TỔ NG QUAN
Đau thắt ngực không ổn định
ĐTNKÔĐ là một loại trong hội chứng đau ngực không ổn định (HCĐMVC), được nhận diện qua các triệu chứng lâm sàng của thiếu máu cơ tim, như cơn đau thắt ngực mới xuất hiện, sự biến đổi trong các dạng đau ngực, hoặc sự gia tăng cơn đau thắt ngực khi nghỉ ngơi Trong trường hợp này, không có dấu ấn sinh học nào cho thấy tổn thương cơ tim (như troponin), và điện tâm đồ có thể có những thay đổi nhất định.
1.1.2 Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ
Xơ vữa động mạch (XVĐM) là quá trình hình thành các mảng xơ vữa ở lớp nội mô của động mạch lớn và vừa, dẫn đến thiếu máu cấp tính Các yếu tố nguy cơ như cholesterol máu cao, tăng huyết áp, tiểu đường và hút thuốc lá đóng vai trò quan trọng trong việc khởi phát XVĐM Những yếu tố này gây tổn thương tế bào nội mô, làm giảm hoạt tính sinh học của nitric oxide, tăng sản xuất endothelin, và làm tăng biểu lộ các phân tử kết dính cũng như quá trình đông máu.
Viêm đóng vai trò quan trọng trong sự tiến triển của mảng xơ vữa, bắt đầu từ việc các tế bào nội mô bị tổn thương, dẫn đến sự gắn kết của monocyte với các phân tử dính nội mô Monocyte sau đó đi vào lớp dưới nội mô và biệt hóa thành đại thực bào, thực hiện quá trình tiêu hóa LDL để hình thành tế bào bọt và dải chất béo Để duy trì viêm, các đại thực bào được hoạt hóa tiết ra các chất trung gian, thu hút thêm đại thực bào khác Đồng thời, chúng cũng kích thích sự tăng sinh và hình thành tế bào cơ trơn trong lưới ngoại bào thông qua việc tiết ra các cytokine, góp phần vào sự hình thành mô xơ.
Nguy cơ vỡ mảng xơ vữa phụ thuộc vào kiểu mảng xơ vữa hơn là kích thước
Lõi vữa của mảng xơ vữa chứa nhiều lipid và thiếu collagen hỗ trợ, với kích thước của lõi vữa tỉ lệ thuận với nguy cơ vỡ mảng xơ vữa Viêm đóng vai trò quan trọng trong việc làm tăng độ dễ bị tổn thương của mảng xơ vữa, liên quan đến sự gia tăng hoạt động của đại thực bào và lympho T tại vị trí này Sự gia tăng hoạt động này làm tăng kích thước của lõi xơ vữa.
Các phân tích bệnh học cho thấy sự thiếu hụt tế bào cơ trơn tại các mảng xơ vữa dễ tổn thương Các chất trung gian viêm có thể gây chết tế bào cơ trơn theo chương trình hoặc ức chế tổng hợp collagen Mảng xơ vữa có nguy cơ cao nếu có lõi xơ vữa lớn, vỏ bao mỏng, tập trung dày đặc đại thực bào và lympho T, cùng với lượng tế bào cơ trơn ít, tăng biểu hiện metalloproteinase gây thoái hóa collagen, tăng sinh mạch và xuất huyết tại mảng xơ vữa.
Hình 1.1 Cơ chế b ệ nh sinh c ủa ĐTNKÔĐ (Nguồn: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJM199901143400207)
Khi mảng xơ vữa vỡ ra, lớp dưới nội mô tiếp xúc với tiểu cầu, kích thích hoạt hóa thụ thể trên bề mặt tiểu cầu và dẫn đến quá trình ngưng kết tiểu cầu, hình thành huyết khối Nếu mảng vỡ nhỏ và cục huyết khối không hoàn toàn tắc động mạch vành, chỉ giảm dòng máu tới vùng cơ tim mà động mạch đó nuôi dưỡng, biểu hiện lâm sàng sẽ là cơn đau.
V NU thắt ngực không ổn định Nội soi động mạch vành cho thấy 73,7% bệnh nhân ĐTNKÔĐ có huyết khối trong lòng động mạch vành [27,56]
1.1.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán đau thắt ngực không ổn định
Chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn của ACCF/AHA (2012) (American college of Cardiology Foundation/ American Heart Association) [53]:
- Lâm sàng: cơn ĐTNKÔĐ có thể hiện diện dưới các dạng thức khác nhau:
+ Cơn đau thắt ngực xuất hiện dưới đây (4-8) tuần
+ Cơn đau thắt ngực trầm trọng dần thêm (tần số hoặc cường độ hoặc thời gian các cơn đau, giảm đáp ứng với các dẫn xuất nitrat)
Cơn đau thắt ngực kéo dài hơn 15-20 phút khi nghỉ ngơi và có phản ứng với các dẫn xuất nitrat có thể chỉ ra tình trạng nghiêm trọng, như nhồi máu cơ tim không có sóng Q.
- Điện tâm đồ lúc nghỉ có thể thay đổi
- Men CK-MB, troponin T, Ic không tăng.
Tổng quan về ngưng tập tiểu cầu
Tiểu cầu, thành phần nhỏ nhất của máu, có hình đĩa và đường kính 3-4 µm, không nhân và được sản xuất từ nguyên mẫu tiểu cầu tại tủy xương Dưới kính hiển vi, tiểu cầu có cấu trúc phức tạp với hệ thống màng, vi quản, ống đặc, nhiều hạt và các kênh mở Màng tiểu cầu gồm hai lớp lipid kép bao quanh, chứa glycoprotein (GP) hoạt động như thụ thể bề mặt, đóng vai trò quan trọng trong quá trình đông máu Bên cạnh đó, màng tiểu cầu còn có khả năng nhận và chuyển tín hiệu từ bề mặt thành tín hiệu hóa học bên trong.
