TỔNG QUAN
Tổng quan về cây đậu đen
1.1.1 Đặc điểm thực vật học
Cây đậu đen, có tên khoa học là Vigna unguiculata (L.) Walp ssp Cylindrica (L.), thuộc họ cánh bướm (Fabaceae), còn được biết đến với các tên gọi khác như Vigna cylindrica Skeels, Vigna catjang, hoặc đơn giản là Vigna Trong dân gian, cây này thường được gọi là đỗ đen, ô đậu, hắc đại đậu, và hương xị.
Cây đậu đen là loại cỏ mọc nằm ngang, không có lông, với lá kép gồm 3 lá chét mọc so le Lá chét giữa to và dài hơn hai lá chét bên Hoa của cây có màu tím nhạt, và quả giáp dài, tròn, chứa từ 7 đến 10 hạt màu đen Hạt đậu đen có vỏ màu đen, trong khi nhân hạt có màu trắng hoặc xanh.
Hình 1.1 Ảnh minh họa cây và hạt đậu đen 1.1.2 Phân bố và sinh thái
Cây đậu đen, có nguồn gốc từ châu Phi, đã lan rộng ra Trung Á, Ấn Độ và nhiều khu vực khác ở châu Á Hiện nay, loại cây này được trồng rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới tại châu Á, châu Phi và Nam Mỹ Tại Việt Nam, cây đậu đen chủ yếu được trồng ở miền Bắc và thu hoạch vào tháng 5 đến tháng 6 (Đỗ Tất Lợi, 2004).
1.1.3 Thành phần hóa học của hạt đậu đen
Vỏ hạt đậu đen chứa một lượng lớn anthocyanin, một chất chống oxy hóa hiệu quả (Đỗ Tất Lợi, 2004) Ngoài ra, hạt đậu đen thô còn cung cấp protein, chất béo, tro và nitrogen, góp phần vào giá trị dinh dưỡng của nó.
Bảng 1.1 Thành phần hóa học của hạt đậu đen (Thangadurai, 2005)
Thành phần g/100 g bột hạt thô Độ ẩm
Năng lượng ( kJ/100g chất khô)
Hàm lượng protein có trong hạt đậu đen cao hơn so với các cây họ đậu khác như
Cajanus cajan, Cicer arietinum và Vigna umbellata có giá trị năng lượng 1737 kJ, được đánh giá dựa trên protein thô, chất béo thô và NFE (nitrogen free extractives) Hạt đậu đen chứa các thành phần protein chính là albumin và globulin, chiếm lần lượt 45% và 39% tổng lượng protein (Thangadurai, 2005) Ngoài ra, hạt đậu đen còn cung cấp nhiều acid amin thiết yếu như glutamate, aspartate, serine, threonine, proline, alanine, glycine, valine, cystine, methionine, leucine, isoleucine, tyrosine, phenylalanine, lysine, tryptophan và arginine (Thangadurai, 2005).
Hạt đậu đen chứa các acid béo chủ yếu như acid linoleic (35%), palmitic (24%), oleic (16%) và stearic (14%), với hơn 60% là các acid béo không bão hòa Ngoài ra, hạt đậu đen là nguồn giàu khoáng chất như kali, photpho, kẽm và sắt, cùng với một lượng caroten và các vitamin như PP và B.
Hạt đậu đen giàu dinh dưỡng nhưng cũng có một số hạn chế do chứa các chất ức chế dinh dưỡng như L-DOPA, hydrogen cyanide và phytic acid.
Tổng quan về hợp chất màu anthocyanin
1.2.1 Cấu trúc hóa học của các anthocyanin
Hình 1.2: Phân loại cấu trúc của các dạng anthocyanindin thường gặp (Guo & Xia, 2013)
Anthocyanin là một nhóm flavonoid, thuộc dẫn xuất polyhydroxyl và polymethoxyl của 2-phenylbenzopyrylium, với cấu trúc đặc trưng C6-C3-C6 bao gồm hai vòng benzoyl (A và B) ngăn cách bởi dị vòng (C) Trọng lượng phân tử của anthocyanin thường dao động từ 400 đến 1200 Da, với phổ hấp thu nằm trong vùng UV-Vis từ 465 đến 550 nm và UV từ 270 đến 280 nm Đến nay, đã có hơn 600 loại anthocyanin được xác định, trong đó có 6 loại anthocyanidin phổ biến: cyanidin (50%), pelargonidin (12%), peonidin (12%), delphinidin (12%), petunidin (7%) và malvidin (7%).
Nhóm mang màu của liên kết đôi liên hợp với điện tích dương trên dị vòng oxy là nguyên nhân tạo ra màu đỏ - cam đến xanh - tím của anthocyanin trong môi trường acid Các anthocyanin khác nhau có số lượng và vị trí của nhóm hydroxyl và methoxyl khác nhau, tùy thuộc vào bộ khung anthocyanidin Cụ thể, việc tăng số nhóm hydroxyl hóa dẫn đến sự chuyển đổi sang bước sóng dài hơn, làm thay đổi màu sắc từ đỏ sang tím, bao gồm các loại như pelargonidin, cyanidin và delphinidin.
Các gốc đường như glucose, rhamnose, galactose, xylose hoặc arabinose thường được gắn với bộ khung dưới dạng 3-glycoside hoặc 3,5-diglycoside Những gốc đường này có thể là đơn vị mono- hoặc disaccharide, có khả năng acyl hóa với phenolic hoặc acid béo Các đơn vị glycosidic liên kết với anthocyanidin thông qua các liên kết α- hoặc β-, với gốc đường gắn tại vị trí 3 trên vòng C hoặc vị trí 5, 7 trên vòng A, trong khi các liên kết thường xuất hiện ở vị trí 3’-, 4’-, và 5’- của vòng B Glycosyl hóa cũng có thể xảy ra, nhưng hiếm gặp Các saccharide còn lại có thể được acyl hóa bởi phenolic hoặc acid béo, với các tác nhân acyl hóa thông thường như acid cinnamic, caffeic, ferulic, sinapic, acetic, malic, malonic, oxalic và succinic Như vậy, anthocyanin là hợp chất của anthocyanidin và đường, có thể liên kết với các acid hữu cơ khi anthocyanin bị acyl hóa (Prior & Wu, 2006).
1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc của anthocyanin
Màu sắc của anthocyanin phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, bao gồm các yếu tố sau:
♦ Mức độ hydroxyl hóa và methoxyl hóa
Màu sắc của anthocyanin thay đổi từ hồng sang xanh khi số lượng phenolic hydroxyl tăng, và ngược lại, chuyển từ xanh sang hồng khi hydroxyl được thay thế bởi nhóm methoxyl Hydroxyl ở vị trí 3 có khả năng làm thay đổi độ hấp thụ cực đại từ vùng màu vàng-cam sang đỏ Mặc dù các hydroxyl có thể mất ổn định, nhưng sự ổn định này có thể được khôi phục thông qua glycosyl hóa Cả glycosyl hóa và acyl hóa đều có ảnh hưởng tương đương đến màu sắc của các sắc tố (Markakis & Jurd, 2009).
Anthocyanin là một chất chỉ thị pH, thể hiện màu sắc khác nhau tùy thuộc vào độ pH của môi trường Ở pH thấp hơn 3, anthocyanin có màu đỏ do dạng cation chiếm ưu thế Khi pH tăng lên, màu đỏ dần mất đi và chuyển sang không màu ở khoảng pH 4 đến 5 Tiếp tục nâng cao pH, anthocyanin sẽ xuất hiện dưới dạng anion với màu tím và xanh.
Hình 1.3: Cấu trúc và màu của anthocyanin phụ thuộc vào pH ( R = glycosyl) (Markakis
Các anthocyanin trong dung dịch dạng nước tồn tại ở 4 dạng chính: flavylium cation, quinoidal base, hemaiacetal base (carbinol pseudo-base) và chalcone Trong dung dịch pH
Khi pH tăng lên, dạng flavylium cation chiếm ưu thế và có màu đỏ sẽ chuyển hóa thành dạng quinoidal base màu xanh do mất proton Sự hydrat hóa của các flavylium cation dẫn đến sự hình thành carbinol pseudobase không màu Cuối cùng, các dạng này tự động mở vòng C, tạo thành dạng chalone có màu vàng.
Hình 1.4: Các dạng phân tử của anthocyanin (A) Flavylium cation; (B) carbinol pseudo- base; (C) quinoidal base; (D) chalcone (Guo & Xia, 2013) Đỏ, cation, ở pH thấp Không màu ở điểm đẳng điện
♦ Sự đồng sắc tố - sự tạo phức kim loại
Anthocyanin có khả năng tạo phức yếu với các hợp chất như gallotaninnin, flavonoid và polysaccharide, đồng thời cũng có thể kết hợp với muối kim loại để tạo thành metalloanthocyanin Những dạng phức này thường làm thay đổi bước sóng hấp thụ, với sự dịch chuyển về phía bước sóng dài hơn (Markakis & Jurd, 2009).
Bên cạnh đó, màu sắc của anthocyanin còn phụ thuộc vào hàm lượng anthocyanin, sự hiện diện của các flavonoid khác và dung môi (Markakis & Jurd, 2009)
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thoái hóa anthocyanin
Màu sắc của anthocyanin không ổn định và có thể bị thoái hóa trong mô tươi hoặc trong quá trình chế biến và bảo quản Các yếu tố tác động đến sự thoái hóa của anthocyanin trong thực phẩm bao gồm nhiều yếu tố khác nhau.
Độ bền màu của các anthocyanin khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc phân tử của chúng; ví dụ, pelargonidin, cyanidin và delphinidin thường kém bền hơn petunidin và malvidin Số lượng nhóm –OH trong phân tử tăng sẽ làm giảm độ bền màu, trong khi sự gia tăng nhóm –CH3 sẽ cải thiện độ bền Các anthocyanin chứa gốc đường arabinose có độ bền màu thấp hơn so với những anthocyanin chứa đường galactose Ngoài ra, các anthocyanin có nhóm acyl hóa thường bền hơn so với các chất màu tự nhiên khác Đặc biệt, anthocyanin mang các acid thơm ở vòng-B có màu sắc ổn định hơn so với những anthocyanin chứa acid mạch hở.
Enzymes such as glycosidases, polyphenol oxidases, and peroxidases play a significant role in the degradation of anthocyanins (Francis & Markakis, 2009) Glycosidase enzymes, particularly anthocyanases, hydrolyze the glycosidic bonds of anthocyanins, leading to the formation of unstable anthocyanidins and causing natural color fading (Huang, 1955) The polyphenolic compounds present in anthocyanins are influenced by the activity of phenoloxidase (Figure 1.6) Additionally, peroxidase enzymes contribute to the discoloration of anthocyanins by utilizing anthocyanins as hydrogen donors to form peroxidase-hydrogen peroxide compounds (Markakis, 1963).
Hình 1.5: Cơ chế của sự thoái hóa màu athocyanin bởi phenoloxidase (Markakis & Jurd,
Khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phân hủy chất màu anthocyanin tăng (Markakis & Jurd,
Nghiên cứu cho thấy thời gian để phá hủy 50% anthocyanin trong dâu tây phụ thuộc vào nhiệt độ: ở 100°C là 1 giờ, 38°C là 240 giờ, 20°C là 1300 giờ và ở 0°C mất đến 11 tháng (Meschter, 1953) Ngoài ra, việc tăng nhiệt độ có thể kích thích phản ứng Maillard giữa các đường trong anthocyanin, đặc biệt khi có mặt oxy, dẫn đến sự thay đổi màu sắc của anthocyanin (Markakis et al., 1957).
Oxygen có tác động tiêu cực đến sắc tố anthocyanin, gây oxy hóa và làm nhạt màu của chúng Oxy và nhiệt độ được xem là những yếu tố chính thúc đẩy quá trình khử màu sắc tố này (Nebesky & Esselen, 1948).
Sự phá hủy anthocyanin bởi H2O2 xảy ra do H2O2 được sinh ra trong quá trình oxy hóa hiếu khí của acid ascorbic Anthocyanin, với vai trò là chất chống oxy hóa, phản ứng với các gốc tự do chứa oxy từ H2O2 (Kertesz, 1953).
Acid ascorbic thúc đẩy quá trình phân hủy màu sắc của anthocyanin thông qua phản ứng polymer hóa, dẫn đến sự ngưng tụ và làm nhạt màu sắc tố (Meschter, 1953) Sự tương tác giữa acid ascorbic và H2O2 cũng được ghi nhận (Pederson, 1943) Khi có mặt của các ion Cu2+, acid ascorbic bị oxy hóa, tạo ra H2O2, từ đó gây mất màu anthocyanin (Dekker & Dickinson).
Màu sắc của anthocyanin trở nên bền vững hơn ở pH thấp, khi chúng chuyển sang dạng flavylium ổn định hơn Nghiên cứu cho thấy sự ổn định màu của anthocyanin chiết xuất trong dung dịch đệm tăng lên khi pH giảm từ 5 đến 1, với mức tối đa đạt được ở pH 1.8 trong dịch syrup dâu tây Tuy nhiên, khi pH tiếp tục giảm, các sắc tố anthocyanin bị khử màu nhanh chóng hơn, dẫn đến sự phân hủy đường và phản ứng với các chất màu khác.
Một số phương pháp xác định anthocyanin
♦ Phương pháp pH vi sai
Việc định lượng và định tính anthocyanin có thể thực hiện thông qua các đặc tính quang phổ của chúng, đặc biệt là sự chuyển đổi cấu trúc của nhóm mang màu anthocyanin theo pH Phương pháp pH vi sai được coi là một cách nhanh chóng và dễ dàng để định lượng anthocyanin Các sắc tố anthocyanin có khả năng biến đổi cấu trúc thuận nghịch theo sự thay đổi pH, điều này được thể hiện qua các quang phổ hấp thụ khác nhau.
Ở pH 1.0, dạng oxonium của anthocyanin chiếm ưu thế, trong khi ở pH 4.5, các dạng hemiketal không màu trở nên phổ biến Phương pháp pH vi sai dựa trên phản ứng này cho phép đo lường chính xác và nhanh chóng tổng lượng anthocyanin (Wrolstad, 2001).
Hình 1.7 Đặc điểm quang phổ của anthocyanin củ cải tinh khiết (acylated pelargonidin-3- sophoroside-5-glucoside derivatives) trong đệm pH = 1 và pH = 4.5 (Wrolstad, 2001)
♦ Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Phương pháp phân tích HPLC là kỹ thuật hiệu quả trong việc tách và định lượng anthocyanin từ các nguyên liệu khác nhau Sử dụng cột silica C18 và cột polymeric C18, phương pháp này cho phép tách biệt các anthocyanin một cách chính xác (Wrolstad et al., 2005).
♦ Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một công nghệ mạnh mẽ cho phép phân tích hình dạng và cấu trúc của các phân tử phức tạp Phương pháp này cũng được sử dụng để định lượng các hỗn hợp phức tạp và đo tốc độ phản ứng trong các hệ thống hóa học, cả trong ống nghiệm lẫn trong sinh vật sống, bao gồm con người (Smith & Blandford).
NMR là một công cụ quan trọng trong việc xác định cấu trúc của anthocyanin, giúp nhận diện bản chất của các gốc đường cũng như xác định vị trí của các nhóm thế acyl và đường (Wrolstad et al., 2005).
Tình hình nghiên cứu về chất màu anthocyanin
1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước về chất màu anthocyanin
Chất màu anthocyanin đã được nghiên cứu rộng rãi trên toàn cầu, với nhiều công trình tập trung vào thành phần, tính chất, hoạt tính sinh học và ứng dụng của nó Dưới đây là một số nghiên cứu khoa học nổi bật về anthocyanin trên thế giới.
Hoa trà là một thức uống phổ biến toàn cầu, trong đó anthocyanin được xem là chỉ số quan trọng đánh giá chất lượng Năm 2014, nghiên cứu của Xiaowei và cộng sự đã đo tổng hàm lượng anthocyanin trong hoa trà bằng phương pháp quang phổ kế hồng ngoại gần kết hợp với mô hình tối ưu hóa ACO-iPLS Kết quả cho thấy hàm lượng anthocyanin tổng đạt được độ chính xác cao với R = 0.9856 và RMSECV.
Nghiên cứu cho thấy rằng hồng ngoại gần có hiệu suất vượt trội trong việc xác định hàm lượng anthocyanin trong hoa trà với giá trị 0.1198 mg/g, hoàn toàn tốt hơn so với các phương pháp như phổ PLS, mô hình iPLS, và GA-iPLS, mà không gây hại cho mẫu (Xiaowei et al., 2014).
Nghiên cứu của Chiou, Panagopoulou, Gatzali, De Marchi, và Karathanos (2014) đã chỉ ra rằng nho Corinthian (Vitis vinifera L., var Apyrena) chứa năm loại anthocyanidin-3-O-glucoside, trong đó malvidin-3-O-glucoside, peonidin-3-O-glucoside, và cyanidin-3-O-glucoside có hàm lượng cao nhất Kết quả này cho thấy tiềm năng chống oxy hóa của loại nho này.
Một nghiên cứu của Biosci và các cộng sự đã chỉ ra rằng hàm lượng anthocyanin trong lá rau mùi (Coriandrum sativum L.) bị ảnh hưởng bởi salicylic acid và việc sử dụng chất dinh dưỡng Kết quả cho thấy, khi hàm lượng kẽm và nitơ tăng lên, hàm lượng anthocyanin giảm đáng kể so với mẫu đối chứng Bên cạnh đó, phospho và kali cũng có tác động tiêu cực đến hàm lượng anthocyanin (Biosci, Rahimi, Babaei, Mashayekhi, & Rokhzadi, 2013).
Năm 2014, Hiba N.Rajha và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về việc chiết tách các hợp chất phenolic, flavonoid, anthocyanin và tannin từ sản phẩm phụ của nho bằng phương pháp bề mặt Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các yếu tố như tỉ lệ nguyên liệu-dung môi, kích thước hạt, thời gian, nhiệt độ và hỗn hợp dung môi có ảnh hưởng lớn đến quá trình tối ưu hóa Kết quả cho thấy điều kiện chiết tách tối ưu là 93 phút ở nhiệt độ 94°C với dung môi 66% ethanol-nước, mang lại tổng phenolic 5,5g GAE/100 DM, flavonoid 5,4g GAE/100g DM, tổng anthocyanin 70,3mg/100g DM, nồng độ tannin 12,3g/l và khả năng chống oxy hóa đáng kể.
1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước về anthocyanin Ở Việt Nam, trong những năm gần đây cũng có rất nhiều công trình nghiên cứu về anthocyanin trong các loại rau quả, trái cây và một số ứng dụng trong công nghệ thực phẩm như:
Nghiên cứu của Huỳnh Thị Kim Cúc và các cộng sự chỉ ra rằng quả dâu chín chứa hàm lượng anthocyanin cao hơn quả chưa chín Ở nồng độ SO2 1100ppm và nhiệt độ 60°C, hàm lượng anthocyanin đạt mức tương đối cao Mặc dù chiết xuất bằng nước SO2 cho hàm lượng anthocyanin thấp hơn so với dung môi ethanol/nước (50/50), nhưng độ bền màu lại cao hơn Chất màu anthocyanin từ quả dâu có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm, chẳng hạn như làm kẹo cứng dâu.
Năm 2004, nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan và Lê Thị Lạc Quyên đã chỉ ra rằng hệ dung môi ethanol-nước-HCl mang lại hàm lượng anthocyanin cao nhất trong việc tách chất màu từ quả dâu Hội An, so với các hệ dung môi khác như methanol-nước-HCl, nước-HCl, nước-HCOOH và nước-CH3COOH.
Vào năm 2012, Nguyễn Thị Hiển và các cộng sự đã thực hiện nghiên cứu chiết tách anthocyanin từ đài hoa Hibiscus Sabdariffa để phát triển giấy chỉ thị phát hiện nhanh hàn the trong thực phẩm Kết quả cho thấy dung môi ethanol-nước-HCl (50:50, 1% HCl) với tỉ lệ 14ml dung môi/1g nguyên liệu và thời gian chiết 6 ngày là điều kiện tối ưu Hàm lượng anthocyanin trong nguyên liệu khô đạt 15.2%, trong khi nguyên liệu tươi chỉ là 1.06% Để sản xuất giấy chỉ thị, tỉ lệ pha loãng là 1g màu khô/400ml nước cất, thời gian ngâm tách dịch màu lên giấy là 120 giây và thời gian tiếp xúc của giấy với thực phẩm là 90 giây Giấy chỉ thị có khả năng phát hiện hàn the với ngưỡng tối thiểu là 40mg/1kg thực phẩm.
Ngoài ra, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để phân tích và chiết tách hàm lượng anthocyanin từ các loại rau quả như bụp dấm, tía tô, rau dền tía, sâm đại hành, dâu tầm, bắp cải tím, trà đỏ và vỏ cà tím (Huỳnh Thị Kim Cúc, 2004; Phạm Thị Thanh Nhàn, 2011).
Định hướng nghiên cứu
Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc chiết tách anthocyanin từ rau quả như dâu tây, rau dền, tía tô, bắp cải tím và nho, nhưng vẫn chưa chú trọng đến anthocyanin từ các loại hạt, đặc biệt là hạt đậu đen Đậu đen chứa hàm lượng anthocyanin cao, có thể được sử dụng làm chất màu thực phẩm thay thế cho các chất màu tổng hợp Hơn nữa, đậu đen dễ trồng, phát triển tốt và không yêu cầu kỹ thuật canh tác phức tạp, giúp tiết kiệm chi phí đầu tư Do đó, hạt đậu đen là một nguồn anthocyanin tự nhiên tiềm năng cần được nghiên cứu và khai thác tại Việt Nam.
Từ những nhận định trên, chúng tôi đưa ra định hướng nghiên cứu đề tài của mình như sau:
Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết tách anthocyanin từ đậu đen, bao gồm hệ dung môi, tỷ lệ dung môi và thời gian, nhằm lựa chọn điều kiện chiết tách tối ưu cho hiệu suất cao nhất.
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự thoái hóa chất màu anthocyanin từ đậu đen như nhiệt độ, thời gian, ánh sáng, pH…
Nghiên cứu ứng dụng anthocyanin từ đậu đen trong chế biến kẹo dẻo nhằm tạo màu sắc tự nhiên cho sản phẩm Việc sử dụng chất màu này không chỉ mang lại màu sắc hấp dẫn mà còn cung cấp hoạt tính sinh học, góp phần nâng cao giá trị dinh dưỡng của kẹo.
CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu
Hạt của loài Vinga unguiculata (L.) Walp ssp Cylindrica (L.) được sử dụng trong nghiên cứu này là loại hạt trắng lòng, có nguồn gốc từ Đà Lạt và đã được mua tại chợ Bắc Ninh, Quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh vào tháng 1 năm 2015.
- Ethanol (C2H5OH), methanol (CH3OH) (Chemsol, Việt Nam)
- Acid acetic (CH3COOH), acid formic (HCOOH), acid hydrochloric (HCl)
- Sodium acetate trihydrate (CH 3 COONa.3H 2 O), Potassium chloride (KCl), Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na 2 HPO 4 12H 2 O), Acid citric monohydrate (C 6 H 8 O 7 H 2 O)
- Gelatin, tinh mùi dâu, sirô bắp, đường, dầu ăn
- Máy quang phổ UV – Vis (Libra S32)
- Hệ thống cô quay chân không (Buchi)
- Cân phân tích 2 số lẻ, 4 số lẻ
- Máy đo màu Chroma Meter CR – 400 (Nhật Bản)
Phương pháp nghiên cứu
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu
2.2.2.1 Khảo sát một số chỉ tiêu của nguyên liệu đầu vào
Xác định độ ẩm, độ tro, hàm lượng protein, hàm lượng carbohydrate
Thí nghiệm 1: Xác định bước sóng hấp thụ cực đại
Khảo sát một số chỉ tiêu của nguyên liệu
- Xác định bước sóng hấp thu cực đại
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình trích ly
Xác định hàm lượng anthocyanin và hoạt tính chống oxy hóa
Khảo sát một số đặc tính của chất màu anthocyanin Ứng dụng chất màu anthocyanin trong chế biến kẹo dẻo
- Hệ dung môi: ethanol – nước – HCl, methanol – nước – HCl, nước – HCl, nước – acid acetic, nước – acid formic
- Tỷ lệ dung môi: 30, 40, 50, 60, 70, 80% ethanol
- Thời gian trích ly: 40, 60, 80, 100, 120 phút
- Ảnh hưởng của pH đến màu sắc anthocyanin
- Ảnh hưởng của quá trình gia nhiệt đến độ bền màu anthocyanin
- Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến độ bền màu anthocyanin
- Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến độ màu của sản phẩm
- Đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm
- Hàm lượng anthocyanin trong hạt đậu đen
- Khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH
- Tổng quan về cây đậu đen
- Thành phần hóa học của hạt đậu đen
- Tổng quan về hợp chất màu anthocyanin
- Một số phương pháp xác định anthocyanin
- Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về anthocyanin
Mục đích của nghiên cứu này là xác định bước sóng hấp thụ cực đại của chất màu anthocyanin chiết xuất từ hạt đậu đen, vì các nguyên liệu khác nhau sẽ có bước sóng hấp thụ khác nhau Việc này sẽ hỗ trợ cho các nghiên cứu liên quan đến anthocyanin.
Để thực hiện, bạn cần lấy dịch chiết màu anthocyanin và pha loãng với dung dịch đệm có pH = 1.0 Sau đó, quét phổ hấp thụ trong vùng khả kiến từ λ = 450 đến 700 nm bằng máy quang phổ.
UV – ViS để tìm bước sóng hấp thu cực đại (λmax) của anthocyanin chiết từ đậu đen
Thông số cần đo : Bước sóng hấp thụ cực đại (nm)
2.2.2.2 Quy trình trích ly chất màu anthocyanin từ hạt đậu đen
Hình 2.2 Quy trình trích ly anthocyanin
Rửa - nghiền Điều kiện khảo sát:
Hạt đậu đen sau khi mua về cần được rửa sạch để loại bỏ bụi bẩn và phơi khô Tiếp theo, hạt được nghiền nhỏ để giảm kích thước, giúp tăng cường khả năng trích ly anthocyanin từ hạt đậu đen.
Quá trình trích ly anthocyanin từ hạt đậu đen được thực hiện bằng cách nghiền hạt đậu và sau đó trích ly ở nhiệt độ 60 độ C trong một hệ dung môi trong khoảng thời gian thích hợp.
Sau khi trích ly màu anthocyanin từ hạt đậu đen, quá trình lọc được thực hiện bằng giấy lọc Tiếp theo, dịch màu này được ly tâm ở tốc độ 4500 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ hoàn toàn bã và cặn bẩn.
Sau khi ly tâm, dịch màu anthocyanin được cô quay chân không ở nhiệt độ 40°C để loại bỏ hoàn toàn dung môi và tạo ra cao màu anthocyanin.
2.2.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình trích ly anthocyanin từ đậu đen
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của hệ dung môi đến khả năng trích ly anthocyanin
Mỗi loại dung môi có khả năng chiết tách khác nhau, và hiện tại chưa có kết luận rõ ràng về loại dung môi nào là tối ưu nhất cho quy trình chiết tách.
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát tác động của hệ dung môi đến khả năng trích ly anthocyanin nhằm tìm ra hệ dung môi tối ưu nhất, có thể ứng dụng hiệu quả trong công nghệ thực phẩm.
Nghiên cứu ảnh hưởng của hệ dung môi đến khả năng trích ly anthocyanin từ hạt đậu đen được thực hiện với 5 loại dung môi khác nhau: ethanol-nước (1:1, 1% HCl), methanol-nước (1:1, 1% HCl), nước-HCl (1%), nước-acid acetic (5%) và nước-acid formic (5%) Trong thí nghiệm, 5g hạt đậu đen được nghiền và trích ly ở nhiệt độ 60°C trong 60 phút, với tỉ lệ dung môi-nguyên liệu là 10ml/1g và thực hiện một lần chiết Sau khi thu được dịch chiết, mẫu được lọc và ly tâm ở 4500 vòng/phút trong 15 phút để tách lấy dịch trong phục vụ cho việc phân tích.
Thông số cần đo : Hàm lượng anthocyanin (mg/100g nguyên liệu)
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi (ethanol – nước) đến khả năng trích ly anthocyanin
Mục đích : Khảo sát để lựa chọn tỷ lệ dung môi (ethanol – nước) cho khả năng trích ly tốt nhất
Nghiên cứu này tập trung vào ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol - nước đến khả năng trích ly anthocyanin từ hạt đậu đen Thí nghiệm được thực hiện với 6 tỷ lệ dung môi khác nhau: 30%, 40%, 50%, 60%, 70% và 80% ethanol 5g hạt đậu đen được nghiền và ngâm trong dung môi ở nhiệt độ 60°C trong 60 phút, với tỷ lệ dung môi - nguyên liệu là 10ml/1g và thực hiện một lần chiết Dịch chiết thu được sau đó được lọc và ly tâm để tách các thành phần.
4500 vòng trong 15 phút, tách lấy dịch trong đem phân tích
Thông số cần đo : Hàm lượng anthocyanin (mg/100g nguyên liệu)
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly anthocyanin
Mục đích : Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng anthocyanin thu được và lựa chọn ra nhiệt độ trích ly anthocyanin tốt nhất
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian trích ly đến khả năng trích ly anthocyanin từ hạt đậu đen được thực hiện qua 5 khoảng thời gian: 40, 60, 80, 100 và 120 phút Trong thí nghiệm, 5g hạt đậu đen được nghiền và tiến hành trích ly với hệ dung môi và tỷ lệ dung môi khác nhau, ở nhiệt độ 60°C, với tỷ lệ dung môi – nguyên liệu là 10ml/1g và thực hiện một lần chiết Dịch chiết thu được sẽ được lọc và ly tâm ở 4500 vòng/phút trong 15 phút để tách lấy dịch trong phục vụ cho phân tích.
Thông số cần đo : Hàm lượng anthocyanin (mg/100g nguyên liệu)
2.2.2.4 Xác định hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của anthocyanin trích từ hạt đậu đen
Thí nghiệm 5: Xác định hàm lượng anthocyanin
Mục đích : Xác định lượng anthocyanin có trong hạt đậu đen
Để tiến hành thí nghiệm, 5g hạt đậu đen được nghiền và trích ly trong điều kiện cụ thể Sử dụng hệ dung môi theo tỷ lệ ở thí nghiệm 2, thời gian trích ly theo thí nghiệm 4, và nhiệt độ trích ly là 60 độ C Tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu là 10ml/1g và thực hiện một lần chiết Dịch chiết thu được sẽ được lọc và ly tâm ở 4500 vòng trong 15 phút để tách lấy dịch trong phục vụ cho phân tích.
Thông số cần đo : Hàm lượng anthocyanin (mg/100g nguyên liệu)
Thí nghiệm 6: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa
Mục đích : Xác định khả năng chống oxy hóa của anthocyanin trích từ hạt đậu đen bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH
Cách tiến hành : Tiến hành khảo sát ở các mức nồng độ khác nhau là 100, 50, 25,
Mỗi nồng độ 10 àg/ml được thực hiện 3 lần để thu thập 3 giá trị phần trăm ức chế (I%) Trung bình của 3 giá trị này sẽ cho phép xác định phần trăm ức chế tương ứng với từng nồng độ khảo sát Từ đó, chúng ta có thể tính toán giá trị IC50, tức là nồng độ mẫu có khả năng ức chế 50%.
Thông số cần đo : Phần trăm ức chế (I%), giá trị IC50
2.2.2.5 Khảo sát một số đặc tính của màu anthocyanin trích từ đậu đen
Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến màu sắc anthocyanin
Mục đích : Quan sát màu sắc của anthocyanin ở các giá trị pH khác nhau và ảnh hưởng của pH đến độ hấp thụ và chỉ số thoái hóa (DI)
Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến màu sắc anthocyanin được thực hiện với 10 giá trị pH khác nhau (từ 1 đến 10) Chất màu anthocyanin được pha loãng trong dung dịch đệm citrate – phosphate, với pH dưới 3 được điều chỉnh bằng HCl và pH trên 7 bằng NaOH, trong ống nghiệm kín Sau 30 phút ổn định màu, mẫu được quét quang phổ trong khoảng 450÷700nm để xác định bước sóng hấp thu cực đại tương ứng với từng giá trị pH và đo độ hấp thụ tại bước sóng λ max và 420nm.
Thông số cần đo : Bước sóng hấp thu cực đại mới (nm), độ hấp thụ , giá trị DI
Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến độ bền màu anthocyanin
Mục đích : Đánh giá độ bền màu của anthocyanin đối với nhiệt độ và thời gian gia nhiệt
Cách tiến hành : Ảnh hưởng của nhiệt độ được nghiên cứu ở 3 nhiệt độ khác nhau là
Chất màu anthocyanin được pha loãng với dung dịch đệm citrate – phosphate (pH = 3 (± 0.05)) và chứa trong ống nghiệm thủy tinh kín, bọc giấy bạc Mẫu được ngâm trong bể điều nhiệt ở ba nhiệt độ 95 0 C, 75 0 C và 55 0 C trong khoảng thời gian khác nhau Sau khi làm lạnh, mẫu được đo độ hấp thụ ở bước sóng λmax và 420nm sau 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 giờ gia nhiệt.
Thông số cần đo : Phần trăm màu còn lại (%), giá trị DI
Thí nghiệm 9: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến độ bền màu anthocyanin
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Một số chỉ tiêu hóa lý của hạt đậu đen
3.1.1 Kết quả xác định một số chỉ tiêu của hạt đậu đen
Kết quả xác định độ ẩm, độ tro, hàm lượng protein và carbohydrate của hạt đậu đen được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1 Bảng kết quả xác định một số chỉ tiêu của nguyên liệu hạt đậu đen
Chỉ tiêu Hàm lượng Độ ẩm (%) Độ tro (%) Protein (%) Carbohydrate (%)
Hạt đậu đen có độ ẩm trung bình là 8.5%, độ tro 3.54%, với hàm lượng protein và carbohydrate lần lượt là 19.6% và 59.8% So với nghiên cứu của Thangadurai (2005), hạt đậu đen có độ ẩm thấp hơn (5.7%) và hàm lượng protein cao hơn (29%) Đỗ Tất Lợi (2004) ghi nhận độ tro là 2.8%, protein 24.2% và carbohydrate 53.3% Sự khác biệt trong các kết quả này có thể do điều kiện trồng trọt, đất đai và chế độ phân bón khác nhau, cũng như quy trình xử lý sau thu hoạch như phơi hoặc sấy, ảnh hưởng đến độ ẩm và thành phần dinh dưỡng của hạt.
3.1.2 Kết quả xác định bước sóng hấp thụ cực đại
Chất màu anthocyanin được chiết xuất từ đậu đen có bước sóng hấp thụ cực đại λmax = 520nm, nằm trong khoảng hấp thụ của anthocyanin từ 465 đến 550nm (Prior &).
Theo nghiên cứu của Wu (2006), λmax của anthocyanin từ khoai lang tím đạt 529nm (Thái Thị Ánh Ngọc, 2011), trong khi đó, anthocyanin từ quả sim có λmax là 513nm (Nguyễn Thị Lệ Uyên).
2011), bắp cải tím là 523nm (Huỳnh Thị Kim Cúc, 2004)…
Các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình trích ly anthocyanin từ hạt đậu đen
3.2.1 Ảnh hưởng của hệ dung môi đến hàm lượng anthocyanin trích ly từ hạt đậu đen
Kết quả ảnh hưởng của hệ dung môi đến hàm lượng anthocyanin được thể hiện trong bảng 3.2 và hình 3.1
Bảng 3.2 Kết quả hàm lượng anthocyanin trích ly trong các hệ dung môi khác nhau
Hệ dung môi Hàm lượng anthocyanin (mg/100g)
Các số liệu thống kê cho thấy giá trị trung bình là 109.34 ± 0.76 d, 111.73 ± 2.48 d, 99.89 ± 0.32 c, 71.47 ± 1.94 a và 76.09 ± 1.48 b Các nghiệm thức có cùng ký tự theo cột dọc không khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa 5%.
Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của hệ dung môi đến hàm lượng anthocyanin
Kết quả từ bảng 3.2 và hình 3.1 cho thấy khả năng chiết tách của methanol – nước (111.73mg/100g) cao hơn so với ethanol – nước (109.34mg/100g), nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê, đồng thời cao hơn hệ dung môi nước – HCl (99.89mg/100g) Anthocyanin có các gốc hydrocarbon kị nước, chỉ tan tốt trong dung môi hữu cơ, nhưng lại có các nhóm chức polyphenol phân cực tan tốt trong dung môi phân cực Do đó, hệ dung môi để chiết tách anthocyanin cần bao gồm dung môi hữu cơ như ethanol hoặc methanol và một chất phân cực như nước Tuy nhiên, methanol là dung môi độc hại không thích hợp cho thực phẩm, trong khi ethanol ít độc hơn, phổ biến, rẻ tiền và dễ kiếm, vì vậy chúng tôi chọn hệ dung môi ethanol – nước để thực hiện quá trình chiết tách.
Nghiên cứu cho thấy việc bổ sung các loại acid khác nhau vào dung môi ảnh hưởng đáng kể đến khả năng trích ly anthocyanin Cụ thể, khi sử dụng HCl, hàm lượng anthocyanin thu được cao hơn so với acid formic và acid acetic, lần lượt là 99.89mg/100g, 76.09mg/100g, và 71.47mg/100g Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đó của Nguyễn Thị Lan và Lê Thị Lạc Quyên, cho thấy HCl cho khả năng chiết tách cao nhất với hàm lượng anthocyanin đạt 0.492%, tiếp theo là acid formic 0.452% và acid acetic 0.107% HCl, với tính axit mạnh, làm tăng tính phân cực của dung môi, hỗ trợ tốt cho việc chiết tách các chất phân cực, nhưng cần lưu ý chