Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xác định tần số phân bố kiểu gen CY2C19*2 và CYP2C19*3 trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định. Đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định.
TỔNG QUAN
Đau thắt ngực không ổn định
ĐTNKÔĐ là một dạng của hội chứng đau ngực không ổn định, được xác định bởi các triệu chứng lâm sàng như cơn đau thắt ngực mới xuất hiện, sự biến đổi trong các dạng đau ngực, hoặc gia tăng cơn đau thắt ngực khi nghỉ ngơi, mà không có dấu ấn sinh học tổn thương cơ tim như troponin, và điện tâm đồ có thể có sự thay đổi.
1.1.2 Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ
Xơ vữa động mạch (XVĐM) là quá trình hình thành các mảng xơ vữa ở lớp nội mô của động mạch lớn và vừa, dẫn đến tình trạng thiếu máu cấp tính Các yếu tố nguy cơ như cholesterol máu cao, tăng huyết áp (THA), đái tháo đường (ĐTĐ) và hút thuốc lá đóng vai trò quan trọng trong việc khởi phát XVĐM Những yếu tố này gây tổn thương tế bào nội mô, dẫn đến rối loạn chức năng nội mô bằng cách giảm hoạt tính của nitric oxide, tăng sản xuất endothelin, làm tổn thương mạch máu, gia tăng biểu lộ các phân tử kết dính và tăng cường quá trình đông máu.
Viêm đóng vai trò quan trọng trong sự tiến triển của mảng xơ vữa, khi tế bào nội mô bị tổn thương, các tế bào viêm như monocyte gắn với phân tử dính nội mô và xâm nhập vào lớp dưới nội mô, biệt hóa thành đại thực bào Những đại thực bào này sẽ ăn các phân tử LDL, biến thành tế bào bọt và hình thành dải chất béo Để duy trì quá trình viêm, đại thực bào hoạt hóa thu hút thêm đại thực bào khác qua việc tiết ra các chất trung gian Đồng thời, đại thực bào kích thích sự tăng sinh và hình thành tế bào cơ trơn trong lưới ngoại bào thông qua việc tiết ra cytokine, góp phần vào sự hình thành mô xơ trong lưới ngoại bào.
Nguy cơ vỡ mảng xơ vữa phụ thuộc vào kiểu mảng xơ vữa hơn là kích thước
Lõi vữa của mảng xơ vữa chứa nhiều lipid và thiếu collagen hỗ trợ, với kích thước của lõi vữa tỷ lệ thuận với khả năng vỡ của mảng xơ vữa Viêm đóng vai trò quan trọng trong việc làm mảng xơ vữa dễ tổn thương, liên quan đến sự gia tăng hoạt động của đại thực bào và lympho T tại vị trí mảng Sự gia tăng này không chỉ làm kích thước lõi xơ vữa lớn lên mà còn làm mỏng vỏ bao xơ của mảng.
Các phân tích bệnh học cho thấy sự thiếu hụt tế bào cơ trơn tại các mảng xơ vữa dễ tổn thương Các chất trung gian viêm có thể gây chết tế bào cơ trơn theo chương trình hoặc ức chế tổng hợp collagen Mảng xơ vữa có nguy cơ cao nếu có các đặc điểm như lõi xơ vữa lớn, vỏ bao xơ mỏng, sự tập trung dày đặc của đại thực bào và lympho T, số lượng tế bào cơ trơn ít, cùng với tăng biểu hiện metalloproteinase, dẫn đến thoái hóa collagen, tăng sinh mạch và xuất huyết tại mảng xơ vữa.
Hình 1.1 Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ (Nguồn: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJM199901143400207)
Khi mảng xơ vữa bị vỡ, lớp dưới nội mô tiếp xúc với tiểu cầu, dẫn đến hoạt hóa thụ thể trên bề mặt tiểu cầu và hình thành huyết khối Nếu mảng vỡ nhỏ và cục huyết khối không làm tắc hoàn toàn động mạch vành, chỉ giảm dòng máu tới vùng cơ tim, bệnh nhân sẽ trải qua cơn đau thắt ngực không ổn định Nội soi động mạch vành cho thấy 73,7% bệnh nhân ĐTNKÔĐ có huyết khối trong lòng động mạch vành.
1.1.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán đau thắt ngực không ổn định
Chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn của ACCF/AHA (2012) (American college of Cardiology Foundation/ American Heart Association) [53]:
- Lâm sàng: cơn ĐTNKÔĐ có thể hiện diện dưới các dạng thức khác nhau:
+ Cơn đau thắt ngực xuất hiện dưới đây (4-8) tuần
+ Cơn đau thắt ngực trầm trọng dần thêm (tần số hoặc cường độ hoặc thời gian các cơn đau, giảm đáp ứng với các dẫn xuất nitrat)
Cơn đau thắt ngực kéo dài hơn 15-20 phút trong lúc nghỉ ngơi và có phản ứng với các dẫn xuất nitrat có thể chỉ ra tình trạng nghiêm trọng, như nhồi máu cơ tim không có sóng Q.
- Điện tâm đồ lúc nghỉ có thể thay đổi
- Men CK-MB, troponin T, Ic không tăng.
