 3.2, các ký hiệu bao gồm M: marker, ĐC +: đối chứng dương, và ĐC -: đối chứng âm, cùng với nhiệt độ gắn mồi được sử dụng cho các mẫu (°C).

Quá trình tối ưu hóa nồng độ mồi cho sản phẩm PCR được thực hiện với ba nồng độ 0,9; 0,3 và 0,1 pmol/µl trên ba mẫu 29, 49 và 57 Kết quả điện di cho thấy cả 6 exon đều hiện rõ nhất ở nồng độ 0,3 pmol/µl, vì vậy chúng tôi đã chọn nồng độ mồi 0,3 pmol/µl để chạy PCR.

Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy nồng độ mồi tối ưu trên 6 exon gen NPHS2 Làn M là marker 100bp, trong khi các mẫu 29, 49, 57 được chạy PCR với nồng độ mồi lần lượt là 0,9; 0,3 và 0,1 pmol/µl Đối chứng âm được ký hiệu là ĐC-.

T ối ưu nồng độ ADN

Chúng tôi tiến hành tối ưu nồng độ ADN sử dụng trong phản ứng PCR ở cỏc nồng độ: 5, 10, 50, 100 và 500 ng/àl Kết quả điện di trờn 6 exon ở

Hình 3.4 cho thấy băng sáng hiện lên rõ nhất tương ứng với hai cột nồng độ

Nồng độ ADN tối ưu cho PCR ở cả 6 exon được xác định trong khoảng 50 - 100 ng/µl, với băng mờ hơn ở nồng độ 5 và 10 ng/µl, trong khi băng sỏng gần như không xuất hiện ở nồng độ 500 ng/µl Tại dải nồng độ này, sản phẩm PCR cho băng duy nhất, sáng rõ, chứng tỏ phản ứng nhân dòng diễn ra đặc hiệu và tạo ra lượng sản phẩm cao.

Hình 3.4 K ế t qu ả điệ n di s ả n ph ẩ m PCR v ớ i n ồng độ ADN khác nhau trên

6 exon gen NPHS2 Làn M: marker, ĐC -: đối chứng âm, kí hiệu trên các giếng: nồng độ ADN cỏc mẫu (ng/àl.)

Sử dụng điều kiện sau khi tối ưu với thành phần chi tiết ở Bảng 2, chúng tôi đã nhân dòng thành công 6 exon với cùng chu trình nhiệt

B ả ng 2 Thành ph ần và điề u ki ệ n ph ả n ứ ng PCR c ủ a gen NPHS2

(àL) Điều kiện (chu trỡnh nhiệt) dNTP (2mM) 2.5 * Biến tính đầu: 95 o C trong 3 phút

XÁC ĐỊ NH KI Ể U GEN 6 EXON C Ủ A GEN NPHS2 B Ằ NG

Thông qua việc phân tích kết quả giải trình tự kết hợp với cơ sở dữ liệu NCBI, chúng tôi đã xác định tổng cộng 73 SNP trên exon 1, 44 SNP trên exon 2, 32 SNP trên exon 3, 37 SNP trên exon 4, 50 SNP trên exon 5 và 17 SNP trên exon 6.

Chúng tôi đã phát hiện hai đa hình gen mới chưa được công bố: một bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp AT ở vị trí 4 Nu của rs772151217 trên exon 2, và một bệnh nhân khác có kiểu gen TT ở vị trí 2 Nu của rs786204708 trên exon 3 Kết quả giải trình tự gen từ một số mẫu được trình bày trong Hình 3.6.

Hình 3.6 M ộ t s ố k ế t qu ả gi ả i trình t ự gen NPHS2 Hình A: các kiểu gen của đa hình rs3738423 Hình B: đột biến mới trên exon 2, exon 3

Hình 3.7 thể hiện số lượng đa hình trên các exon, trong đó exon 1 có số lượng đa hình cao nhất, tiếp theo là exon 5, exon 2, exon 4 và exon 3, với exon 6 có số lượng thấp nhất.

Nghiên cứu về gen NPHS2 cho thấy số lượng đột biến trên 6 exon đầu tiên chủ yếu là đồng hợp kiểu dại Hầu hết các đa hình phát hiện đều chỉ có một kiểu gen, trong khi những đa hình xuất hiện với nhiều kiểu gen hơn được liệt kê trong Bảng 3.

