TỔNG QUAN
Đau thắt ngực không ổn định
ĐTNKÔĐ, một loại trong hội chứng đau ngực không ổn định (HCĐMVC), được xác định bởi các triệu chứng lâm sàng của thiếu máu cơ tim, bao gồm cơn đau thắt ngực mới xuất hiện, biến đổi các dạng đau ngực, hoặc gia tăng cơn đau thắt ngực khi nghỉ ngơi Trong trường hợp này, không có dấu ấn sinh học của tổn thương cơ tim như troponin, và điện tâm đồ có thể có những thay đổi nhất định.
1.1.2 Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ
Xơ vữa động mạch (XVĐM) là quá trình hình thành các mảng xơ vữa trong lớp nội mô của động mạch lớn và vừa, dẫn đến thiếu máu cấp tính Các yếu tố nguy cơ như cholesterol máu cao, tăng huyết áp (THA), tiểu đường (ĐTĐ) và hút thuốc lá đóng vai trò quan trọng trong việc khởi phát XVĐM Những yếu tố này gây tổn thương tế bào nội mô, rối loạn chức năng nội mô, giảm hoạt tính sinh học của nitric oxide, tăng sản xuất endothelin và làm tăng nguy cơ đông máu.
Viêm đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của mảng xơ vữa Khi tế bào nội mô bị tổn thương, monocyte gắn với các phân tử dính nội mô, xâm nhập vào lớp dưới nội mô và chuyển hóa thành đại thực bào Các đại thực bào này tiêu thụ LDL, hình thành tế bào bọt và tạo ra dải chất béo Để duy trì viêm, đại thực bào hoạt hóa thu hút thêm đại thực bào khác thông qua việc tiết ra các chất trung gian Ngoài ra, chúng cũng kích thích sự tăng sinh và hình thành tế bào cơ trơn trong lưới ngoại bào nhờ vào việc tiết ra các cytokine, góp phần vào sự hình thành mô xơ trong lưới ngoại bào.
Nguy cơ vỡ mảng xơ vữa phụ thuộc vào kiểu mảng xơ vữa hơn là kích thước
Lõi vữa của mảng xơ vữa chứa nhiều lipid và thiếu collagen hỗ trợ, với kích thước lõi vữa tỉ lệ thuận với nguy cơ vỡ mảng xơ vữa Viêm đóng vai trò quan trọng trong việc làm mảng xơ vữa dễ tổn thương, liên quan đến sự gia tăng hoạt động của đại thực bào và lympho T tại vị trí mảng Sự gia tăng này không chỉ làm lớn lên kích thước lõi xơ vữa mà còn làm mỏng vỏ bao xơ của mảng.
Các phân tích bệnh học cho thấy sự thiếu hụt tế bào cơ trơn trong các mảng xơ vữa dễ tổn thương Các chất trung gian viêm có thể dẫn đến cái chết của tế bào cơ trơn hoặc ức chế tổng hợp collagen Mảng xơ vữa có nguy cơ cao nếu chúng có lõi lớn, vỏ mỏng, dày đặc đại thực bào và lympho T, số lượng tế bào cơ trơn ít, cùng với tăng cường biểu hiện metalloproteinase, dẫn đến thoái hóa collagen, tăng sinh mạch và xuất huyết.
Hình 1.1 Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ (Nguồn: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJM199901143400207)
Khi mảng xơ vữa vỡ ra, lớp dưới nội mô tiếp xúc với tiểu cầu, dẫn đến hoạt hóa thụ thể trên bề mặt tiểu cầu và hình thành huyết khối Nếu mảng vỡ nhỏ, cục huyết khối có thể không làm tắc hoàn toàn động mạch vành, chỉ giảm dòng máu tới vùng cơ tim, gây ra cơn đau thắt ngực không ổn định Nội soi động mạch vành cho thấy 73,7% bệnh nhân ĐTNKÔĐ có huyết khối trong lòng động mạch vành.
1.1.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán đau thắt ngực không ổn định
Chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn của ACCF/AHA (2012) (American college of Cardiology Foundation/ American Heart Association) [53]:
- Lâm sàng: cơn ĐTNKÔĐ có thể hiện diện dưới các dạng thức khác nhau:
+ Cơn đau thắt ngực xuất hiện dưới đây (4-8) tuần
+ Cơn đau thắt ngực trầm trọng dần thêm (tần số hoặc cường độ hoặc thời gian các cơn đau, giảm đáp ứng với các dẫn xuất nitrat)
Cơn đau thắt ngực kéo dài hơn 15-20 phút khi nghỉ ngơi và có thể đáp ứng với các dẫn xuất nitrat, có thể là dấu hiệu của nhồi máu cơ tim không có sóng Q.