1.2.2 Quá trình ngưng tập tiểu cầu Ở trạng thái sinh lý bình thường, khi mạch máu nguyên vẹn, tiểu cầu bị bất hoạt, không bám dính được do hoạt động của nitric oxide, prostacyclin và do khả năng kìm hãm kích hoạt ADP của ADPase (adenosin diphotphatase) từ các tế bào nội mô Tuy nhiên, khi mạch máu bị tổn thương, tiểu cầu sẽ nhanh chóng bám dính vào thành mạch, thay đổi hình dạng, bài tiết và ngưng tập thông qua một loạt phản ứng dẫn đến hình thành nút tiểu cầu tại mô tổn thương Quá trình tạo tiểu cầu hoạt hóa có thểđược chia thành các bước: bám dính, ngưng tập và phóng thích các chất [50]
Khi mạch máu bị tổn thương, các yếu tố kháng tiểu cầu nội sinh suy yếu, làm lộ lớp dưới nội mô chứa các protein dính như collagen và yếu tố von Willebrand (vWF) Tại tốc độ dòng máu cao, vWF đóng vai trò quan trọng trong bám dính tiểu cầu thông qua liên kết với phức hợp GP Ib/IX/V Ngược lại, ở tốc độ dòng máu thấp, bám dính tiểu cầu chủ yếu nhờ vào collagen và phức hợp GP Ia/IIa Những tương tác này làm chậm lưu thông tiểu cầu, tạo điều kiện cho các cặp thụ thể - phối tử tương tác và tăng cường bám dính Đặc biệt, sự tương tác giữa collagen và GP VI kích hoạt các thụ thể GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa, trong khi vWF và collagen tạo liên kết mạnh với GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa.
Trong giai đoạn hình thành nút tiểu cầu, tiểu cầu dính lại với nhau để tạo thành các đám tiểu cầu Thụ thể GP IIb/IIIa đóng vai trò quan trọng trong quá trình này, góp phần vào sự kết dính và ổn định của nút tiểu cầu.
Phức hợp GP IIb/IIIa trên bề mặt màng tiểu cầu bất hoạt có khoảng 4000 - 5000 bản sao Khi tiểu cầu được kích hoạt, các GP IIb/IIIa sẽ được kích hoạt, hoạt động như thụ thể gắn với fibrinogen, vWF, fibronectin và vitronectin, trong đó fibrinogen là chủ yếu do nồng độ cao trong huyết tương và ái lực mạnh với GP IIb/IIIa Sự liên kết này tạo ra cầu nối giữa các tiểu cầu, dẫn đến sự ngưng tập và kích hoạt liên tục cho đến khi hình thành nút tiểu cầu Hai giai đoạn ngưng tập và hoạt hóa có sự tương tác qua lại, diễn ra liên tục Một số chất gây ngưng tập tiểu cầu (NTTC) như ADP, adrenalin, thromboxan A2, collagen và ristocetin, trong đó ADP là chất quan trọng nhất do không phụ thuộc vào tác nhân khác và hỗ trợ phản ứng ngưng tập của các tác nhân khác.
Hồng cầu sản sinh ADP khi thành mạch bị tổn thương, dẫn đến tăng nồng độ ADP và kích thích quá trình ngừng chảy máu ADP hoạt động hiệu quả nhất khi kết hợp với ba thụ thể trên tiểu cầu: P2Y1, P2Y12 và P2X1, trong đó P2Y1 và P2Y12 là hai thụ thể thiết yếu cho hiện tượng ngừng chảy máu tối đa Nghiên cứu về thuốc ức chế ngừng chảy máu đang tập trung vào hai thụ thể này nhằm cải thiện hiệu quả trong phòng ngừa và điều trị huyết khối.
➢ Giai đoạn phóng thích các chất của tiểu cầu
Sau khi bị ngưng tập bởi các chất gây ngưng tập, tiểu cầu trải qua nhiều biến đổi phức tạp, bao gồm thay đổi hình dạng và phóng thích các yếu tố sinh học Quá trình này ảnh hưởng đến cả hình thái và sinh hóa của tiểu cầu.
Hình 1.3 Bám dính và ngưng tậ p ti ể u c ầ u (Nguồn:https://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=PMC4265014_40681_20
1.2.3 Điều trịức chếNTTC trong ĐTNKÔĐ
Chống hình thành huyết khối bằng cách ức chế hoạt hóa tiểu cầu là phương pháp điều trị quan trọng trong bệnh ĐTNKÔĐ, giúp giảm nguy cơ biến cố tim mạch và tỉ lệ tử vong cho bệnh nhân Các thuốc chống ngưng tập tiểu cầu được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng.