B ả ng 3 T ổ ng h ợ p các SNP xu ấ t hi ện alen độ t bi ế n c ủ a 149 b ệ nh nhân

Exon SNP Sốlượng bệnh nhân

1 rs1079292 2 Dị hợp rs758564490 1 Dị hợp

2 rs3738423 2 Đồng hợp đột biến

30 Dị hợp Đột biến mới (Sau rs772151217 là 04 Nu)

3 rs200437667 1 Dị hợp Đột biến mới (Sau rs786204708 là 02 nucleotid)

4 rs12401711 13 Dị hợp rs12401708 13 Dị hợp rs528833893 1 Thêm 1 Nu

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Trong hơn một thập kỷ qua, các công bố trên PubMed đã chỉ ra sự đa dạng và chức năng của các đa hình gen NPHS2 trong các nhóm nghiên cứu khác nhau Dựa trên các kết quả nghiên cứu toàn cầu, chúng tôi đã xác định một số SNP trong quần thể nghiên cứu của mình, thuộc hai nhóm đột biến phổ biến là đột biến sai nghĩa và đột biến vô nghĩa Bảng 4 trình bày các đột biến sai nghĩa tương ứng với vị trí trên mRNA và protein, trong khi Bảng 5 liệt kê các đột biến vô nghĩa cũng tương ứng với vị trí trên mRNA và protein.

B ảng 4 Các độ t bi ế n sai nghĩa thuộ c gen NPHS2 trong nghiên c ứ u

Tên SNP Vị trí trên mRNA Exon Vị trí trên protein rs74315342 c.413G>A 3 p.R138Q rs869025495 c.353C>T 2 p.P118L rs74315346 c.479A>G 4 p.D160G rs200437667 c.502C>A 3 p.R168S rs786204583 c.502C>T 4 p.R168C rs530318579 c.503G>A 4 p.R168H rs775006954 c.779T>A 6 p.V260E rs74315345 c.274G>T 1 p.G92C rs74315347 c.538G>A 5 p.V180M rs748812981 c.714G>T 5 p.R238S rs61747728 c.686G>A 5 p.R229Q rs201050491 c.182C>T 1 p.A61V rs61747727 c.725C>T 5 p.A242V

B ảng 5 Các độ t bi ến vô nghĩa thuộ c gen NPHS2 trong nghiên c ứ u

Tên SNP Vị trí trên mRNA Exon Vị trí trên protein rs147672543 c.809T>A 5 p.L270X rs869312746 c.115C>T 1 p.Q39X rs755972674 c.385C>T 3 p.Q129X rs74315343 c.412C>T 3 p.R138X rs12568913 c.586C>T 5 p.R196X rs778055996 c.643C>T 5 p.Q215X rs74315343 c.412C>T 3 p.R138X

T Ầ N S Ố ALEN C ỦA CÁC ĐA HÌNH XUẤ T HI Ệ N TRONG NGHIÊN C Ứ U

Trong nghiên cứu của chúng tôi, đã xác định được 251 SNP trên 6 exon đầu của gen NPHS2, trong đó chỉ có 7 SNP mang alen đột biến Tần số kiểu gen và tần số alen được trình bày chi tiết trong Bảng 6, trong khi các SNP còn lại đều có kiểu gen đồng nhất ở tất cả mẫu nghiên cứu.

B ả ng 6 T ầ n s ố ki ể u gen và t ầ n s ố alen c ủ a 6 SNP xu ấ t hi ện alen độ t bi ế n

SNP Tần số kiểu gen Tần số alen Giá trị p Đồng hợp kiểu dại

Dị hợp Đồng hợp đột biến

Alen đột biến rs1079292 0,987 0,013 00 0,993 0,007 0,934 rs758564490 0,993 0,007 00 0,997 0,003 0,967 rs3738423 0,785 0,201 0,014 0,886 0,114 0,961 rs200437667 0,993 0,007 00 0,997 0,003 0,967 rs12401711 0,913 0,087 00 0,956 0,044 0,578 rs12401708 0,913 0,087 00 0,956 0,044 0,578 rs528833893 0,993 0,007 00 0,997 0,003 0,967

Khi bình phương cho giá trị p > 0.05 cho thấy rằng cấu trúc di truyền của các alen ở người Việt Nam có khả năng đã ổn định Điều này được chứng minh qua việc nghiên cứu trên 149 bệnh nhân, cho thấy tính đại diện của quần thể này.

BÀN LUẬ N

V Ề T ỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 6 EXON ĐẦ U

Đột biến gen NPHS2 liên quan đến tính kháng corticosteroid ở bệnh nhân HCTHTP, gây khó khăn trong điều trị và tái phát ngay cả sau ghép thận Do đó, nghiên cứu di truyền ở bệnh nhân HCTHTP đang được chú trọng trên toàn cầu, với nhiều kết quả đáng kể trong việc xác định các đột biến gen liên quan.