- Điện tâm đồ lúc nghỉ có thể thay đổi
- Men CK-MB, troponin T, Ic không tăng.
Tổng quan về ngưng tập tiểu cầu
Tiểu cầu là thành phần nhỏ nhất của máu, có hình đĩa và đường kính 3-4 µm, không có nhân, được sản xuất từ nguyên mẫu tiểu cầu tại tủy xương Dưới kính hiển vi, tiểu cầu có cấu trúc phức tạp với hệ thống màng, vi quản, ống đặc, nhiều hạt và các kênh mở Màng tiểu cầu bao gồm hai lớp lipid kép và chứa glycoprotein (GP) hoạt động như thụ thể bề mặt, đóng vai trò quan trọng trong quá trình đông máu Ngoài ra, màng tiểu cầu còn có khả năng nhận và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học bên trong.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
1.2.2 Quá trình ngưng tập tiểu cầu Ở trạng thái sinh lý bình thường, khi mạch máu nguyên vẹn, tiểu cầu bị bất hoạt, không bám dính được do hoạt động của nitric oxide, prostacyclin và do khả năng kìm hãm kích hoạt ADP của ADPase (adenosin diphotphatase) từ các tế bào nội mô Tuy nhiên, khi mạch máu bị tổn thương, tiểu cầu sẽ nhanh chóng bám dính vào thành mạch, thay đổi hình dạng, bài tiết và ngưng tập thông qua một loạt phản ứng dẫn đến hình thành nút tiểu cầu tại mô tổn thương Quá trình tạo tiểu cầu hoạt hóa có thể được chia thành các bước: bám dính, ngưng tập và phóng thích các chất [50]
Khi mạch máu bị tổn thương, các yếu tố kháng tiểu cầu nội sinh suy yếu, làm lộ lớp dưới nội mô với các protein dính như collagen và yếu tố von Willebrand (vWF) Ở tốc độ dòng máu cao, vWF đóng vai trò quan trọng trong việc bám dính tiểu cầu thông qua liên kết với phức hợp GP Ib/IX/V Ngược lại, khi tốc độ dòng máu thấp, bám dính tiểu cầu chủ yếu diễn ra qua collagen và phức hợp GP Ia/IIa, giúp tiểu cầu lưu thông chậm lại và tăng cường sự tương tác giữa các thụ thể Đặc biệt, sự tương tác giữa collagen và GP VI kích hoạt các thụ thể GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa, tạo ra liên kết mạnh với vWF và collagen.
Trong giai đoạn hình thành cục máu đông, tiểu cầu kết dính với nhau để tạo thành các đám tiểu cầu, được gọi là nút tiểu cầu Thụ thể GP IIb/IIIa đóng vai trò quan trọng trong quá trình này, góp phần vào sự ổn định của cục máu đông.
Khi tiểu cầu bất hoạt, phức hợp GP IIb/IIIa có mặt trên bề mặt của chúng, nhưng khi tiểu cầu được kích hoạt, các GP IIb/IIIa mới được hoạt hóa và hoạt động như thụ thể gắn với fibrinogen, vWF, fibronectin và vitronectin, trong đó fibrinogen là chất chủ yếu do nồng độ cao trong huyết tương và ái lực mạnh của GP IIb/IIIa với fibrinogen Sự gắn kết này tạo ra cầu nối giữa các tiểu cầu, dẫn đến sự ngưng tập và tiếp tục hoạt hóa, diễn ra liên tục cho đến khi hình thành nút tiểu cầu Các chất gây ngưng tập tiểu cầu (NTTC) như ADP, adrenalin, thromboxan A2, collagen và ristocetin, trong đó ADP là chất quan trọng nhất vì không phụ thuộc vào tác nhân khác và tăng cường phản ứng ngưng tập ADP được tiết ra từ hồng cầu ở các mạch bị tổn thương, làm tăng nhanh nồng độ ADP và giúp tạo nút cầm máu nhanh chóng Hiệu quả của ADP tối đa khi gắn kết với ba thụ thể P2Y1, P2Y12 và P2X1, trong đó P2Y1 và P2Y12 là thiết yếu cho hiện tượng NTTC Đây là trọng tâm trong nghiên cứu thuốc ức chế NTTC nhằm dự phòng và điều trị huyết khối.