Tổng quan về ngưng tập tiểu cầu
Tiểu cầu là thành phần nhỏ nhất của máu, có hình đĩa và đường kính 3-4 µm, không có nhân, được sản xuất từ nguyên mẫu tiểu cầu tại tủy xương Dưới kính hiển vi, tiểu cầu có cấu trúc phức tạp với hệ thống màng, vi quản, ống đặc, nhiều hạt và các kênh mở Màng tiểu cầu được cấu tạo từ hai lớp lipid kép, chứa các glycoprotein (GP) hoạt động như thụ thể bề mặt, đóng vai trò quan trọng trong quá trình đông máu Ngoài ra, màng tiểu cầu còn có khả năng nhận và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học bên trong.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
1.2.2 Quá trình ngưng tập tiểu cầu Ở trạng thái sinh lý bình thường, khi mạch máu nguyên vẹn, tiểu cầu bị bất hoạt, không bám dính được do hoạt động của nitric oxide, prostacyclin và do khả năng kìm hãm kích hoạt ADP của ADPase (adenosin diphotphatase) từ các tế bào nội mô Tuy nhiên, khi mạch máu bị tổn thương, tiểu cầu sẽ nhanh chóng bám dính vào thành mạch, thay đổi hình dạng, bài tiết và ngưng tập thông qua một loạt phản ứng dẫn đến hình thành nút tiểu cầu tại mô tổn thương Quá trình tạo tiểu cầu hoạt hóa có thể được chia thành các bước: bám dính, ngưng tập và phóng thích các chất [50]
Khi mạch máu bị tổn thương, các yếu tố kháng tiểu cầu nội sinh suy yếu, làm lộ lớp dưới nội mô chứa các protein dính như collagen và yếu tố von Willebrand (vWF) Trong điều kiện dòng máu cao, vWF quan trọng cho sự bám dính tiểu cầu ban đầu thông qua liên kết với phức hợp GP Ib/IX/V Ngược lại, khi dòng máu chậm hoặc tĩnh, bám dính tiểu cầu chủ yếu qua collagen và phức hợp GP Ia/IIa Những tương tác này giúp tiểu cầu lưu thông chậm lại, tạo điều kiện cho các cặp thụ thể - phối tử tương tác và bám dính tĩnh Đặc biệt, tương tác giữa collagen và GP VI kích hoạt thụ thể GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa, trong khi vWF và collagen hình thành liên kết mạnh với GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa.
Trong giai đoạn ngưng tập tiểu cầu (NTTC), tiểu cầu sẽ dính lại với nhau để hình thành các đám tiểu cầu, được gọi là nút tiểu cầu Thụ thể GP IIb/IIIa đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.
Khi tiểu cầu bất hoạt, trên bề mặt của chúng có khoảng 4000 - 5000 phức hợp GP IIb/IIIa, nhưng khi tiểu cầu được kích hoạt, các phức hợp này sẽ hoạt động như thụ thể gắn với fibrinogen, vWF, fibronectin và vitronectin, trong đó fibrinogen là chủ yếu do nồng độ cao trong huyết tương và ái lực mạnh của GP IIb/IIIa với fibrinogen Sự liên kết này tạo cầu nối giữa các tiểu cầu, dẫn đến quá trình ngưng tập và hoạt hóa diễn ra liên tục cho đến khi hình thành nút tiểu cầu ADP, adrenalin, thromboxan A2, collagen, và ristocetin là những chất có khả năng gây ngưng tập tiểu cầu, với ADP là chất quan trọng nhất vì không phụ thuộc vào tác nhân khác và hỗ trợ phản ứng ngưng tập của các tác nhân khác ADP, được tiết ra từ hồng cầu ở vùng mạch tổn thương, nhanh chóng tăng nồng độ, góp phần tạo nút cầm máu ban đầu Hiệu quả của ADP tối đa khi gắn kết với ba thụ thể P2Y1, P2Y12 và P2X1, trong đó P2Y1 và P2Y12 là cần thiết cho hiện tượng ngưng tập tiểu cầu, là mục tiêu nghiên cứu quan trọng cho thuốc ức chế ngưng tập trong điều trị huyết khối.
➢ Giai đoạn phóng thích các chất của tiểu cầu
Sau khi bị ngưng tập bởi các chất, tiểu cầu trải qua nhiều biến đổi, bao gồm thay đổi hình dạng và phóng thích các yếu tố sinh học Quá trình này rất phức tạp, tiểu cầu không chỉ thay đổi về hình thái mà còn về các yếu tố sinh hóa.
Hình 1.3 Bám dính và ngưng tập tiểu cầu (Nguồn:https://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=PMC4265014_40681_20
1.2.3 Điều trị ức chế NTTC trong ĐTNKÔĐ
Chống hình thành huyết khối bằng cách ức chế hoạt hóa tiểu cầu là phương pháp điều trị chính trong bệnh ĐTNKÔĐ, giúp giảm nguy cơ các biến cố tim mạch và tỉ lệ tử vong cho bệnh nhân Các thuốc chống ngưng tập tiểu cầu được phân loại dựa trên cơ chế tác dụng của chúng.
- Thuốc ức chế Cyclooxygenase (aspirin)
- Thuốc ức chế thụ thể ADP (clopidogrel [Plavix], prasugrel [Effient], ticlopidine [Ticlid])
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
- Thuốc ức chế thụ thể GPIIb/IIIa (abciximab [ReoPro], eptifibatide [Integrilin], tirofiban [Aggrastat])
- Thuốc ức chế tái hấp thu Adenosin (dipyridamole [Persantine])
- CPTPs (cyclo-pentyl-triazolo-pyrimidines [Ticagrelor])
1.2.4 Thuốc chống NTTC aspirin và clopidogrel
Hình 1.4 Cơ chế tác dụng của aspirin lên quá trình NTTC (Nguồn: http://tmedweb.tulane.edu/pharmwiki/doku.php/introduction_to_eicosanoids)
Aspirin là thuốc chống tiểu cầu phổ biến nhất, đã được chứng minh qua hơn 100 thử nghiệm ngẫu nhiên rằng nó giảm tử vong do mạch máu khoảng 15% và biến cố tim mạch không gây tử vong khoảng 30% ở bệnh nhân có nguy cơ cao Thuốc này ức chế enzyme cyclooxygenase (COX) bằng cách gắn vào các vị trí cụ thể trên COX-1 và COX-2, từ đó ngăn chặn quá trình chuyển đổi acid arachidonic thành prostaglandin H2 (PGH2) PGH2 là cơ chất cho nhiều isomerase tạo ra thromboxan A2 (TXA2) và PGI2, trong đó TXA2 gây co mạch mạnh và dẫn đến hình thành cục máu đông không hồi phục Việc aspirin ức chế COX-1 làm giảm sự tổng hợp TXA2, do đó ngăn ngừa hình thành cục máu đông Mặc dù aspirin cũng ức chế men prostacyclin synthetase, dẫn đến giảm tổng hợp PGI2, tác dụng này không mạnh bằng và không kéo dài do tế bào nội mạc có khả năng tổng hợp COX mới.
Clopidogrel không có tác dụng chống NTTC và sau khi hấp thu tại ruột, khoảng 85% lượng clopidogrel được chuyển hóa bởi các enzyme esterase như carboxylesterase (CES) và butyrylcholinesterase (BchE) thành dạng không có hoạt tính.
Chỉ 15% lượng thuốc được chuyển hóa qua gan bởi enzyme P-450, chủ yếu là CYP2C19, tạo ra chất có hoạt tính Chất này ức chế chọn lọc và không hồi phục quá trình gắn ADP vào thụ thể P2Y12 trên bề mặt tiểu cầu, dẫn đến việc các thụ thể GPIIb/IIIa không được kích hoạt và các tiểu cầu không thể kết dính với nhau.
I don't know!
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 1.6 Cơ chế tác dụng clopidogrel lên quá trình NTTC
(Nguồn: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0808227 )
Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C19
Đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism – SNP – đọc là
SNP (biến thể di truyền phổ biến nhất trong DNA ở người) là các đoạn gen chứa thông tin mã hóa cho sản phẩm nhất định, bao gồm nhiều nucleotide (A, T, G, C) Mỗi SNP thể hiện sự khác biệt một nucleotide trong gen, ví dụ như thay thế cytosine (C) bằng thymine (T) Các SNP tạo ra sự khác biệt giữa các cá nhân và là cơ sở tồn tại của sự đa dạng di truyền.
Hình 1.7 Mô tả single nucleotide polymorphism (SNP) (Nguồn: https://www.tubascan.eu/tubascan/snp/)
SNP được xác định khi tần số xuất hiện của một alen đạt 1% trở lên, thường chỉ có 2 loại alen do SNP phát sinh từ đột biến điểm trong hệ gen, chuyển đổi một nucleotide này sang nucleotide khác Nếu đột biến xảy ra trong tế bào sinh sản, các thế hệ sau sẽ mang đột biến này, dẫn đến sự hình thành SNP trong quần thể Chỉ có 2 alen tồn tại: một alen gốc và một alen đột biến Để có alen thứ 3, cần một đột biến mới tại vị trí trước đó, nhưng khả năng này rất hiếm, nên phần lớn SNP chỉ có 2 alen.
SNP có thể xuất hiện trong vùng mã hóa mà không làm thay đổi trình tự axit amin, hoặc có thể gây ra sự thay đổi trong trình tự axit amin Ngoài ra, SNP cũng có thể xảy ra trong vùng điều khiển, dẫn đến sự thay đổi trong biểu hiện gen, hoặc nằm trong vùng giữa các gen.
SNP (biến thể đơn nucleotide) xuất hiện với tần suất khoảng 1 lần trong mỗi 300 nucleotide, tương đương với khoảng 10 triệu SNP trong hệ gen của con người Chúng đóng vai trò như các marker sinh học, giúp các nhà khoa học xác định vị trí các gen liên quan đến bệnh tật Khi SNP xảy ra trong gen hoặc vùng điều khiển gần gen, chúng có thể ảnh hưởng trực tiếp đến chức năng gen và liên quan đến bệnh tật Mặc dù hầu hết SNP không ảnh hưởng đến sức khỏe, một số SNP lại rất quan trọng trong nghiên cứu sức khỏe con người, giúp dự đoán phản ứng của cá nhân đối với thuốc, nhạy cảm với yếu tố môi trường và nguy cơ phát triển bệnh SNP cũng có thể được sử dụng để theo dõi sự di truyền của gen bệnh trong gia đình, và các nghiên cứu trong tương lai sẽ tiếp tục xác định các SNP liên quan đến các bệnh phức tạp như bệnh tim, tiểu đường và ung thư.