Quy trình phân tích gen NPHS2 trong nghiên cứu của chúng tôi bao gồm các bước tách chiết ADN tổng số, PCR nhân dòng 6 exon, giải trình tự và phân tích kết quả Mỗi bước đều được kiểm tra chất lượng sản phẩm thông qua phương pháp điện di trên gel agarose hoặc đo quang.

Tách chiết ADN là bước quan trọng trong quy trình sinh học phân tử, đảm bảo ADN không bị đứt gãy và không nhiễm tạp chất, từ đó đảm bảo độ chính xác cho kết quả PCR và giải trình tự gen Kết quả thu được cho thấy, tất cả mẫu ADN của bệnh nhân sau khi tách chiết đều có nồng độ cao và độ tinh sạch đạt từ 1,7 đến 2,1, được đo trên máy quang phổ kế Nano-drop ở bước sóng 260/280nm.

Kết quả tách chiết ADN của chúng tôi có độ ổn định và tính lặp lại cao, với sản phẩm ADN tổng số đạt tiêu chuẩn về độ tinh sạch Do đó, sản phẩm ADN sau tách chiết rất phù hợp cho các bước tiếp theo trong quy trình nghiên cứu, đảm bảo độ chính xác của kết quả.

Phản ứng PCR là bước quan trọng để khuếch đại đoạn gen cần phân tích, dựa trên nguyên tắc tạo ra lượng lớn ADN đặc thù từ ADN khuôn thông qua hoạt động của ADN-polymerase Các yếu tố cơ bản cho phản ứng PCR bao gồm sợi khuôn ADN, hai đoạn mồi, các loại nucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), môi trường đệm và enzyme Taq từ Thermus aquaticus Ngoài ra, nhiệt độ nóng chảy của mồi, thời gian và số lượng chu kỳ phản ứng cũng ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm PCR Trong nghiên cứu này, chúng tôi tối ưu hóa ba yếu tố liên quan đến phản ứng.

Nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ ADN khuôn là những yếu tố quan trọng trong việc nghiên cứu exon 6 của gen NPHS2 Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào số lượng các bazơ nitơ A, T, G, C trong mỗi cặp mồi, và thường được các công ty cung cấp khuyến cáo Nghiên cứu của Basiratnia (2013) đã xác định nhiệt độ gắn mồi cho exon 5 là 52°C, trong khi các exon 1, 2, 6, 7 được chọn ở nhiệt độ 60°C.

Quá trình thực hiện phản ứng PCR cho 6 exon với nhiệt độ khác nhau có thể gây phức tạp, do đó chúng tôi đã tối ưu hóa lựa chọn một nhiệt độ gắn mồi chung để đảm bảo hiệu quả Nồng độ mồi cũng rất quan trọng; nếu quá cao, có thể dẫn đến liên kết không đặc hiệu, trong khi nồng độ quá thấp lại làm giảm hiệu suất PCR Kết quả tách chiết ADN đạt yêu cầu về nồng độ và độ tinh sạch, nhưng có sự biến thiên giữa các mẫu, do đó cần tối ưu nồng độ ADN khuôn trong quá trình PCR Quy trình PCR được thực hiện với chu trình nhiệt: biến tính ở 95°C trong 3 phút, 35 chu kỳ (biến tính 95°C trong 30 giây, gắn mồi 56°C trong 30 giây, kéo dài 72°C trong 1 phút) và tổng hợp cuối ở 72°C trong 5 phút với nồng độ mồi 0,3 pmol/µl và nồng độ ADN khuôn 50 ng/µl.

Kết quả thí nghiệm PCR với nồng độ 100 ng/µl cho thấy sản phẩm PCR hoàn toàn tinh sạch, không bị nhiễm ADN ngoại lai, vì các đối chứng đều cho kết quả âm tính Kích thước các băng ADN phải phù hợp với kích thước lý thuyết theo trình tự trên Ngân hàng gen quốc tế Sản phẩm PCR đạt tiêu chuẩn chất lượng tốt khi các băng ADN gọn, sáng và chỉ xuất hiện một băng duy nhất, cho phép sử dụng cho giải trình tự gen.

Giải trình tự hiện vẫn là phương pháp tối ưu để xác định đồng thời tất cả các đa hình trong phân đoạn nghiên cứu, đặc biệt hữu ích cho các nghiên cứu chưa xác định được đa hình liên quan đến bệnh lý Phương pháp này cũng cho phép phát hiện các đột biến và cung cấp dữ liệu kiểu gen toàn diện cho đối tượng nghiên cứu Chúng tôi đã nỗ lực đơn giản hóa quy trình để có thể áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu.