➢ Giai đoạn phóng thích các chất của tiểu cầu
Sau khi bị ngưng tập bởi các chất gây ngưng tập, tiểu cầu trải qua nhiều biến đổi phức tạp, bao gồm thay đổi hình dạng và phóng thích các yếu tố sinh học Những biến đổi này ảnh hưởng đến cả hình thái và quá trình sinh hóa của tiểu cầu.
Hình 1.3 Bám dính và ngưng tập tiểu cầu (Nguồn:https://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=PMC4265014_40681_20
1.2.3 Điều trị ức chế NTTC trong ĐTNKÔĐ
Chống hình thành huyết khối bằng cách ức chế hoạt hóa tiểu cầu là phương pháp điều trị chủ yếu trong ĐTNKÔĐ, giúp giảm nguy cơ biến cố tim mạch và tỉ lệ tử vong ở bệnh nhân Các thuốc chống ngưng tập tiểu cầu (NTTC) được phân loại theo cơ chế tác dụng.
- Thuốc ức chế Cyclooxygenase (aspirin)
- Thuốc ức chế thụ thể ADP (clopidogrel [Plavix], prasugrel [Effient], ticlopidine [Ticlid])
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
- Thuốc ức chế thụ thể GPIIb/IIIa (abciximab [ReoPro], eptifibatide [Integrilin], tirofiban [Aggrastat])
- Thuốc ức chế tái hấp thu Adenosin (dipyridamole [Persantine])
- CPTPs (cyclo-pentyl-triazolo-pyrimidines [Ticagrelor])
1.2.4 Thuốc chống NTTC aspirin và clopidogrel
Hình 1.4 Cơ chế tác dụng của aspirin lên quá trình NTTC (Nguồn: http://tmedweb.tulane.edu/pharmwiki/doku.php/introduction_to_eicosanoids)
Aspirin là thuốc chống tiểu cầu phổ biến nhất, đã được chứng minh qua hơn 100 thử nghiệm ngẫu nhiên rằng giảm tử vong do mạch máu khoảng 15% và giảm biến cố tim mạch không gây tử vong khoảng 30% ở bệnh nhân có nguy cơ cao Cơ chế hoạt động của aspirin là ức chế enzyme cyclooxygenase (COX), ngăn chặn quá trình chuyển đổi acid arachidonic thành prostaglandin H2 (PGH2), từ đó giảm tổng hợp thromboxan A2 (TXA2) - một chất gây co mạch mạnh Việc ức chế COX-1 bởi aspirin có tác dụng mạnh mẽ và kéo dài trong suốt đời sống của tiểu cầu do tiểu cầu không có khả năng tổng hợp lại COX-1 Tuy nhiên, aspirin cũng ức chế men prostacyclin synthetase, dẫn đến giảm tổng hợp PGI2 - chất có tác dụng chống đông và giãn mạch, nhưng tác dụng này không kéo dài do tế bào nội mạc có khả năng tổng hợp lại enzyme mới.
Clopidogrel không có hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu Sau khi hấp thu tại ruột, khoảng 85% lượng clopidogrel được chuyển hóa bởi các enzyme esterase, bao gồm carboxylesterase (CES) và butyrylcholinesterase (BchE), thành các chất không có hoạt tính.
Chỉ có 15% lượng thuốc được chuyển hóa qua gan nhờ hệ thống enzyme P-450, chủ yếu là CYP2C19, tạo ra chất có hoạt tính Chất này ức chế chọn lọc và không hồi phục quá trình gắn ADP vào thụ thể P2Y12 trên bề mặt tiểu cầu, dẫn đến việc các thụ thể GPIIb/IIIa không được kích hoạt, khiến tiểu cầu không thể kết dính với nhau.
Hình 1.5 Quá trình chuyển hóa clopidogrel và công thức cấu tạo của các chất sau mỗi bước chuyển hóa (Nguồn: https://www.researchgate.net/figure/Clopidogrel-metabolism-and-its- conversion-to-an-active-metabolite-Clopidogrel-AM-via_fig1_313838290)
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 1.6 Cơ chế tác dụng clopidogrel lên quá trình NTTC
(Nguồn: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0808227 )
Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C19
Đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism – SNP – đọc là
SNP (biến thể di truyền phổ biến nhất trong DNA ở người) là một đoạn phân tử DNA mang thông tin mã hóa cho sản phẩm nhất định Mỗi gen chứa nhiều nucleotide (A, T, G và C), và mỗi SNP đại diện cho sự khác biệt một nucleotide trong gen, tạo ra sự khác biệt giữa các cá thể Ví dụ, một SNP có thể thay thế nucleotide cytosine (C) bằng nucleotide thymine (T), thể hiện sự khác biệt duy nhất giữa các cá nhân.