- Thuốc ức chế Cyclooxygenase (aspirin)
- Thuốc ức chế thụ thể ADP (clopidogrel [Plavix], prasugrel [Effient],
- Thuốc ức chế thụ thể GPIIb/IIIa (abciximab [ReoPro], eptifibatide [Integrilin], tirofiban [Aggrastat])
- Thuốc ức chế tái hấp thu Adenosin (dipyridamole [Persantine])
- CPTPs (cyclo-pentyl-triazolo-pyrimidines [Ticagrelor])
1.2.4 Thuốc chống NTTC aspirin và clopidogrel
Hình 1.4 Cơ chế tác d ụ ng c ủ a aspirin lên quá trình NTTC (Nguồn: http://tmedweb.tulane.edu/pharmwiki/doku.php/introduction_to_eicosanoids)
Aspirin là thuốc chống tiểu cầu phổ biến nhất và đã được nghiên cứu rộng rãi, cho thấy khả năng giảm tử vong do mạch máu khoảng 15% và giảm các biến cố tim mạch không gây tử vong khoảng 30% ở bệnh nhân có nguy cơ cao Thuốc hoạt động bằng cách ức chế enzyme cyclooxygenase (COX), cụ thể là gắn vào vị trí 529 của COX-1 và vị trí 516 của COX-2, từ đó ngăn chặn quá trình chuyển đổi acid arachidonic thành prostaglandin H2 (PGH2) PGH2 là cơ chất cho nhiều isomerase sản xuất các prostanoid có hoạt tính sinh học khác nhau, chủ yếu là thromboxan A2 (TXA2) và PGI2 TXA2 được tổng hợp và phóng thích bởi tiểu cầu khi gặp các tác nhân kích thích như collagen, thrombin, và ADP, gây co mạch mạnh và dẫn đến các biến cố tim mạch nghiêm trọng thông qua thụ thể TXA2.
Aspirin không thể tổng hợp thêm COX-1 mới, dẫn đến sự ức chế mạnh mẽ trong suốt vòng đời của tiểu cầu Tuy nhiên, aspirin cũng ức chế men prostacyclin synthetase, làm giảm sự tổng hợp prostaglandin kháng đông PGI2, chất có tác dụng ức chế NTTC và giãn mạch của tế bào nội mạc Hệ quả là sự kích thích NTTC xảy ra Mặc dù tế bào nội mạc có khả năng tổng hợp men mới, nhưng tác dụng này không mạnh và không kéo dài như tác dụng ức chế men COX.
Clopidogrel không có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu (NTTC) Sau khi hấp thu tại ruột, khoảng 85% clopidogrel được chuyển hóa thành chất không có hoạt tính nhờ các enzyme esterase như carboxylesterase (CES) và butyrylcholinesterase (BchE).
Chỉ 15% thuốc được chuyển hóa qua hai bước tại gan nhờ hệ thống enzyme P-450, chủ yếu là CYP2C19, tạo thành chất có hoạt tính Chất này ức chế chọn lọc và không hồi phục quá trình gắn phân tử ADP vào thụ thể P2Y12 trên bề mặt tiểu cầu, dẫn đến việc các thụ thể GPIIb/IIIa không được kích hoạt, ngăn cản sự kết dính của tiểu cầu.
Clopidogrel undergoes a complex metabolic process to convert into its active metabolite This transformation is crucial for its effectiveness as an antiplatelet agent The metabolic pathway involves several steps, each producing different metabolites that contribute to the drug's therapeutic action Understanding this process is essential for optimizing clopidogrel's clinical use and enhancing patient outcomes.
Hình 1.6 Cơ chế tác d ụ ng clopidogrel lên quá trình NTTC
(Nguồn: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0808227 )
Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C19
Đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism – SNP – đọc là
SNP (biến thể đơn nucleotide) là biến thể di truyền phổ biến nhất trong DNA của con người Gen, một đoạn DNA, chứa thông tin mã hóa cho sản phẩm cụ thể và bao gồm nhiều nucleotide (A, T, G, C) Mỗi SNP thể hiện sự khác biệt một nucleotide trong gen, dẫn đến sự khác biệt di truyền giữa các cá thể.
SNP có thể thay thế nucleotide cytosine (C) bằng nucleotide thymine (T) Các SNP là sự khác biệt duy nhất, là cơ sở tồn tại giữa các cá nhân [44]
Hình 1.7 Mô t ả single nucleotide polymorphism (SNP)
SNP được xác định khi tần số xuất hiện của một alen phải lớn hơn hoặc bằng
SNP, hay biến thể đơn nucleotide, thường chỉ xuất hiện với 2 loại alen, mặc dù lý thuyết cho rằng có thể có 4 loại nucleotide Nguyên nhân là do SNP phát sinh từ một đột biến điểm trong hệ gen, chuyển đổi một nucleotide thành một nucleotide khác Nếu đột biến này xảy ra trong tế bào sinh sản, nó sẽ được truyền cho các thế hệ sau, hình thành SNP trong quần thể Tuy nhiên, để có thêm alen thứ 3, cần có một đột biến mới tại vị trí tương tự, và cá thể mang đột biến đó phải di truyền cho thế hệ tiếp theo, điều này rất hiếm gặp Do đó, phần lớn SNP chỉ có 2 alen: một alen gốc và một alen đột biến.
SNP có thể xuất hiện trong vùng mã hóa mà không làm thay đổi trình tự axit amin, hoặc có thể xảy ra trong vùng mã hóa với sự thay đổi trình tự axit amin Ngoài ra, SNP cũng có thể xảy ra trong các vùng điều khiển, dẫn đến sự thay đổi biểu hiện gen, hoặc trong các vùng giữa các gen.
SNP (biến thể đơn nucleotide) xuất hiện khoảng một lần trong mỗi 300 nucleotide, tương đương với khoảng 10 triệu SNP trong hệ gen của con người Chúng hoạt động như các marker sinh học, giúp các nhà khoa học xác định vị trí các gen liên quan đến bệnh tật Khi SNP xảy ra trong gen hoặc vùng điều khiển gần gen, chúng có thể ảnh hưởng trực tiếp đến chức năng gen và liên quan đến bệnh tật Mặc dù hầu hết SNP không ảnh hưởng đến sức khỏe con người, một số SNP đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu sức khỏe, giúp dự đoán phản ứng của cá nhân đối với thuốc, nhạy cảm với yếu tố môi trường và nguy cơ phát triển bệnh lý SNP cũng có thể được sử dụng để theo dõi di truyền gen bệnh trong gia đình Các nghiên cứu trong tương lai sẽ tiếp tục xác định các SNP liên quan đến các bệnh phức tạp như bệnh tim, tiểu đường và ung thư.