Mẫu máu toàn phần là dạng mẫu dễ thu thập tại các cơ sở y tế, giúp tiết kiệm thời gian và công sức trong quá trình thao tác Nghiên cứu trên 149 bệnh nhân cho thấy quy trình phân tích gen của chúng tôi có độ ổn định, dễ lặp lại và độ chính xác cao Quy trình này sẽ hỗ trợ các nghiên cứu về mối liên quan giữa kiểu gen NPHS2 và hội chứng thận hư (HCTH), một lĩnh vực cần nhiều dữ liệu bổ sung và chưa được đánh giá đầy đủ tại Việt Nam.

V Ề PHÂN TÍCH K Ế T QU Ả SNP XÁC ĐỊNH ĐƯỢ C TRÊN 6

Dựa vào kết quả giải trình tự kết hợp với cơ sở dữ liệu NCBI, chúng tôi đã xác định được 251 SNP trên 6 exon đầu tiên của gen NPHS2 cùng với 2 đột biến mới trên exon 2 và exon 3 Mặc dù đã có nhiều công bố toàn cầu về giải trình tự exon của gen NPHS2, đây là lần đầu tiên chúng tôi công bố kết quả giải trình tự toàn bộ exon của gen NPHS2 ở bệnh nhân nhi người.

Việt Nam đang đối mặt với hội chứng thận hư tiên phát, với nghiên cứu cho thấy mối liên quan giữa các đột biến gen NPHS2 và tiên lượng xấu ở trẻ em mắc HCTH kháng corticosteroid không có tiền sử gia đình Tại Nam Ấn Độ, một nghiên cứu trên 484 bệnh nhân đã phát hiện bốn đột biến NPHS2, chỉ xuất hiện ở nhóm kháng corticoid, không có ở nhóm nhạy cảm Chúng tôi khuyến nghị mở rộng nghiên cứu tại Việt Nam, kết hợp dữ liệu cận lâm sàng và lâm sàng về HCTHTP, nhằm đánh giá mối liên hệ giữa các đa hình di truyền NPHS2 và đáp ứng với thuốc corticoid trong điều trị HCTH.

Chúng tôi đã xác định một số SNP thuộc nhóm đột biến sai nghĩa và vô nghĩa Nhiều nghiên cứu trước đây trên thế giới cho thấy rằng đột biến sai nghĩa là nhóm đột biến phổ biến nhất trong các biến thể của gen NPHS2.

Đột biến rs74315342 (c.413G>A hay p.R138Q) trên exon 3 là đột biến phổ biến nhất tại Châu Âu Axit amin arginine tại vị trí 138 rất quan trọng cho việc duy trì cấu trúc và chức năng của podocin trên màng đáy cầu thận Sự thay thế nucleotit G bằng A có thể ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của protein này.

Nghiên cứu của chúng tôi đã phát hiện sự xuất hiện của đột biến V NU nephrin, liên quan đến mất tính toàn vẹn của màng lọc cầu thận Các đột biến gen mã hóa protein podocin, như p.P118L (c.353C> T), p.D160G (C.479A> G), p.R168S (c.502C> A), p.R168C (c.502C> T), p.R168H (C.503G> A), và p.V260E (c.779T> A), được giữ lại trong mạng lưới nội chất và chứng minh là các đột biến sai nghĩa Ngoài ra, một số đột biến sai nghĩa khác của podocin cũng nhắm mục tiêu đúng vào màng tế bào.

Các đột biến gây hại ảnh hưởng trực tiếp đến chức năng của protein, làm thay đổi đặc tính báo hiệu và tương tác với các protein khác trên màng lọc cầu thận Những đột biến sai nghĩa không chỉ xuất hiện ở một số exon cụ thể mà còn phân bố dọc theo toàn bộ chiều dài của gen, ảnh hưởng đến các miền chức năng khác nhau của podocin Trong số các đột biến sai nghĩa, ba đột biến đã được ghi nhận trong cơ sở dữ liệu giải trình tự, bao gồm p.V290M (C.868G>A) và p.V180M (c.538G>A) với tần suất 1/13006 alen (0.008%), cùng với p.R138Q (c.413G>A) có tần số 8/13006 (0.06%), được cho là thường gặp hơn ở các bệnh nhân.

Nhóm đột biến thứ hai trên gen NPHS2 bao gồm các đột biến vô nghĩa Theo tổng hợp từ các nghiên cứu trước, đã có mười bảy đột biến vô nghĩa được mô tả, trong đó có bốn đột biến mới là p.S46X [c.137C> A] và p.Q219X [c.655C>.