Hình 1.7 Mô tả single nucleotide polymorphism (SNP) (Nguồn: https://www.tubascan.eu/tubascan/snp/)
SNP được xác định khi tần số xuất hiện của một alen đạt 1% trở lên, thường chỉ có 2 loại alen do SNP bắt nguồn từ đột biến điểm trong hệ gen, chuyển đổi một nucleotide sang nucleotide khác Nếu đột biến xảy ra trong tế bào sinh sản, các thế hệ sau sẽ mang theo đột biến này, hình thành SNP trong quần thể Chỉ có 2 alen tồn tại: một alen gốc và một alen đột biến Để xuất hiện alen thứ 3, cần có một đột biến mới tại vị trí trước đó, nhưng khả năng này rất hiếm, dẫn đến phần lớn SNP chỉ có 2 alen.
SNP có thể xảy ra trong vùng mã hóa mà không làm thay đổi trình tự axit amin, hoặc có thể gây ra sự thay đổi trong trình tự axit amin Ngoài ra, SNP cũng có thể xảy ra trong vùng điều khiển, dẫn đến sự thay đổi trong biểu hiện gen, và có thể xuất hiện trong các vùng giữa các gen.
SNP xuất hiện với tần suất một lần trong mỗi 300 nucleotide, tương đương với khoảng 10 triệu SNP trong hệ gen của con người Chúng đóng vai trò như các marker sinh học, giúp xác định vị trí các gen liên quan đến bệnh tật Khi xảy ra trong gen hoặc vùng điều khiển gần gen, SNP có thể ảnh hưởng trực tiếp đến chức năng gen và liên quan đến bệnh tật Mặc dù hầu hết SNP không ảnh hưởng đến sức khoẻ, một số SNP đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong nghiên cứu sức khoẻ con người, bao gồm dự đoán phản ứng với thuốc, nhạy cảm với môi trường và nguy cơ phát triển bệnh Ngoài ra, SNP cũng hỗ trợ theo dõi di truyền gen bệnh trong gia đình, và các nghiên cứu trong tương lai sẽ tiếp tục xác định các SNP liên quan đến các bệnh phức tạp như bệnh tim, tiểu đường và ung thư.
1.3.2 Gen CYP2C19 và vai trò của chúng trong chuyển hóa thuốc
Enzym cytochrome P450 là các protein màng chứa hem, chủ yếu nằm ở lưới nội chất của tế bào gan Nhóm enzyme này bao gồm các loại chính như CYP3A4, CYP2D6, CYP2C19, CYP1A2 và CYP2E1, trong đó CYP2C19 đóng vai trò quan trọng trong siêu họ cytochrome P450.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Gen mã hóa cho CYP2C19 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 10 ở người (10q23.33), có kích thước 90,637bp, từ cặp nucleotide 94,762,624 đến cặp nucleotide 94,853,260
Hình 1.8 Vị trí gen CYP2C19 trên nhiễm sắc thể số 10 (Nguồn: https://ghr.nlm.nih.gov/gene/CYP2C19#location )
Gen CYP2C19 gồm 9 exon, mã hóa cho protein CYP2C19 dài 490 axit amin
Gen CYP2C19 có tính đa hình cao với 25 alen đã được xác định Allele CYP2C19*1 quy định enzym CYP2C19 có hoạt tính chuyển hóa thuốc bình thường, trong khi các allele như *2, *3, *4, *5, *6, *7, *8, *17 ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme này, dẫn đến giảm, mất hoặc tăng hoạt tính Trong số đó, allele *2 và *3 là hai đa hình alen quan trọng nhất, chiếm tần số cao trong quần thể người châu Á.
(Nguồn: https://www.researchgate.net/figure/51745678_fig1_Figure-1-Illustration- of-the-CYP2C19-gene-highlighting-the-location-of)
Hình 1.9 Vị trí của các exon (hộp đen) và một số alen trên gen CYP2C19
➢ Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 có chức năng bình thường
Alen CYP2C19*1: quy định biểu hiện enzym CYP2C19 có chức năng hoạt động bình thường
➢ Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 giảm hoặc mất hoạt tính
Alen rs4244285 (c.681G>A) là đa hình xác định của alen CYP2C19*2, gây ra đột biến đồng hoán thay G bằng A ở exon 5, tạo vị trí cắt nối intron - exon bất thường Đa hình này bao gồm 3 kiểu gen: đồng hợp tử kiểu dại GG, dị hợp tử đột biến GA và đồng hợp tử đột biến AA Đột biến này làm khung đọc mRNA bị cắt ngắn, dẫn đến việc tạo ra enzym CYP2C19 không có hoạt tính CYP2C19*2 là alen phổ biến nhất mã hóa cho enzyme mất hoạt tính, với tần số khoảng 12% ở người da trắng, 15% ở người Mỹ gốc Phi và 29-35% ở người châu Á.
Alen CYP2C19*3, được ký hiệu rs4986893, là dạng đột biến mã hóa cho enzym CYP2C19 mất hoạt tính, xảy ra tại vị trí c.636G>A trong exon 4, dẫn đến sự xuất hiện mã kết thúc sớm ở axit amin 212 Đa hình này tạo ra ba kiểu gen: đồng hợp tử kiểu dại GG, dị hợp tử đột biến GA và đồng hợp tử đột biến AA Tần số alen CYP2C19*3 trong phần lớn quần thể là dưới 1%, nhưng tỷ lệ này cao hơn ở người châu Á, dao động từ 2-9%.
Ngoài ra, các alen khác mã hóa cho enzym giảm hoặc mất hoạt tính là CYP2C19*4 (rs28399504), *5 (rs56337013), *6 (rs72552267), *7 (rs72558186) và
*8 (rs41291556) Các alen này có tần số dưới 1% trong các quần thể người [68]
Nhiều alen khác đã được phát hiện trong các quần thể khác nhau, tuy nhiên, dữ liệu mô tả về chúng còn hạn chế Các thuật toán phân tích cũng đã được áp dụng để dự đoán tác động của các alen này đối với chức năng protein.
1.3.2.2 Vai trò của CYP2C19 trong chuyển hóa thuốc
Siêu họ enzyme Cytochrome 450 (Cyt-P450) đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa nhiều loại thuốc, bao gồm clopidogrel (Plavix), mephenytoin, omeprazole và diazepam Đặc biệt, enzyme CYP2C19 là enzyme chủ yếu tham gia vào quá trình chuyển hóa thuốc clopidogrel.
Một thuốc A khi đưa vào trong cơ thể sẽ đi theo một hoặc các con đường sau [6]:
- Được hấp thu và thải trừ không biến đổi: bromid, lithi, saccharin
- Chuyển hóa thành chất B (pha I), sau đó thành chất C (pha II) và thải trừ
- Chuyển hóa thành chất D ( pha II) rồi thải trừ
Chất A có thể có hoặc không có hoạt tính sinh học, dẫn đến sự hình thành của chất B, cũng có thể có hoặc không có hoạt tính Trong khi đó, chất C và D luôn được xác định là không có hoạt tính Đặc biệt, chất A có khả năng tạo ra nhiều loại chất B hoặc C.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Pha I Qua pha này thuốc ở dạng tan trong lipid sẽ phân cực hơn, dễ tan trong nước hơn Thuốc có thể mất, giảm, tăng hoặc trở nên có hoạt tính sinh học Pha I xảy ra các phản ứng như phản ứng khử, phản ứng thủy phân, nhưng thường gặp nhất là phản ứng oxy hóa với sự tham gia của Cyt-P450 [80]
Pha II Các thuốc đi qua pha này chủ yếu trở thành phức hợp không có hoạt tính, dễ tan trong nước và bị thải trừ Các phản ứng ở pha II đều là các phản ứng liên hợp: một phân tử nội sinh (acid glucuronic, glutathion, sulfat, glycin, acetyl) sẽ ghép với một nhóm hóa học của thuốc để tạo thành các phức hợp tan mạnh trong nước
Thông thường, các phản ứng ở pha I sẽ tạo ra các nhóm chức cần thiết cho các phản ứng ở pha II như nhóm -OH, -COOH, -NH2, -SH [80]
Trong pha I, phản ứng chủ yếu là phản ứng oxy hóa, diễn ra phổ biến với sự xúc tác của các enzym oxy hóa, đặc biệt là cyptochrome P450 Quy trình phản ứng này được thực hiện qua các bước chính.