1.3.2 Gen CYP2C19 và vai trò của chúng trong chuyển hóa thuốc
Enzym cytochrome P450, là các protein màng chứa hem, chủ yếu nằm ở lưới nội chất của tế bào gan Trong số các enzyme CYP, CYP3A4, CYP2D6, CYP2C19, CYP1A2 và CYP2E1 là những thành viên quan trọng, với CYP2C19 được coi là enzyme chủ chốt trong siêu họ này.
Gen mã hóa cho CYP2C19 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 10 ở người (10q23.33), có kích thước 90,637bp, từ cặp nucleotide 94,762,624 đến cặp nucleotide 94,853,260
Hình 1.8 V ị trí gen CYP2C19 trên nhi ễ m s ắ c th ể s ố 10 (Nguồn: https://ghr.nlm.nih.gov/gene/CYP2C19#location )
Gen CYP2C19 gồm 9 exon, mã hóa cho protein CYP2C19 dài 490 axit amin
Gen CYP2C19 có tính đa hình cao với 25 alen đã được xác định, trong đó alen CYP2C19*1 quy định enzym CYP2C19 có hoạt tính chuyển hóa thuốc bình thường Các alen như *2, *3, *4, *5, *6, *7, *8, *17 ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme này, dẫn đến giảm, mất hoặc tăng hoạt tính Đặc biệt, alen *2 và *3 là hai đa hình alen quan trọng nhất, với tần số cao trong quần thể người châu Á.
(Nguồn: https://www.researchgate.net/figure/51745678_fig1_Figure-1-Illustration- of-the-CYP2C19-gene-highlighting-the-location-of)
Hình 1.9 V ị trí c ủ a các exon (h ộp đen) và mộ t s ố alen trên gen CYP2C19
➢ Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 có ch ức năng bình thườ ng
Alen CYP2C19*1: quy định biểu hiện enzym CYP2C19 có chức năng hoạt động bình thường
➢ Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 gi ả m ho ặ c m ấ t ho ạ t tính
Alen có kí hiệu rs4244285 ở vị trí (c.681G>A) là đa hình xác định của alen CYP2C19*2, đây là dạng đột biến đồng hoán thay G bằng A ở exon 5 làm xuất
Kiểu gen CYP2C19 bao gồm đồng hợp tử kiểu dại GG, dị hợp tử đột biến GA và đồng hợp tử đột biến AA Đột biến này dẫn đến việc khung đọc mRNA bị cắt ngắn, tạo ra enzym không có hoạt tính Allele CYP2C19 *2 là dạng phổ biến nhất gây mất hoạt tính của enzyme CYP2C19, với tần suất xuất hiện khoảng 12% ở người da trắng, 15% ở người Mỹ gốc Phi và 29-35% ở người châu Á.
CYP2C19*3 là alen mã hóa cho enzym CYP2C19 mất hoạt tính với ký hiệu rs4986893 tại vị trí (c.636G>A), gây ra đột biến thay thế G bằng A ở exon 4, dẫn đến việc hình thành mã kết thúc sớm ở axit amin 212 Đa hình này tạo ra ba kiểu gen: đồng hợp tử kiểu dại GG, dị hợp tử đột biến GA và đồng hợp tử đột biến AA Tần số alen CYP2C19*3 trong hầu hết các quần thể là dưới 1%, nhưng tỷ lệ này cao hơn ở người châu Á, dao động từ 2-9%.
Ngoài ra, các alen khác mã hóa cho enzym giảm hoặc mất hoạt tính là CYP2C19*4 (rs28399504), *5 (rs56337013), *6 (rs72552267), *7 (rs72558186) và
*8 (rs41291556) Các alen này có tần sốdưới 1% trong các quần thểngười [68]
Một số alen khác đã được xác định trong các quần thể khác nhau, tuy nhiên, dữ liệu mô tả về chúng còn rất hạn chế Ngoài ra, các thuật toán phân tích cũng được sử dụng để dự đoán ảnh hưởng của những alen này lên chức năng protein.
1.3.2.2 Vai trò c ủ a CYP2C19 trong chuy ể n hóa thu ố c
Enzyme Cytochrome 450 (Cyt-P450) đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa nhiều loại thuốc, bao gồm clopidogrel (Plavix), mephenytoin, omeprazole và diazepam Trong số các enzyme thuộc họ này, CYP2C19 là enzyme chủ yếu tham gia vào quá trình chuyển hóa clopidogrel, ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị của thuốc.
Một thuốc A khi đưa vào trong cơ thể sẽ đi theo một hoặc các con đường sau [6]:
- Được hấp thu và thải trừ không biến đổi: bromid, lithi, saccharin
- Chuyển hóa thành chất B (pha I), sau đó thành chất C (pha II) và thải trừ
- Chuyển hóa thành chất D ( pha II) rồi thải trừ
Chất A có thể có hoặc không có hoạt tính sinh học, và từ đó tạo ra chất B, cũng có khả năng có hoặc không có hoạt tính Trong khi đó, chất C và D luôn là những chất không có hoạt tính Đặc biệt, chất A có khả năng sinh ra nhiều loại chất B hoặc C.
Pha I Qua pha này thuốc ở dạng tan trong lipid sẽ phân cực hơn, dễ tan trong nước hơn Thuốc có thể mất, giảm, tăng hoặc trở nên có hoạt tính sinh học Pha I xảy ra các phản ứng như phản ứng khử, phản ứng thủy phân, nhưng thường gặp nhất là phản ứng oxy hóa với sự tham gia của Cyt-P450 [80]
Pha II Các thuốc đi qua pha này chủ yếu trở thành phức hợp không có hoạt tính, dễ tan trong nước và bị thải trừ Các phản ứng ở pha II đều là các phản ứng liên hợp: một phân tử nội sinh (acid glucuronic, glutathion, sulfat, glycin, acetyl) sẽ ghép với một nhóm hóa học của thuốc để tạo thành các phức hợp tan mạnh trong nước
Thông thường, các phản ứng ở pha I sẽ tạo ra các nhóm chức cần thiết cho các phản ứng ở pha II như nhóm -OH, -COOH, -NH2, -SH [80]
Trong pha I của quá trình chuyển hóa, phản ứng chính là phản ứng oxy hóa, nổi bật với sự tham gia của các enzym oxy hóa, đặc biệt là cyptochrome P450 Quy trình này diễn ra qua các bước chính, đảm bảo tính hiệu quả và độ chính xác trong phản ứng.
Thuốc phản ứng với Cyt-P450 dạng oxy hóa (Fe 3+ ), tạo thành phức hợp Drug - P450 (Fe 3+ ) Quá trình này khiến Cyt-P450 chuyển đổi từ trạng thái spin thấp sang trạng thái spin cao, tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển điện tử thứ nhất nhờ sự biến đổi thế năng oxy hóa.
Bước 2 Nhận điện tử thứ nhất từ NADPH, dưới tác dụng xúc tác của enzym
Cyt-P450-reductase tạo phức hợp Drug-P450 dạng khử (Fe 2+ )
Bước 3 Phức hợp dạng khử này phản ứng với một phân tửoxy để tạo thành phức hợp oxy hoạt hóa
Tình hình nghiên c ứ u m ố i liên quan gi ữa độ NTTC v ớ i ki ể u gen
và các yếu tố khác trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ trên thế giới và trong nước
1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về mối tương quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19 trên bệnh nhân bệnh mạch vành
Nghiên cứu của Sibbing và các cộng sự (2009) cho thấy tỉ lệ biến cố huyết khối sau khi đặt stent ở bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da tăng gấp 3 lần ở những người mang alen đột biến CYP2C19*2 so với bệnh nhân mang đồng hợp tử kiểu dại, với p=0,007.
Nghiên cứu đa trung tâm, ngẫu nhiên, mù đôi ELEVATE-TIMI (2011) tiến hành trên 333 bệnh nhân bị bệnh tim tại 32 điểm từ tháng 10/2010 đến tháng 9/2011
Bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*2 khi sử dụng liều clopidogrel 225 mg cho thấy tác dụng dược lý tương đương với liều chuẩn 75 mg Trong khi đó, bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử CYP2C19*2 lại không đạt được hiệu quả chống ngưng tụ tiểu cầu với liều 300 mg.
Nghiên cứu của Yang J và cộng sự (2013) chỉ ra rằng những người mang 1 alen đột biến (*1/*2, *1/*3) và 2 alen đột biến (*2/*3, *2/*2, *3/*3) có độ NTTC tối đa với ADP cao hơn so với những người mang kiểu dại (*1/*1), với các giá trị p lần lượt là 0,002 và 0,0039.
Nghiên cứu của Yu Chen và các cộng sự (2015) trên 336 bệnh nhân HCĐMVC đã chỉ ra rằng nhóm bệnh nhân mang alen CYP2C19*2 có tỷ lệ tai biến cao hơn đáng kể so với nhóm mang kiểu gen dại, với p lần lượt là 0,005 và 0,003 sau 1 tháng Ngoài ra, nguy cơ xảy ra các biến cố tim mạch chính ở bệnh nhân mang alen CYP2C19*2 cũng cao hơn so với nhóm mang alen CYP2C19*1, với p=0,003.
Nghiên cứu cho thấy alen CYP2C19*2 có tỷ lệ cao trong quần thể nghiên cứu, và bệnh nhân mang alen này gặp phải biến cố tim mạch nặng hơn so với những người không mang gen Điều này khẳng định vai trò quan trọng của CYP2C19*2 trong việc kháng thuốc clopidogrel.
1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Đến nay, chưa có nghiên cứu nào xác định mối liên hệ giữa độ NTTC và kiểu gen CYP2C19 ở bệnh nhân ĐTNKÔĐ tại Việt Nam.
Nguyễn Thị Nữ, Cung Thị Tý và Đỗ Trung Phấn (1997) nghiên cứu “Chỉ số
NTTC ởngười trưởng thành Việt Nam bình thường” với chất kích tập tiểu cầu collagen nồng độ 1mg/ml là 65,5±6,7%; với chất kớch tập ADP nồng độ 10àM là 67±6,5%
Không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về độ NTTC giữa nam và nữ [17]
Nghiên cứu của Trương Thị Minh Nguyệt (2003) cho thấy độ NTTC trên bệnh nhân thiếu máu cục bộ cơ tim với chất kích thích ADP nồng độ 5μM đạt 71,6±8,83% Đặc biệt, độ NTTC ở nhóm NMCT cấp là 74,46±9,95%, cao hơn có ý nghĩa so với nhóm chứng Tất cả bệnh nhân thiếu máu cục bộ cơ tim đều có các yếu tố nguy cơ như tăng huyết áp, đái tháo đường, béo phì, hút thuốc lá và tiền sử gia đình mắc bệnh tim mạch Mức tăng độ NTTC có mối liên quan đồng biến với hàm lượng fibrinogen huyết tương và có xu hướng tăng theo số lượng nhóm nguy cơ.
Nghiêm Hoàng Lan Phương (2007) đã chỉ ra rằng độ NTTC ở bệnh nhân NMCT cấp là 74,3±10,2%, cao hơn mức 67±6,5% của người bình thường Những bệnh nhân NMCT cấp có nhiều yếu tố nguy cơ sẽ có độ NTTC cao hơn so với những người có ít yếu tố nguy cơ Đặc biệt, độ NTTC giảm rõ rệt sau khi áp dụng liệu pháp điều trị tấn công bằng thuốc chống NTTC như Plavix, Aspirin và Lovenox so với trước can thiệp.
Trần Hòa và Trương Quang Bình (2015) đã nghiên cứu mối liên hệ giữa các kiểu gen giảm chức năng CYP2C19*2 và CYP2C19*3 với tiên lượng ở bệnh nhân can thiệp đặt stent động mạch vành có sử dụng clopidogrel Nghiên cứu hiện vẫn đang tiến hành và chưa có kết quả cuối cùng được công bố.
Đến nay, chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam khám phá mối liên quan giữa độ nhạy thuốc và đa hình di truyền gen CYP2C19 ở bệnh nhân đái tháo đường không phụ thuộc insulin Việc tiếp tục nghiên cứu trong lĩnh vực này là rất cần thiết, nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và phòng ngừa bệnh đái tháo đường không phụ thuộc insulin.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
Đối tượ ng nghiên c ứ u
Tất cả các bệnh nhân được chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn ACCF/AHA (American College of Cardiology Foundation/ American Heart Association) (2012)
Bệnh nhân sau khi nhập viện đã được điều trị bằng liệu pháp kháng tiểu cầu kép vào ngày thứ 3, bao gồm liều duy trì aspirin 100mg/ngày kết hợp với clopidogrel 75mg/ngày.
- Bệnh nhân phải dùng thêm bất cứ một loại thuốc chống ngưng tập tiểu cầu nào khác ngoài aspirin và clopidogrel
- Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng
- Tai biến mạch não dưới 3 tháng
- Mới phẫu thuật dưới 1 tuần
- Nguy cơ cao chảy máu
- Suy thận, suy gan giai đoạn cuối.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
➢ Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 1/2018
➢ Địa điểm thu mẫu: Viện Tim mạch Việt Nam
- Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Viện Tim mạch Việt Nam
- Viện nghiên cứu hệ gen
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang
Chúng tôi đã áp dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện để xác định cỡ mẫu nghiên cứu, bao gồm 54 bệnh nhân tại Viện Tim mạch Việt Nam Các đối tượng tham gia được lựa chọn liên tục dựa trên việc họ thỏa mãn các tiêu chuẩn và đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.4 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu
- Lambda DNA/HindIII Marker, code SM0103, hãng Fermentas
- GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder, code SM0321, hãng Thermo Scientific
- Q5 High – Fidelity DNA polymerase, hãng Neb (New England Biolabs)
- E.Z.N.A blood DNA Mini kit, code D3392, hãng Omega-Biotek
- GeneJET PCR Kit, hãng Thermo Fisher Scientific
- Chất kớch tập là ADP 5 àM của hóng Nippon Corporation (Nhật Bản)
- Máy PCR Prime Thermal Cycler (Code: 5PRIME/02, Anh)
- Máy đo nồng độ DNA Eppendorf Bio Photometer Plus (Eppendorf, Đức)
- Máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzer applied Biosystems, Mỹ
- Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu Chrono – LOG của Mỹ.
Các bước nghiên cứu
Quy trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ như sau:
2.5.2 Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu
Để lấy mẫu, cần 4ml máu từ tĩnh mạch của bệnh nhân, chuyển vào ống chuyên dụng có chất chống đông EDTA để tránh nhiễm bẩn Cần ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân và mã code để tránh nhầm lẫn giữa các mẫu Lượng máu trong mỗi ống đủ cho nhiều lần tách DNA tổng số, đảm bảo còn mẫu lưu để có thể lặp lại quá trình tách DNA cho đến khi xác định được kiểu gen của bệnh nhân.
Mẫu cần được bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh dân dụng không quá 1 ngày Sau đó, mẫu sẽ được vận chuyển an toàn theo nguyên tắc sinh học đến phòng thí nghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia.
Hà Nội Mẫu tiếp tục được bảo quản trong điều kiện lạnh -30˚C đến khi sử dụng
Ống mẫu cần ghi rõ các thông tin quan trọng như mã bệnh nhân, tên, tuổi và ngày lấy mẫu Tất cả thông tin liên quan đến mẫu phải được lưu trữ trong sổ, bao gồm mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu sau khi bàn giao và khi sử dụng.
2.5.3 Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số
Chúng tôi sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số
Nguyên lý kit: Dưạ trên sự hấp thụ chọn lọc của các axit nucleic vào màng silica-gel trong điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính bao gồm:
- Phá vỡ tếbào để giải phóng DNA
- DNA liên kết với màng silica-gel
- Loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với Wash Buffer
- Thu nhận DNA tổng số
2.5.3.2 Ki ể m tra ch ất lượ ng DNA t ổ ng s ố
Sau khi tách chiết, DNA tổng số được kiểm tra theo hai phương pháp sau:
➢ Ki ể m tra ch ất lượ ng DNA b ằng phương pháp đo quang
Thực nghiệm được tiến hành tại bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Chúng tôi sử dụng máy Eppendorf Bio Photometer Plus
Các bước của quy trình thao tác chung:
- Đo Blank: Đo với môi trường được sử dụng để bảo quản/ pha loãng mẫu DNA
➢ Ki ể m tra DNA b ằng phương pháp điệ n di
- Điều kiện điện di: Điện di trên gel agarose 0,7% pha trong đệm TAE 1X, hiệu điện thế 90V, thời gian chạy 60 phút
- Thể tớch mẫu điện di: 5 àl mẫu + 1àl DNA 6X loading dye, 5àl Ruler 100
2.5.4 Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR và kiểm tra chất lượng sản phẩm
2.5.4.1 Khu ếch đại đoạ n gen ch ứ a các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 b ằ ng PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để khuếch đại đoạn trình tự DNA mong muốn, với nguyên lý tổng hợp DNA mới từ DNA khuôn ban đầu nhờ enzym polymerase Các thành phần chính trong phản ứng bao gồm DNA khuôn, mồi, dung dịch đệm, bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) và DNA polymerase Quy trình PCR diễn ra qua ba giai đoạn chính, đảm bảo hiệu quả trong việc nhân bản DNA.
- Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95˚C) để tách hai mạch của chuỗi DNA xoắn kép
Trong giai đoạn gắn mồi, nhiệt độ được điều chỉnh xuống mức thích hợp để mồi có thể tự bắt cặp với sợi DNA khuôn Nhiệt độ này phụ thuộc vào loại mồi được sử dụng, cũng như trình tự và số lượng nucleotide của mồi.
- Giai đoạn kéo dài: Enzyme DNA polymerase sẽ tổng hợp mạch polynucleotide mới dựa vào mạch khuôn và 4 loại dNTP tại nhiệt độ 72˚C [24]
Trình tự mồi nhân dòng các alen *2 và *3 được trình bày dưới đây:
Bảng 2.1 Trình tự mồi nhân dòng các alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3
Alen Mồi Trình tự Độ dài sản phẩm
Chúng tôi đã tối ưu hóa các thành phần và điều kiện phản ứng PCR cho từng alen *2 và *3 Quy trình PCR cho hai alen này được trình bày chi tiết trong bảng 2.2 và bảng 2.3.
Bảng 2.2 Quy trình PCR cho alen *2 Thành phần Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng
DNA template 5-100 ng - Biến tính: 98˚C trong 3 phút
+ 98˚C trong 10 giây + 59˚C trong 30 giây + 72˚C trong 30 giây
- Kết thúc: 72˚C trong 5 phút dNTP mix, 2 mM 0,2 mM
Bảng 2.3 Quy trình PCR cho alen *3
Thành phần Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng
DNA template 40-170 ng - Biến tính: 98˚C trong 3 phút
+ 98˚C trong 10 giây + 68˚C trong 30 giây + 72˚C trong 30 giây
- Kết thúc: 72˚C trong 5 phút dNTP mix, 2 mM 0,2 mM
2.5.4.2 Ki ể m tra ch ất lượ ng s ả n ph ẩ m PCR
Phương pháp điện di là công cụ quan trọng trong việc kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR, được thực hiện theo quy trình tương tự như điện di kiểm tra chất lượng tách chiết DNA.
2.5.5 Tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng kit GeneJET PCR theo các bước sau:
1 Thêm thể tích Binding Buffer vào sản phẩm PCR theo tỉ lệ1:1 Mix đều
2 Nếu DNA 0,05)
3.1.4 Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3
3.1.4.1 K ế t qu ả tách chi ế t DNA t ổ ng s ố
Khâu tách chiết DNA tổng số là bước thiết yếu trong xác định kiểu gen Để đánh giá chất lượng sản phẩm DNA tách được, chúng tôi đã áp dụng phương pháp điện di để thực hiện đánh giá định tính và đo OD cho đánh giá định lượng Kết quả đo OD và điện di sẽ được trình bày chi tiết trong bài viết này.
Bảng 3.4 Kết quảđo nồng độvà độ tinh sạch của sản phẩm tách DNA
Nồng độ DNA tách từ các mẫu máu toàn phần dao động từ 13,10 ng/µl đến 170,05 ng/µl, với độ tinh sạch cao, thể hiện qua tỷ lệ OD260/OD280 trong khoảng từ 1,806 đến 2,146.
➢ Kết quảđiện di DNA tổng số
Sản phẩm tách DNA tổng số cũng được đánh giá bằng cách điện di trên gel
Hình 3.1 Điệ n di DNA t ổ ng s ố trên gel Agarose 0,7%
Làn M: Lambda DNA/HindIII Marker Làn 16-38 : DNA tổng số của bệnh nhân có mã tương ứng
Kết quả điện di cho thấy chất lượng DNA tổng số đạt yêu cầu tốt, với tất cả mẫu đều có một băng điện di rõ ràng, ít bị đứt gãy Sản phẩm DNA tách ra đáp ứng đủ điều kiện cho thí nghiệm PCR nhằm nhân dòng các phân đoạn gen tiếp theo.
3.4.1.2 K ế t qu ả khu ếch đạ i vùng gen ch ứ a alen CYP2C19*2, CYP2C19*3
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy sự khuếch đại các vùng gen chứa alen *2 và *3, cho phép thu được vùng gen đặc hiệu cho từng alen.
Hình 3.2 Điệ n di s ả n ph ẩ m PCR nhân vùng gen ch ứ a alen CYP2C19*2 (719 bp) và CYP2C19*3 (898 bp) trên gel agarose 1%
Làn M: Ruler 100bp Plus DNA Ladder Lần 2(-), 3(-): Đối chứng âm
Làn 2-41 đến 2-45, 2-49: sản phẩm PCR vùng chứa *2 của các bệnh nhân với mã tương ứng Làn 3-41 đến 3-45 : sản phẩm PCR vùng chứa *3 của các bệnh nhân với mã tương ứng
Kết quả điện di cho thấy các cặp mồi sử dụng có tính đặc hiệu cao, với các thành phần và điều kiện phản ứng được tối ưu hóa Mỗi alen đều tạo ra một băng duy nhất, rõ nét mà không có băng phụ hay hiện tượng smear Kích thước băng được xác định rõ ràng.
3.1.4.3 K ế t qu ả phân tích ki ể u gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 b ằng phương pháp RFLP có đố i chi ế u v ới phương pháp giả i trình t ự
Trước khi thực hiện RFLP và giải trình tự, sản phẩm PCR cần được tinh sạch và đo nồng độ DNA Chúng tôi sử dụng bộ kit E.Z.N.A.® Cycle-Pure Kit (Omega-biotek) để tinh sạch 25 µl sản phẩm PCR theo quy trình khuyến cáo của nhà sản xuất.
Mẫu sản phẩm PCR có nồng độ tối thiểu 15 ng/µl đã được tinh sạch và đưa đi GTT 2 chiều tại First Base (Malaysia) Kết quả GTT sau đó được phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên bản 7.1.9, từ đó xác định kiểu gen trên từng alen *2 và *3 Hình 3.3 và 3.4 dưới đây thể hiện kết quả kiểu gen.
Hình 3.3 K ế t qu ả gi ả i trình t ự alen CYP2C19*2
Hình 3.4 K ế t qu ả gi ả i trình t ự alen CYP2C19*3
A Ki ể u d ạ i GG, B D ị h ợp đa hình GA
CYP2C19*2 có kiểu gen dại là GG, với kiểu gen dị hợp và đồng hợp đa hình lần lượt là GA và AA Trong khi đó, CYP2C19*3 cũng có kiểu gen dại là GG, và kiểu gen dị hợp đa hình tương ứng.
GA Sản phẩm GTT cho hình ảnh rõ nét Các đỉnh màu tương ứng với các nucleotide rõ ràng và không bị nhiễu
Bàn luận
ĐTNKÔĐ là một dạng của hội chứng động mạch vành cấp, chủ yếu do nứt hoặc vỡ các mảng xơ vữa không ổn định, dẫn đến hình thành cục máu đông mà chưa gây tắc hoàn toàn động mạch vành Mặc dù chưa gây tắc nghẽn, ĐTNKÔĐ có thể tiến triển nặng thành nhồi máu cơ tim thực sự và gây ra các biến cố tim mạch nghiêm trọng.
Bệnh động mạch vành, đặc biệt là ĐTNKÔĐ, đang trở thành nguyên nhân hàng đầu gây đe dọa sức khỏe và tỷ lệ tử vong cao trên toàn cầu Tình trạng này ngày càng gia tăng, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam.
Chống hình thành huyết khối bằng cách ức chế hoạt động tiểu cầu là phương pháp điều trị chính trong ĐTNKÔĐ tại Việt Nam Phương pháp này dựa trên các hướng dẫn quốc tế cập nhật, như hướng dẫn của Hội Tim mạch Hoa Kỳ, nhằm nâng cao sức khỏe và cải thiện tiên lượng sống cho bệnh nhân.
Hiện nay, liệu pháp kháng tiểu cầu kép với sự kết hợp của aspirin và clopidogrel vẫn là phương pháp điều trị chính trong việc ngăn ngừa các biến cố tim mạch ở bệnh nhân NTTC.
Mặc dù tuân thủ đúng phác đồ điều trị, một số lượng lớn bệnh nhân ĐTNKÔĐ vẫn gặp phải các biến cố thiếu máu cơ tim cục bộ Nghiên cứu cho thấy sự khác biệt giữa các bệnh nhân được điều trị bằng clopidogrel, một tiền chất không có tác dụng sinh học, được chuyển hóa thành thuốc có hoạt tính nhờ cytochrome P450 tại gan, chủ yếu là CYP2C19 Clopidogrel hoạt động bằng cách ức chế không hồi phục thụ thể P2Y12 trên màng tiểu cầu, giúp giảm độ NTTC và ngăn chặn sự kết dính của tiểu cầu.
Enzym CYP2C19 là một enzym đa hình với 25 alen khác nhau, và hoạt tính của enzym này phụ thuộc vào sự hiện diện của các alen trong kiểu gen.
Alen kiểu dại *1 thể hiện hoạt tính enzyme bình thường, trong khi các alen *2 và *3 gây mất hoạt tính enzym Cơ chế đáp ứng kém với clopidogrel chưa được làm sáng tỏ đầy đủ, không chỉ do yếu tố di truyền như đa hình gen CYP2C19 mà còn do các yếu tố phi di truyền như không tuân thủ điều trị, tương tác thuốc, béo phì, tuổi cao, rối loạn chuyển hóa lipid, hút thuốc, tăng huyết áp, tiểu đường và tiền sử nhồi máu cơ tim.
Trong nghiên cứu này, bên cạnh việc xác định tần số phân bố kiểu gen
Chúng tôi đã tiến hành đánh giá mối tương quan giữa độ NTTC và đa hình CYP2C19 cùng một số yếu tố ảnh hưởng khác trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ tại Việt Nam Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự liên quan giữa độ NTTC ở bệnh nhân mang alen quy định enzym hoạt động bình thường và bệnh nhân mang alen quy định enzym mất hoạt tính chuyển hóa (p