Các đột biến gen được đề cập bao gồm p.R229X [C.685C> T], p.L270X [c.809T> A], và nhiều đột biến khác như p.Q39X (c.115C> T), p.R71X (c.211C> T), p.E87X (c.259G> T), p.W122X (c.366G> A), p.Q129X (c.385C> T), p.R138X (c.412C> T), p.Y162X (c.486C> A), p.R196X (c.586C> T), p.Q215X (c.643C> T), p.E237X (c.709G> T), p.E264X (c.790G> T), p.K289X (c.865A> T), và p.R322X (c.964C> T) Nghiên cứu in vitro cho thấy đột biến p.R138X (c.412C> T) làm mất khả năng giữ nephrin trên màng đáy cầu thận Hơn nữa, phản ứng khuếch đại gen từ sinh thiết thận của bệnh nhân mang đột biến p.R138X không thể phát hiện sản phẩm, cho thấy đột biến này gây phân hủy mRNA.

Nghiên cứu của Karim Bouchireb và các cộng sự (2013) đã cập nhật thông tin về các đột biến trên gen NPHS2 liên quan đến hội chứng thận hư kháng corticosteroid Các đột biến này bao gồm 11 trường hợp chèn thêm hoặc mất bớt nucleotide.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, đã phát hiện 26 đột biến liên quan đến gen podocin, trong đó có 3 đột biến gây lệch khung đọc Các đột biến thêm và mất nucleotit phân bổ rải rác trên toàn bộ chiều dài gen, nhưng chủ yếu tập trung ở vùng PHB và đầu C-terminal Chúng tôi ghi nhận 4 đột biến mất nucleotit ảnh hưởng đến đầu N của podocin: p.Pro89ArgfsX13 (c.264 265del), p.P45RfsX54 (c.134del), p.E56GfsX43 (c.167del), và p.L84WfsX15 (c.249del) Tuy nhiên, nghiên cứu không phát hiện sự xuất hiện của những đột biến này, có thể do kích thước quần thể nghiên cứu nhỏ hoặc những đột biến này có tần số thấp và có thể liên quan đến yếu tố chủng tộc và địa lý chưa được làm rõ.

Ngoài các đột biến ở 6 exon đầu, nhiều nghiên cứu đã xác định các đột biến trong vùng intron và đột biến mã kết thúc Đặc biệt, có 16 đột biến làm thay đổi vị trí cắt đã được mô tả trong các nghiên cứu.

Các đột biến như A, 451 + 3A> T, 452-2A> C, 534 + 1G> T, 535-1G> T, 794 + 5G> T, 873 + 5G> A, 873 + 2T> A, 873> 1G> A, 874-1G> C, và 874-2A> G đều được xác định là nguyên nhân gây bệnh Đặc biệt, phần lớn các đột biến xảy ra tại vị trí cắt ảnh hưởng đến intron 3 và 7, chiếm 58% tổng số đột biến Một đột biến mới, p.X384QextX7 (c.1150T>C), đã được phát hiện trong nghiên cứu của Bouchireb, trong đó sự thay thế một base trong stop codon dẫn đến khung đọc mở dài hơn, tạo ra protein với hơn 390 axit amin và gây ra sự biểu hiện quá mức của podocin trong tế bào chân giả Do đó, cần có các nghiên cứu thực nghiệm trong tương lai để đánh giá tác động chức năng của đột biến này.

Xác định tần số kiểu gen và tần số alen của các đa hình di truyền liên quan đến alen đột biến sẽ giúp nhận diện SNP tiềm năng có liên quan đến đa hình di truyền gen NPHS2 và HCTHTP kháng corticoid trong quần thể người Việt Nam Trong nghiên cứu trên 149 bệnh nhân, ngoài hai đột biến mới ở exon 2 và exon 3, chúng tôi đã phát hiện 7 SNP đa hình tại các exon 1 đến 4, bao gồm rs1079292, rs758564490, rs3738423, rs200437667, rs12401711, rs12401708 và Rs528833893; cũng như các exon 5 và 6.

20 bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư kháng corticoid tại bệnh viện Ali Asghar (Iran) và nghiên cứu của Maruyama trên cả 8 exon ở 36 trẻ em Nhật

Bản mắc HCTH kháng corticosteroid [32, 50] Trong nghiên cứu của Yu năm

Năm 2005, một nghiên cứu trên 23 bệnh nhân người Trung Quốc đã phát hiện một trường hợp đột biến mất dị hợp tử ở 7 đa hình: 51G>T, 288C>T, IVS3-46C>T, IVS3-21C>T, IVS7-74G>C, 954T>C và 1038A>G, xảy ra ở cả bệnh nhân và nhóm đối chứng.

Nghiên cứu về hội chứng thận hư kháng corticosteroid ở một số nhóm người châu Âu cho thấy tỷ lệ xuất hiện đột biến gen NPHS2 dao động từ 12-19% Đặc biệt, các đột biến của gen NPHS2 thường gặp hơn ở trẻ em.

K Ế T LU Ậ N

Từ những kết quả đạt được, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau:

Chúng tôi đã phát triển quy trình phân tích gen NPHS2 cho exon 1 đến 6 bằng cách sử dụng mẫu máu toàn phần Quy trình này đã được tối ưu hóa cho phản ứng PCR với nhiệt độ gắn mồi là 56°C, nồng độ mồi 0,3 pmol/µl, và nồng độ ADN khuôn trong khoảng 50 - 100 ng/µl.

Quy trình phân tích gen đã được áp dụng thành công trên 149 bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát, qua đó xác định được 251 SNP và 2 đột biến mới Tần số alen của các SNP xuất hiện đột biến được thống kê và so sánh với tần số lý thuyết theo định luật Hardy-Weinberg, cho thấy giá trị p > 0,05.

KI Ế N NGH Ị 40 TÀI LI Ệ U THAM KH Ả O

Nghiên cứu tiếp theo cần được thực hiện để đánh giá mối liên quan giữa các đa hình di truyền gen NPHS2 và đáp ứng của bệnh nhân với thuốc corticosteroid trong điều trị hội chứng thận hư.

Xây dựng quy trình phân tích gen NPHS2, bao gồm hai exon còn lại và vùng không mã hóa protein, nhằm xác định các đa hình có thể ảnh hưởng đến đáp ứng với thuốc corticosteroid.

1 Bệnh viện Nhi Trung Ương (2006), "Hướng dẫn chẩn đoán bệnh trẻ em"

2 BioMedia Việt Nam Đa hình đơn nucleotide – Công cụ sử dụng trong di truyền học ở người, truy cập ngày 01 - 03-2018, tại trang web http://www.biomedia.vn/review/da-hinh-don-nucleotide-cong-cu-su- dung-trong-di-truyen-hoc-o-nguoi.html

3 Đinh Đoàn Long and Đỗ Lê Thăng (2008), "Phân tích gen và sản phẩm của gen", Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, Nhà xuất bản Đại học

Quốc gia Hà Nội, tr 325-355

4 Hà Phan Hải An (2015), "Hội chứng thận hư", Bệnh học nội khoa, tập

5 Hồ Huỳnh Thùy Dương (2001), Sinh học phân tử, Nhà xuất bản Y học

6 Hoàng Hà Kiểm (2010), "Thận học lâm sàng", Nhà xuất bản Y học

7 Khuất Hữu Thanh (1997), "Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen", Nhà xuất bản KHKT HN

8 Lê Nam Trà (2009), "Hội chứng thận hư tiên phát", Bài giảng Nhi khoa, tập 2, Nhà xuất bản Y học

9 Lê Thị Nhiên (2016), Nghiên cứu tính đa hình di truyền CYP2C19 ở bệnh nhân đặt Stent động mạch vành qua da, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Dược Hà Nội

10 Nguyễn Gia Khánh (2013), "Bài giảng Nhi khoa", tập 2

11 Nguyễn Ngọc Sáng (1987), Nhận xét về đặc điểm lâm sàng và sinh học qua 52 trường hợp HCTHTP thể kháng thuốc ở trẻ em, Luận văn tốt nghiệp bác sĩ nội trú bệnh viện, Trường Đại học Y Hà Nội

12 Trần Đình Long (1995), "Một số biến chứng của liệu pháp corticoid trong điều trị hội chứng thận hư ở trẻ em", Tạp chí Nhi khoa, 4 (2&3), tr 50-51

13 Andolino TP and Reid-Adam J (2015), "Nephrotic syndrome",

14 Arbeitsgemeinschaft fur Pọdiatrische Nephrologie (1988), "Short versus standard prednisone therapy for initial treatment of idiopathic nephrotic syndrome in children", Lancet, 1, pp 380 –383

15 Azocar M, Vega A et al (2016), "NPHS2 Mutation analysis study in children with steroid-resistant nephrotic syndrome", Rev Chil Pediatr,

16 Bakr A Yehia S, El-Ghannam D and et al (2008), "NPHS2 mutations",

17 Basiratnia M., Yavarian M and Torabinezhad S (2013), "NPHS2

Gene in Steroid-resistant Nephrotic Syndrome Prevalence, Clinical Course, and Mutational Spectrum in South-West Iranian Children",

18 Berdeli A, M.S et al ( 2007), "NPHS2 (podocin) mutations in Turkish children with idiopathic nephritic syndrome", Pediatr Nephrol, 22, pp

19 Bernward Hinkes, C.V et al (2008), "Specific Podocin mutations correlate with age of onset in Steroid-Resistant Nephrotic syndrome", J

20 Bouchireb K, Boyer O and Gribouval O (2013), "NPHS2 mutations in steroid-resistant nephrotic syndrome: a mutation update and the associated phenotypic spectrum", Hum Mutat, 35(2), pp 178-86

21 Boute N, Gribouval O and Roselli S (2000), "NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid- resistant nephrotic syndrome", Nat Genet, 24(4), pp 349-54

22 Budowle B., Adams D.E and Allen R.C (1994), "Fragment-length polymorphisms for forensic science applications", Methods in nucleic acids research, pp 181-202

23 Buscher AK and Weber S ( 2012), "Educational paper: the podocytopathies", Eu J Pediatr, 171 (8), pp 1151-60

24 Butler J.M (2001), "Biology and Technology behind STR marker",

Forensic DNA Typing, Academic Press, London

25 Caridi G, Bertelli R and Carrea A (2001), "Prevalence, genetics, and clinical features of patients carrying podocin mutations in steroid- resistant nonfamilial focal segmental glomerulosclerosis", J Am Soc Nephrol, 12 (12), pp 2742-6

26 Caridi G, Bertelli R et al (2003), "Broadening the spectrum of diseases related to podocin mutations", J Am Soc Nephrol, 14, pp 1278‐86

27 Chanchlani R and Parekh RS (2016), "Ethnic differences in childhood nephrotic syndrome", Front Pediatrics, DOI:

28 Dedi Rachmadi, A.M and Leo Monners (2015), "Gene Mutation and

Polymorphisms in Indonesian Chhildren with Steroid-Resistant Nephrotic Syndrome", Open Journal of Pediatrics, 5, pp 27-33

29 Dusel JA, Burdon KP and Hicks PJ (2005), "Identification of podocin

(NPHS2) gene mutations in African Americans with nondiabetic end- stage renal disease", Kidney Int, 68(1), pp 256-62

30 Eddy AA and Symons JM (2003), "Nephrotic syndrome in childhood",

31 HabibR (1993), "Nephrotic syndrome in the 1 st year of life", Inserm

U, Hospital Necker – Enfant Malades, Paris, France, 7(4), pp 347-

32 Hasan Otukesh, B.G et al (2009), "NPHS2 Mutations in Children with

Steroid-Resistant Nephrotic syndrome", Iranian Journal of Kidney Diseases, 3, pp 99-102

33 Hee Gyung Kang and H.I.C (2015), "Nephrotic syndrome: What’s new, what’s hot?", Korean J Pediatr 58, pp 275-282

34 Hee Yeon Cho, Joo Hoon Lee and Hyun Jin Choi (2008), "WT1 and

NPHS2 mutations in Korean children with steroid resistant nephritic syndrome", Pediatr Nephrol, 23, pp 63-70

35 Hinkes B, Wiggins RC et al (2006), "Positional cloning uncovers mutations in PLCE1 responsible for a nephrotic syndrome variant that may be reversible", Nat Genet, 38, pp 1397–1405

36 Hinkes BG, Mucha B and ) Vlangos CN (2007), "Nephrotic syndrome in the first year of life: Two thirds of cases are caused by mutations in 4 genes (NPHS1, NPHS2, WT1, and LAMB2)", Pediatrics, 119, pp

37 Huber TB, Simons M and Hartleben B (2003), "Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains", Hum Mol Genet,

38 International Study of Kidney Disease in Children (1981), Primary nephrotic syndrome in children: Clinical significance of histopathologic variants of minimal change and of diffuse mesangial hypercellularity, A Report of the International Study of Kidney Disease in Children

39 Jaffer A, Unnisa W et al (2014), "NPHS2 mutation analysis and primary nephrotic syndrome in southern Indians", Nephrology, 19(7), pp 398-403

40 Joshi S, A.R et al (2013), "Genetics of steroid resistant nephritic syndrome: a review of mutation spectrum and suggested approach for genetic testing", Acta Paediatr, 102(9)

41 Kalman Tory, Dora K Menyhard et al ( 2013), "Mutation dependent recessive inheritance of NPHS2 associated steroid resistant nephritic syndrome", Nature Genetics, 46(3), pp 299-304

42 Karle SM, Uetz B and Ronner V (2002), "Novel mutations in NPHS2 detected in both familial and sporadic steroid-resistant nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol, 13(2), pp 388-93

43 Karle SM, Uetz B et al (2002), "Novel mutations in NPHS2 detected in both familial and sporadic steroid-resistant nephrotic syndrome", J Am

44 Kitamura A, Tsukaguchi H et al (2006), "Genetics and Clinical

Features of 15 Asian Families with Steroid-Resistant Nephrotic Syndrome.", HealthNephrology Dialysis Transplantation, 21, pp 3133-

45 Kosskimies O, V.J et al (1982), "Long-termoutcome of primary nephrotic syndrome", Archives of Diseasein Chilhood 57, pp 544-548

46 Kruglyak L and Nickerson D.A (2001), "Variation is the spice of life",

47 Kwok PY and Chen X (2003), "Detection of single nucleotide polymorphisms", Curr Issues Mol Biol, 5(2), pp 43-60

48 Lombel R M., Hodson E M and Gipson D S (2012), "Treatment of steroid-resistant nephrotic syndrome in children: new guidelaines from KDIGO", Pediatr Nephrol, 2304(8)

49 Maddalena Gigante, Matteo Piemontese et al (2011), "Molecular and

Genetic Basic of Inherited nephrotic syndrome ", International Journal of Nephrology, 2011, pp 1-15

50 Maruyama K, Iuima K et al (2003), "NPHS2 mutations in sporadic steroid‐resistant nephrotic syndrome in Japanese children", Pediatr Nephrol, 18, pp 412‐6

51 Mitra Basiratnia, M.Y et al (2013), "NPHS2 gene in Steroid resistant nephritic syndrome Prevelance, clinical course, and mutational spectrum in South West Iranian children", IJKD, 7, pp 357-362

52 Nelson (2000), "Nephrosis", Textbook of Pediatrics, 1129-1133

53 Nephrotic Syndrome: Pathophysiology, Treatment, Complications,

Differential Diagnoses (2017), accessed 01 - 03-2018, from web https://www.healthdiseaseblog.com/2017/09/nephrotic-syndrome- treatment-pathophysiology-complications-differential-diagnosis.html

54 Patrick Niaudet (2004), "Podocin and Nephrotic Syndrome:

Implications for the Clinician", Journal of the American society of Nephrology, 15, pp 832-834

55 Pereira AC, Pereira AB and Mota GF (2004), "NPHS2 R229Q functional variant is associated with microalbuminuria in the general population", Kidney Int, 65(3), pp 1026-30

56 Ren Q and Y.S (2011), "NPHS2 variation in children with late steroid- resistant nephrotic syndrome", New York Science Journal 4, pp 30-33

57 Roselli S, Moutkine I and Gribouval O (2004), "Plasma membrane targeting of podocin through the classical exocytic pathway: effect of NPHS2 mutations", Traffic, 5(1), pp 37-44

58 Ruf RG, Lichtenberger A and Karle SM et al (2004), "Patients with mutations in NPHS2 (podocin) do not respond to standard steroid treatment of nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol 15, pp 722 –732

59 Schumacher V, Scharer K et al (1998), "Spectrum of early onset nephrotic syndrome associated with WT1 missense mutations", Kidney

60 Severine Roselli, Imane Moutkine et al (2004), "Plasma membrane targeting of Podocin through the classical exocytic pathway: Effect of NPHS2 mutations", TRafic, 5, pp 37-44

61 Snustad D P and Simmons M J (2012), "The human Hapmap project", Principle of genetics, John Wiley & Sons, Inc, 414-415

62 Stefanie Weber, Oliver Gribouval and Ernie L (2004), "NPHS2 mutation analysis shows genetic heterogeneity of steroid-resistant nephrotic syndrome and low post-transplant recurrence", Kidney International, 66(2004), pp 571–579

63 Tsukaguchi H, Yager H and Dawborn J (2000), "A locus for adolescent and adult onset familial focal segmental glomerulosclerosis on chromosome 1q25-31", J Am Soc Nephrol, 11(9), pp 1674-80

64 A Vignal and et al (2002), "A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics", Genetics, selection, evolution: GSE, 34(3), pp 275-305

65 Weber S Gribouval O, Esquivel EL and et al (2004), "NPHS2 mutation analysis shows genetic heterogeneity of steroid resistant nephritic syndrome and low post transplant recurrence", Kidney International Supplements, 66(2), pp 571-579

66 What are single nucleotide polymorphisms (SNPs)? , accessed 03 - 01-

2018, from web https://ghr.nlm.nih.gov/primer/genomicresearch/snp

67 Yu Sy Ren Q (2011), "NPHS2 variation in children with late steroid- resistant nephrotic syndrome", New York Science Journal, 4(30-33)

68 Zenker M, Tralau T et al (2004), "Congenital nephrosis, mesangial sclerosis, and distinct eye abnormalities with microcoria: An autosomal recessive syndrome", Am J Med Genet A, 130, pp 138–145

69 Zihua Yu, Jianping Huang et al (2005), "Mutations in NPHS2 in sporadic steroid – resistant nephrotic syndrome in Chinese children",