1.3.2 Gen CYP2C19 và vai trò của chúng trong chuyển hóa thuốc
Enzym cytochrome P450, đặc biệt là CYP2C19, là các protein hem nằm ở lưới nội chất của tế bào gan, đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa thuốc Các enzyme CYP nổi bật bao gồm CYP3A4, CYP2D6, CYP2C19, CYP1A2 và CYP2E1, trong đó CYP2C19 là một thành viên chủ chốt trong siêu họ cytochrome P450.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Gen mã hóa cho CYP2C19 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 10 ở người (10q23.33), có kích thước 90,637bp, từ cặp nucleotide 94,762,624 đến cặp nucleotide 94,853,260
Hình 1.8 Vị trí gen CYP2C19 trên nhiễm sắc thể số 10 (Nguồn: https://ghr.nlm.nih.gov/gene/CYP2C19#location )
Gen CYP2C19 gồm 9 exon, mã hóa cho protein CYP2C19 dài 490 axit amin
Gen CYP2C19 có tính đa hình cao với 25 alen đã được xác định, trong đó alen CYP2C19*1 quy định enzym CYP2C19 có hoạt tính chuyển hóa thuốc bình thường Các alen như *2, *3, *4, *5, *6, *7, *8, *17 ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme này, dẫn đến giảm, mất hoặc tăng hoạt tính Đặc biệt, alen *2 và *3 là hai đa hình alen quan trọng nhất, với tần số cao trong quần thể người châu Á.
(Nguồn: https://www.researchgate.net/figure/51745678_fig1_Figure-1-Illustration- of-the-CYP2C19-gene-highlighting-the-location-of)
Hình 1.9 Vị trí của các exon (hộp đen) và một số alen trên gen CYP2C19
➢ Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 có chức năng bình thường
Alen CYP2C19*1: quy định biểu hiện enzym CYP2C19 có chức năng hoạt động bình thường
➢ Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 giảm hoặc mất hoạt tính
Alen rs4244285 (c.681G>A) là đa hình xác định của alen CYP2C19*2, gây ra đột biến đồng hoán thay G bằng A ở exon 5, tạo ra vị trí cắt nối intron - exon bất thường Đa hình này có ba kiểu gen: đồng hợp tử kiểu dại GG, dị hợp tử đột biến GA và đồng hợp tử đột biến AA Đột biến này làm giảm chiều dài khung đọc mRNA, dẫn đến việc tạo ra enzym CYP2C19 không hoạt tính CYP2C19*2 là alen mã hóa cho enzyme mất hoạt tính phổ biến nhất, với tần suất xuất hiện khoảng 12% ở người da trắng, 15% ở người Mỹ gốc Phi và 29-35% ở người châu Á.
Alen CYP2C19*3, được ký hiệu rs4986893, là một dạng đột biến mã hóa cho enzym CYP2C19 mất hoạt tính, xảy ra tại vị trí c.636G>A trong exon 4, dẫn đến sự xuất hiện của mã kết thúc sớm ở axit amin 212 Đa hình này tạo ra ba kiểu gen: đồng hợp tử kiểu dại GG, dị hợp tử đột biến GA và đồng hợp tử đột biến AA Tần số alen CYP2C19*3 trong nhiều quần thể thường dưới 1%, nhưng tỷ lệ này cao hơn ở người châu Á, dao động từ 2-9%.
Ngoài ra, các alen khác mã hóa cho enzym giảm hoặc mất hoạt tính là CYP2C19*4 (rs28399504), *5 (rs56337013), *6 (rs72552267), *7 (rs72558186) và
*8 (rs41291556) Các alen này có tần số dưới 1% trong các quần thể người [68]
Một số alen đã được xác định trong các quần thể khác nhau, tuy nhiên, dữ liệu mô tả về chúng còn hạn chế Các thuật toán phân tích cũng được sử dụng để dự đoán ảnh hưởng của các alen này lên chức năng protein.
1.3.2.2 Vai trò của CYP2C19 trong chuyển hóa thuốc
Enzyme Cytochrome 450 (Cyt-P450) đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa nhiều loại thuốc, bao gồm clopidogrel (Plavix), mephenytoin, omeprazole và diazepam Đặc biệt, enzyme CYP2C19 là enzyme chủ yếu tham gia vào quá trình chuyển hóa thuốc clopidogrel.
Một thuốc A khi đưa vào trong cơ thể sẽ đi theo một hoặc các con đường sau [6]:
- Được hấp thu và thải trừ không biến đổi: bromid, lithi, saccharin
- Chuyển hóa thành chất B (pha I), sau đó thành chất C (pha II) và thải trừ
- Chuyển hóa thành chất D ( pha II) rồi thải trừ
Chất A có thể có hoặc không có hoạt tính sinh học và sinh ra chất B, cũng có thể có hoặc không có hoạt tính Trong khi đó, chất C và D luôn là những chất không có hoạt tính Chất A có khả năng tạo ra nhiều loại chất B hoặc C.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Pha I Qua pha này thuốc ở dạng tan trong lipid sẽ phân cực hơn, dễ tan trong nước hơn Thuốc có thể mất, giảm, tăng hoặc trở nên có hoạt tính sinh học Pha I xảy ra các phản ứng như phản ứng khử, phản ứng thủy phân, nhưng thường gặp nhất là phản ứng oxy hóa với sự tham gia của Cyt-P450 [80]
Pha II Các thuốc đi qua pha này chủ yếu trở thành phức hợp không có hoạt tính, dễ tan trong nước và bị thải trừ Các phản ứng ở pha II đều là các phản ứng liên hợp: một phân tử nội sinh (acid glucuronic, glutathion, sulfat, glycin, acetyl) sẽ ghép với một nhóm hóa học của thuốc để tạo thành các phức hợp tan mạnh trong nước
Thông thường, các phản ứng ở pha I sẽ tạo ra các nhóm chức cần thiết cho các phản ứng ở pha II như nhóm -OH, -COOH, -NH2, -SH [80]
Trong pha I của quá trình phản ứng, phản ứng chính diễn ra là phản ứng oxy hóa, đây là loại phản ứng phổ biến nhất nhờ sự xúc tác của các enzym oxy hóa, đặc biệt là cyptochrome P450 Quy trình này được thực hiện qua các bước chính.
Bước 1, thuốc phản ứng với Cyt-P450 dạng oxy hóa (Fe 3+) để tạo thành phức hợp Drug - P450 (Fe 3+) Trong quá trình này, Cyt-P450 chuyển đổi từ trạng thái spin thấp sang trạng thái spin cao, giúp tối ưu hóa sự chuyển giao điện tử đầu tiên thông qua sự biến đổi thế năng oxy hóa.
Bước 2 Nhận điện tử thứ nhất từ NADPH, dưới tác dụng xúc tác của enzym
Cyt-P450-reductase tạo phức hợp Drug-P450 dạng khử (Fe 2+ )
Bước 3 Phức hợp dạng khử này phản ứng với một phân tử oxy để tạo thành phức hợp oxy hoạt hóa
Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen
và các yếu tố khác trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ trên thế giới và trong nước 1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về mối tương quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19 trên bệnh nhân bệnh mạch vành
Nghiên cứu của Sibbing và các cộng sự (2009) trên 2485 bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da chỉ ra rằng tỉ lệ biến cố huyết khối liên quan đến stent ở những bệnh nhân mang alen đột biến CYP2C19*2 cao gấp 3 lần so với những bệnh nhân có đồng hợp tử kiểu dại, với giá trị p=0,007.
Nghiên cứu đa trung tâm, ngẫu nhiên, mù đôi ELEVATE-TIMI (2011) tiến hành trên 333 bệnh nhân bị bệnh tim tại 32 điểm từ tháng 10/2010 đến tháng 9/2011
Bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*2 khi sử dụng liều clopidogrel 225 mg cho hiệu quả dược lý tương đương với liều chuẩn 75 mg Tuy nhiên, đối với bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử CYP2C19*2, liều 300 mg cũng không mang lại tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu.
Nghiên cứu của Yang J và cộng sự (2013) chỉ ra rằng những người mang một hoặc hai alen đột biến (*1/*2, *1/*3, *2/*3, *2/*2, *3/*3) có độ NTTC tối đa với ADP cao hơn so với những người mang kiểu dại (*1/*1), với giá trị p lần lượt là 0,002 và 0,0039.
Nghiên cứu của Yu Chen và các cộng sự (2015) trên 336 bệnh nhân HCĐMVC đã chỉ ra rằng nhóm bệnh nhân mang alen CYP2C19*2 có tỷ lệ NTTC cao hơn đáng kể so với nhóm mang kiểu gen dại, với p lần lượt là 0,005 và 0,003 sau 1 tháng và 6 tháng Ngoài ra, nguy cơ xảy ra các biến cố tim mạch chính ở bệnh nhân mang alen CYP2C19*2 cũng cao hơn so với nhóm bệnh nhân mang alen kiểu dại CYP2C19*1, với p=0,003.
Nghiên cứu chỉ ra rằng alen CYP2C19*2 có tỷ lệ cao trong quần thể, và bệnh nhân mang alen này gặp biến cố tim mạch nặng hơn so với người không mang gen Điều này khẳng định vai trò quan trọng của CYP2C19*2 trong việc kháng thuốc clopidogrel.
1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Chưa có nghiên cứu nào xác định mối liên quan giữa độ NTTC và kiểu gen CYP2C19 ở bệnh nhân ĐTNKÔĐ tại Việt Nam Hiện tại, chỉ có các nghiên cứu liên quan đến độ NTTC với một số yếu tố trong các bệnh lý khác nhau.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Nguyễn Thị Nữ, Cung Thị Tý và Đỗ Trung Phấn (1997) đã tiến hành nghiên cứu về chỉ số NTTC ở người trưởng thành Việt Nam bình thường Kết quả cho thấy, khi sử dụng chất kích thích tiểu cầu collagen với nồng độ 1mg/ml, chỉ số NTTC đạt 65,5±6,7% Đối với chất kích thích ADP với nồng độ 10µM, chỉ số này là 67±6,5%.
Không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về độ NTTC giữa nam và nữ [17]
Trương Thị Minh Nguyệt (2003) đã nghiên cứu độ NTTC ở bệnh nhân thiếu máu cục bộ cơ tim với chất kích thích ADP nồng độ 5µM, cho thấy độ NTTC là 71,6±8,83% Đặc biệt, ở nhóm bệnh nhân NMCT cấp, độ NTTC tăng lên 74,46±9,95%, có sự khác biệt có ý nghĩa so với nhóm chứng Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng độ NTTC tăng có liên quan đồng biến với hàm lượng fibrinogen huyết tương và có xu hướng tăng theo số lượng yếu tố nguy cơ như THA, ĐTĐ, béo phì, hút thuốc lá và tiền sử gia đình mắc bệnh tim mạch.
Nghiêm Hoàng Lan Phương (2007) đã chỉ ra rằng độ NTTC ở bệnh nhân NMCT cấp trước và ĐMV đạt 74,3±10,2%, cao hơn so với 67±6,5% ở người bình thường Những bệnh nhân NMCT cấp với nhiều yếu tố nguy cơ có độ NTTC cao hơn so với những người có ít yếu tố nguy cơ Đặc biệt, độ NTTC giảm rõ rệt sau khi áp dụng liều điều trị tấn công với thuốc chống NTTC như Plavix, Aspirin và Lovenox so với trước can thiệp.
Trần Hòa và Trương Quang Bình (2015) nghiên cứu mối liên hệ giữa các kiểu gen giảm chức năng CYP2C19*2 và CYP2C19*3 với tiên lượng bệnh nhân can thiệp đặt stent động mạch vành có sử dụng clopidogrel Nghiên cứu này vẫn đang trong quá trình thực hiện và chưa công bố kết quả cuối cùng.
Chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam về mối liên hệ giữa độ nhạy thuốc với đa hình di truyền gen CYP2C19 ở bệnh nhân đái tháo đường không phụ thuộc insulin Do đó, việc tiếp tục nghiên cứu trong lĩnh vực này là rất cần thiết, nhằm nâng cao hiệu quả trong điều trị và phòng ngừa bệnh đái tháo đường không phụ thuộc insulin.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Tất cả các bệnh nhân được chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn ACCF/AHA (American College of Cardiology Foundation/ American Heart Association) (2012)
Bệnh nhân được điều trị bằng liệu pháp kháng tiểu cầu kép sau khi nhập viện, bắt đầu vào ngày thứ 3 với liều duy trì aspirin 100mg mỗi ngày kết hợp với clopidogrel 75mg mỗi ngày.
- Bệnh nhân phải dùng thêm bất cứ một loại thuốc chống ngưng tập tiểu cầu nào khác ngoài aspirin và clopidogrel
- Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng
- Tai biến mạch não dưới 3 tháng
- Mới phẫu thuật dưới 1 tuần
- Nguy cơ cao chảy máu
- Suy thận, suy gan giai đoạn cuối.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
➢ Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 1/2018
➢ Địa điểm thu mẫu: Viện Tim mạch Việt Nam
- Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Viện Tim mạch Việt Nam
- Viện nghiên cứu hệ gen
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang
Chúng tôi đã áp dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện để xác định cỡ mẫu nghiên cứu Đối tượng tham gia được lựa chọn liên tục từ những người thỏa mãn tiêu chuẩn và đồng ý tham gia, cho đến khi đạt được cỡ mẫu 54 bệnh nhân tại Viện Tim mạch Việt Nam.
Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
- Lambda DNA/HindIII Marker, code SM0103, hãng Fermentas
- GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder, code SM0321, hãng Thermo Scientific
- Q5 High – Fidelity DNA polymerase, hãng Neb (New England Biolabs)
- E.Z.N.A blood DNA Mini kit, code D3392, hãng Omega-Biotek
- GeneJET PCR Kit, hãng Thermo Fisher Scientific
- Chất kớch tập là ADP 5 àM của hóng Nippon Corporation (Nhật Bản)
- Máy PCR Prime Thermal Cycler (Code: 5PRIME/02, Anh)
- Máy đo nồng độ DNA Eppendorf Bio Photometer Plus (Eppendorf, Đức)
- Máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzer applied Biosystems, Mỹ
- Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu Chrono – LOG của Mỹ.
Các bước nghiên cứu
Quy trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ như sau:
2.5.2 Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu
Để lấy mẫu, cần 4ml máu từ tĩnh mạch của bệnh nhân, chuyển vào ống chuyên dụng chứa chất chống đông EDTA nhằm ngăn ngừa nhiễm bẩn Cần ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân và mã code để tránh nhầm lẫn giữa các mẫu Lượng máu trong mỗi ống đủ cho nhiều lần tách DNA tổng số, đảm bảo vẫn còn mẫu lưu để thực hiện lại quá trình tách DNA cho đến khi kiểu gen của bệnh nhân được xác định.
Mẫu cần được bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh dân dụng không quá 1 ngày và sau đó phải được vận chuyển an toàn đến phòng thí nghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia, đảm bảo tuân thủ các nguyên tắc an toàn sinh học.
Hà Nội Mẫu tiếp tục được bảo quản trong điều kiện lạnh -30˚C đến khi sử dụng
Ống mẫu cần ghi đầy đủ thông tin như mã bệnh nhân, tên, tuổi và ngày lấy mẫu Tất cả thông tin này phải được lưu trữ trong sổ, bao gồm mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu, cùng với tình trạng mẫu sau khi bàn giao và khi sử dụng.
2.5.3 Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số
2.5.3.1 Tách chiết DNA tổng số
Chúng tôi sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số
Nguyên lý kit: Dưạ trên sự hấp thụ chọn lọc của các axit nucleic vào màng silica-gel trong điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính bao gồm:
- Phá vỡ tế bào để giải phóng DNA
- DNA liên kết với màng silica-gel
- Loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với Wash Buffer
- Thu nhận DNA tổng số
2.5.3.2 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số
Sau khi tách chiết, DNA tổng số được kiểm tra theo hai phương pháp sau:
➢ Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang
Thực nghiệm được tiến hành tại bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Chúng tôi sử dụng máy Eppendorf Bio Photometer Plus
Các bước của quy trình thao tác chung:
- Đo Blank: Đo với môi trường được sử dụng để bảo quản/ pha loãng mẫu DNA
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
➢ Kiểm tra DNA bằng phương pháp điện di
- Điều kiện điện di: Điện di trên gel agarose 0,7% pha trong đệm TAE 1X, hiệu điện thế 90V, thời gian chạy 60 phút
- Thể tớch mẫu điện di: 5 àl mẫu + 1àl DNA 6X loading dye, 5àl Ruler 100
2.5.4 Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR và kiểm tra chất lượng sản phẩm
2.5.4.1 Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR
Kỹ thuật PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) là phương pháp khuếch đại đoạn trình tự DNA mong muốn, trong đó DNA mới được tổng hợp từ DNA khuôn ban đầu nhờ enzym polymerase Các thành phần chính của phản ứng bao gồm DNA khuôn, mồi, dung dịch đệm, 4 loại deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) và DNA polymerase Quy trình PCR được chia thành ba giai đoạn chính.
- Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95˚C) để tách hai mạch của chuỗi DNA xoắn kép
Trong giai đoạn gắn mồi, nhiệt độ được điều chỉnh xuống mức thích hợp để mồi có thể bắt cặp với sợi DNA khuôn Nhiệt độ này phụ thuộc vào loại mồi được sử dụng, bao gồm trình tự và số lượng nucleotide của mồi.
- Giai đoạn kéo dài: Enzyme DNA polymerase sẽ tổng hợp mạch polynucleotide mới dựa vào mạch khuôn và 4 loại dNTP tại nhiệt độ 72˚C [24]
Trình tự mồi nhân dòng các alen *2 và *3 được trình bày dưới đây:
Bảng 2.1 Trình tự mồi nhân dòng các alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3
Alen Mồi Trình tự Độ dài sản phẩm
Chúng tôi tối ưu hóa các thành phần và điều kiện phản ứng PCR cho từng alen *2 và *3 Quy trình PCR cho hai alen này được trình bày chi tiết trong bảng 2.2 và bảng 2.3.
Bảng 2.2 Quy trình PCR cho alen *2 Thành phần Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng
DNA template 5-100 ng - Biến tính: 98˚C trong 3 phút
+ 98˚C trong 10 giây + 59˚C trong 30 giây + 72˚C trong 30 giây
- Kết thúc: 72˚C trong 5 phút dNTP mix, 2 mM 0,2 mM
Bảng 2.3 Quy trình PCR cho alen *3
Thành phần Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng
DNA template 40-170 ng - Biến tính: 98˚C trong 3 phút
+ 98˚C trong 10 giây + 68˚C trong 30 giây + 72˚C trong 30 giây
- Kết thúc: 72˚C trong 5 phút dNTP mix, 2 mM 0,2 mM
2.5.4.2 Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR
Phương pháp điện di là công cụ quan trọng để kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR, được thực hiện theo quy trình tương tự như điện di dùng để kiểm tra chất lượng tách chiết DNA.
2.5.5 Tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng kit GeneJET PCR theo các bước sau:
1 Thêm thể tích Binding Buffer vào sản phẩm PCR theo tỉ lệ 1:1 Mix đều
2 Nếu DNA 0,05)
3.1.4 Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3
3.1.4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số
Khâu tách chiết DNA tổng số đóng vai trò quan trọng trong xác định kiểu gen để đạt được mục tiêu nghiên cứu Để đánh giá chất lượng sản phẩm DNA tổng số, chúng tôi đã áp dụng phương pháp điện di cho đánh giá định tính và đo OD cho đánh giá định lượng Kết quả của các phép đo OD và điện di sẽ được trình bày chi tiết trong bài viết này.
Bảng 3.4 Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của sản phẩm tách DNA
Nồng độ DNA tách từ các mẫu máu toàn phần dao động từ 13,10 ng/μl đến 170,05 ng/μl, với độ tinh khiết cao, thể hiện qua tỷ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng từ 1,806 đến 2,146.
➢ Kết quả điện di DNA tổng số
Sản phẩm tách DNA tổng số cũng được đánh giá bằng cách điện di trên gel agarose 0,7% với hiệu điện thế 90V, chạy trong một giờ
Hình 3.1 Điện di DNA tổng số trên gel Agarose 0,7%
Làn M: Lambda DNA/HindIII Marker Làn 16-38 : DNA tổng số của bệnh nhân có mã tương ứng
Kết quả điện di cho thấy chất lượng DNA tổng số tốt, với tất cả mẫu đều có một băng điện di rõ ràng và ít bị đứt gãy Sản phẩm DNA tách ra đáp ứng đủ điều kiện cho thí nghiệm PCR nhân dòng các phân đoạn gen tiếp theo.
3.4.1.2 Kết quả khuếch đại vùng gen chứa alen CYP2C19*2, CYP2C19*3
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy sự khuếch đại các vùng gen chứa alen *2 và *3, cho phép thu được các vùng gen đặc hiệu cho từng alen.
Hình 3.2 Điện di sản phẩm PCR nhân vùng gen chứa alen CYP2C19*2 (719 bp) và CYP2C19*3 (898 bp) trên gel agarose 1%
Làn M: Ruler 100bp Plus DNA Ladder Lần 2(-), 3(-): Đối chứng âm
Làn 2-41 đến 2-45, 2-49: sản phẩm PCR vùng chứa *2 của các bệnh nhân với mã tương ứng Làn 3-41 đến 3-45 : sản phẩm PCR vùng chứa *3 của các bệnh nhân với mã tương ứng
Kết quả điện di cho thấy các cặp mồi được sử dụng có tính đặc hiệu cao, đồng thời các thành phần và điều kiện phản ứng đã được tối ưu hóa Mỗi alen tạo ra một băng duy nhất, rõ nét, không có băng phụ hay hiện tượng smear, đảm bảo độ chính xác trong phân tích DNA.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3.1.4.3 Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 bằng phương pháp RFLP có đối chiếu với phương pháp giải trình tự
Trước khi thực hiện RFLP và giải trình tự, sản phẩm PCR cần được tinh sạch và đo nồng độ DNA Chúng tôi đã sử dụng kit E.Z.N.A.® Cycle-Pure Kit (Omega-biotech) để tinh sạch 25 µl sản phẩm PCR theo quy trình khuyến cáo.
Sản phẩm PCR lờn băng điện di đặc hiệu, được tinh sạch với nồng độ tối thiểu 15 ng/µl, sẽ được mang đi GTT 2 chiều tại First Base (Malaysia) Kết quả GTT sẽ được phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên bản 7.1.9, từ đó xác định kiểu gen trên từng alen *2 và *3 Kết quả kiểu gen được thể hiện trong hình 3.3 và 3.4 dưới đây.
Hình 3.3 Kết quả giải trình tự alen CYP2C19*2
A Kiểu dại GG, B Dị hợp đa hình GA, C Đồng hợp đa hình AA
Hình 3.4 Kết quả giải trình tự alen CYP2C19*3
A Kiểu dại GG, B Dị hợp đa hình GA
CYP2C19*2 có kiểu gen dại là GG, trong khi kiểu gen dị hợp và đồng hợp đa hình lần lượt là GA và AA Tương tự, CYP2C19*3 cũng có kiểu gen dại là GG và kiểu gen dị hợp đa hình.
GA Sản phẩm GTT cho hình ảnh rõ nét Các đỉnh màu tương ứng với các nucleotide rõ ràng và không bị nhiễu
Bàn luận
ĐTNKÔĐ là một loại của hội chứng động mạch vành cấp, chủ yếu do nứt hoặc vỡ các mảng xơ vữa không ổn định, dẫn đến hình thành cục máu đông mà chưa gây tắc hoàn toàn động mạch vành Mặc dù chưa tắc nghẽn, ĐTNKÔĐ có thể tiến triển nặng và gây ra nhồi máu cơ tim thực sự, dẫn đến các biến cố tim mạch nghiêm trọng.
Bệnh động mạch vành, đặc biệt là ĐTNKÔĐ, là nguyên nhân chính gây ra những nguy cơ nghiêm trọng cho sức khỏe, dẫn đến tỷ lệ tử vong và tàn tật cao trên toàn cầu Tình trạng này đang gia tăng nhanh chóng ở các nước đang phát triển, bao gồm cả Việt Nam.
Chống hình thành huyết khối bằng cách ức chế hoạt động tiểu cầu là phương pháp điều trị chính trong ĐTNKÔĐ tại Việt Nam Phương pháp này dựa trên các hướng dẫn quốc tế cập nhật, như hướng dẫn của Hội Tim mạch Hoa Kỳ, nhằm nâng cao sức khỏe và cải thiện tiên lượng sống cho bệnh nhân.
Liệu pháp kháng tiểu cầu kép với sự kết hợp của aspirin và clopidogrel hiện đang được coi là phương pháp điều trị hàng đầu trong việc ngăn ngừa các biến cố tim mạch liên quan đến NTTC.
Mặc dù tuân thủ đúng phác đồ điều trị, một số lượng lớn bệnh nhân ĐTNKÔĐ vẫn gặp phải biến cố thiếu máu cục bộ Nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt giữa các bệnh nhân sử dụng clopidogrel, một tiền chất không có tác dụng sinh học, được chuyển hóa thành thuốc có hoạt tính nhờ cytochrome P450 tại gan, chủ yếu là CYP2C19 Clopidogrel giúp giảm độ NTTC bằng cách ức chế không hồi phục thụ thể P2Y12 trên màng tiểu cầu, ngăn chặn sự kết dính của các tiểu cầu.
Enzym CYP2C19 là một enzym có tính đa hình cao với 25 alen, và hoạt tính của enzym này thay đổi tùy thuộc vào sự hiện diện của các alen trong kiểu gen.
Alen kiểu dại *1 biểu hiện hoạt tính enzyme bình thường, trong khi các alen *2 và *3 gây mất hoạt tính enzym Cơ chế đáp ứng kém với clopidogrel vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ, không chỉ do yếu tố di truyền như đa hình gen CYP2C19 mà còn do các yếu tố phi di truyền như không tuân thủ điều trị, tương tác thuốc, béo phì, tuổi cao, rối loạn chuyển hóa lipid, hút thuốc, tăng huyết áp, tiểu đường và tiền sử nhồi máu cơ tim.
Nghiên cứu này không chỉ xác định tần số phân bố kiểu gen CYP2C19 mà còn đánh giá mối tương quan giữa độ NTTC và đa hình CYP2C19 cùng một số yếu tố ảnh hưởng khác ở bệnh nhân ĐTNKÔĐ tại Việt Nam Kết quả cho thấy có sự liên quan giữa độ NTTC ở bệnh nhân mang alen quy định enzym hoạt động bình thường và bệnh nhân mang alen quy định enzym mất hoạt tính chuyển hóa (p