Thuốc phản ứng với Cyt-P450 dạng oxy hóa (Fe 3+) tạo phức hợp Drug - P450 (Fe 3+), dẫn đến sự biến đổi đương lượng từ trạng thái spin thấp sang trạng thái spin cao Quá trình này làm tăng thế năng oxy hóa, từ đó hỗ trợ cho việc vận chuyển điện tử thứ nhất diễn ra thuận lợi.
Bước 2 Nhận điện tử thứ nhất từ NADPH, dưới tác dụng xúc tác của enzym
Cyt-P450-reductase tạo phức hợp Drug-P450 dạng khử (Fe 2+ )
Bước 3 Phức hợp dạng khử này phản ứng với một phân tử oxy để tạo thành phức hợp oxy hoạt hóa
Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen
và các yếu tố khác trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ trên thế giới và trong nước 1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về mối tương quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19 trên bệnh nhân bệnh mạch vành
Nghiên cứu của Sibbing và các cộng sự (2009) trên 2485 bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da cho thấy, tỷ lệ biến cố huyết khối ở những bệnh nhân mang alen đột biến CYP2C19*2 cao gấp 3 lần so với những bệnh nhân mang đồng hợp tử kiểu dại, với giá trị p = 0,007.
Nghiên cứu đa trung tâm, ngẫu nhiên, mù đôi ELEVATE-TIMI (2011) tiến hành trên 333 bệnh nhân bị bệnh tim tại 32 điểm từ tháng 10/2010 đến tháng 9/2011
Bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*2 khi sử dụng liều clopidogrel 225 mg cho thấy tác dụng dược lý tương đương với liều chuẩn 75 mg Trong khi đó, bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử CYP2C19*2 không đạt hiệu quả chống ngưng tập tiểu cầu với liều 300 mg.
Nghiên cứu của Yang J và cộng sự (2013) chỉ ra rằng những người mang một hoặc hai alen đột biến, cụ thể là các kiểu gen (*1/*2, *1/*3, *2/*3, *2/*2, *3/*3), có độ NTTC tối đa với ADP cao hơn đáng kể so với những người mang kiểu dại (*1/*1), với giá trị p lần lượt là 0,002 và 0,0039.
Nghiên cứu của Yu Chen và các cộng sự (2015) trên 336 bệnh nhân HCĐMVC có can thiệp mạch vành qua da cho thấy nhóm bệnh nhân mang alen CYP2C19*2 có độ NTTC cao hơn đáng kể so với nhóm mang kiểu gen dại, với p lần lượt là 0,005 và 0,003 sau 1 tháng Hơn nữa, nguy cơ các biến cố tim mạch chính ở nhóm mang alen CYP2C19*2 cũng cao hơn so với nhóm mang alen CYP2C19*1, với p=0,003.
Nghiên cứu cho thấy alen CYP2C19*2 có tỉ lệ cao trong quần thể, và những bệnh nhân mang alen này gặp phải biến cố tim mạch nghiêm trọng hơn so với những người không mang gen Điều này khẳng định vai trò quan trọng của CYP2C19*2 trong việc kháng thuốc clopidogrel.
1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Đến thời điểm hiện tại, chưa có nghiên cứu nào xác định mối liên quan giữa độ NTTC và kiểu gen CYP2C19 ở bệnh nhân ĐTNKÔĐ tại Việt Nam Hiện chỉ có một số nghiên cứu khám phá mối liên hệ giữa độ NTTC và các yếu tố khác trong các bệnh lý khác nhau.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Nguyễn Thị Nữ, Cung Thị Tý và Đỗ Trung Phấn (1997) đã thực hiện nghiên cứu về "Chỉ số NTTC ở người trưởng thành Việt Nam bình thường", cho thấy rằng chất kích thích tiểu cầu collagen với nồng độ 1mg/ml đạt chỉ số 65,5±6,7%, trong khi chất kích thích ADP với nồng độ 10µM đạt chỉ số 67±6,5%.
Không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về độ NTTC giữa nam và nữ [17]
Trương Thị Minh Nguyệt (2003) đã nghiên cứu độ NTTC ở bệnh nhân thiếu máu cục bộ cơ tim, với kết quả cho thấy nồng độ chất kích thích ADP 5μM đạt 71,6±8,83% Đặc biệt, độ NTTC ở nhóm bệnh nhân NMCT cấp là 74,46±9,95%, cao hơn có ý nghĩa so với nhóm chứng Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng độ NTTC tăng có liên quan đồng biến với hàm lượng fibrinogen huyết tương và có xu hướng tăng theo số lượng các yếu tố nguy cơ như tăng huyết áp, đái tháo đường, béo phì, hút thuốc lá, và tiền sử gia đình mắc bệnh tim mạch.
Nghiêm Hoàng Lan Phương (2007) đã chỉ ra rằng độ NTTC ở bệnh nhân NMCT cấp là 74,3±10,2%, cao hơn so với mức 67±6,5% ở người bình thường Đặc biệt, bệnh nhân có nhiều yếu tố nguy cơ sẽ có độ NTTC cao hơn so với những người ít yếu tố nguy cơ Sau khi điều trị tấn công bằng thuốc chống NTTC (Plavix, Aspirin, Lovenox), độ NTTC giảm rõ rệt so với trước can thiệp.
Nghiên cứu của Trần Hòa và Trương Quang Bình (2015) tập trung vào mối liên hệ giữa các kiểu gen giảm chức năng CYP2C19*2 và CYP2C19*3 với tiên lượng của bệnh nhân can thiệp đặt stent động mạch vành điều trị bằng clopidogrel Hiện tại, nghiên cứu vẫn đang trong quá trình thực hiện và chưa công bố kết quả cuối cùng.
Hiện tại, chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam khám phá mối liên hệ giữa độ nhạy thuốc của CYP2C19 và bệnh nhân đái tháo đường không phụ thuộc insulin Vì vậy, việc tiếp tục nghiên cứu trong lĩnh vực này là rất quan trọng, nhằm cải thiện hiệu quả điều trị và phòng ngừa bệnh đái tháo đường không phụ thuộc insulin.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Tất cả các bệnh nhân được chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn ACCF/AHA (American College of Cardiology Foundation/ American Heart Association) (2012)
Sau khi nhập viện, bệnh nhân được điều trị bằng liệu pháp kháng tiểu cầu kép vào ngày thứ 3, bao gồm liều duy trì aspirin 100mg/ngày kết hợp với clopidogrel 75mg/ngày.
- Bệnh nhân phải dùng thêm bất cứ một loại thuốc chống ngưng tập tiểu cầu nào khác ngoài aspirin và clopidogrel
- Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng
- Tai biến mạch não dưới 3 tháng
- Mới phẫu thuật dưới 1 tuần
- Nguy cơ cao chảy máu
- Suy thận, suy gan giai đoạn cuối.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
➢ Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 1/2018
➢ Địa điểm thu mẫu: Viện Tim mạch Việt Nam
- Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Viện Tim mạch Việt Nam
- Viện nghiên cứu hệ gen
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang
Chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu với cỡ mẫu 54 bệnh nhân tại Viện Tim mạch Việt Nam, sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện Đối tượng nghiên cứu được lựa chọn liên tục, đảm bảo thỏa mãn các tiêu chuẩn và đồng ý tham gia nghiên cứu.
Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
- Lambda DNA/HindIII Marker, code SM0103, hãng Fermentas
- GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder, code SM0321, hãng Thermo Scientific
- Q5 High – Fidelity DNA polymerase, hãng Neb (New England Biolabs)
- E.Z.N.A blood DNA Mini kit, code D3392, hãng Omega-Biotek
- GeneJET PCR Kit, hãng Thermo Fisher Scientific
- Chất kớch tập là ADP 5 àM của hóng Nippon Corporation (Nhật Bản)
- Máy PCR Prime Thermal Cycler (Code: 5PRIME/02, Anh)
- Máy đo nồng độ DNA Eppendorf Bio Photometer Plus (Eppendorf, Đức)
- Máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzer applied Biosystems, Mỹ
- Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu Chrono – LOG của Mỹ.
Các bước nghiên cứu
Quy trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ như sau:
2.5.2 Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu
Để lấy mẫu, cần 4ml máu từ tĩnh mạch của bệnh nhân, chuyển vào ống chuyên dụng có chất chống đông EDTA để tránh nhiễm bẩn Cần ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân và mã code để tránh nhầm lẫn giữa các mẫu Lượng máu trong mỗi ống đủ cho nhiều lần tách DNA tổng số, đảm bảo có mẫu lưu để lặp lại quá trình tách DNA cho đến khi kiểu gen của bệnh nhân được xác định.
Mẫu cần được bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh dân dụng không quá 1 ngày Sau thời gian này, mẫu sẽ được vận chuyển an toàn đến phòng thí nghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia, đảm bảo tuân thủ các nguyên tắc an toàn sinh học.
Hà Nội Mẫu tiếp tục được bảo quản trong điều kiện lạnh -30˚C đến khi sử dụng
Ống mẫu cần ghi rõ các thông tin quan trọng như mã bệnh nhân, tên, tuổi và ngày lấy mẫu Tất cả thông tin này phải được lưu trữ trong sổ, bao gồm mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu, cũng như tình trạng mẫu sau khi bàn giao và khi sử dụng.
2.5.3 Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số
2.5.3.1 Tách chiết DNA tổng số
Chúng tôi sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số
Nguyên lý kit: Dưạ trên sự hấp thụ chọn lọc của các axit nucleic vào màng silica-gel trong điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính bao gồm:
- Phá vỡ tế bào để giải phóng DNA
- DNA liên kết với màng silica-gel
- Loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với Wash Buffer
- Thu nhận DNA tổng số
2.5.3.2 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số
Sau khi tách chiết, DNA tổng số được kiểm tra theo hai phương pháp sau:
➢ Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang
Thực nghiệm được tiến hành tại bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Chúng tôi sử dụng máy Eppendorf Bio Photometer Plus
Các bước của quy trình thao tác chung:
- Đo Blank: Đo với môi trường được sử dụng để bảo quản/ pha loãng mẫu DNA
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
➢ Kiểm tra DNA bằng phương pháp điện di
- Điều kiện điện di: Điện di trên gel agarose 0,7% pha trong đệm TAE 1X, hiệu điện thế 90V, thời gian chạy 60 phút
- Thể tớch mẫu điện di: 5 àl mẫu + 1àl DNA 6X loading dye, 5àl Ruler 100
2.5.4 Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR và kiểm tra chất lượng sản phẩm
2.5.4.1 Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR
Nguyên lý của kỹ thuật PCR là khuếch đại đoạn trình tự DNA mong muốn thông qua việc tổng hợp DNA mới từ DNA khuôn ban đầu bằng enzym polymerase Phản ứng PCR bao gồm các thành phần chính như DNA khuôn, mồi, dung dịch đệm, 4 loại deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) và DNA polymerase Quy trình PCR được chia thành 3 giai đoạn chính.
- Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95˚C) để tách hai mạch của chuỗi DNA xoắn kép
Trong giai đoạn gắn mồi, nhiệt độ được điều chỉnh xuống mức thích hợp để mồi có thể tự kết hợp với sợi DNA khuôn Nhiệt độ này phụ thuộc vào loại mồi được sử dụng, bao gồm trình tự và số lượng nucleotide của mồi.
- Giai đoạn kéo dài: Enzyme DNA polymerase sẽ tổng hợp mạch polynucleotide mới dựa vào mạch khuôn và 4 loại dNTP tại nhiệt độ 72˚C [24]
Trình tự mồi nhân dòng các alen *2 và *3 được trình bày dưới đây:
Bảng 2.1 Trình tự mồi nhân dòng các alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3
Alen Mồi Trình tự Độ dài sản phẩm
Chúng tôi đã tối ưu hóa các thành phần và điều kiện phản ứng PCR cho từng alen *2 và *3 Quy trình PCR cho hai alen này được trình bày chi tiết trong bảng 2.2 và bảng 2.3.
Bảng 2.2 Quy trình PCR cho alen *2 Thành phần Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng
DNA template 5-100 ng - Biến tính: 98˚C trong 3 phút
+ 98˚C trong 10 giây + 59˚C trong 30 giây + 72˚C trong 30 giây
- Kết thúc: 72˚C trong 5 phút dNTP mix, 2 mM 0,2 mM
Bảng 2.3 Quy trình PCR cho alen *3
Thành phần Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng
DNA template 40-170 ng - Biến tính: 98˚C trong 3 phút
+ 98˚C trong 10 giây + 68˚C trong 30 giây + 72˚C trong 30 giây
- Kết thúc: 72˚C trong 5 phút dNTP mix, 2 mM 0,2 mM
2.5.4.2 Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR
Phương pháp điện di là kỹ thuật quan trọng trong việc kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR Quy trình thực hiện tương tự như điện di dùng để kiểm tra chất lượng của việc tách chiết DNA.
2.5.5 Tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng kit GeneJET PCR theo các bước sau:
1 Thêm thể tích Binding Buffer vào sản phẩm PCR theo tỉ lệ 1:1 Mix đều
2 Nếu DNA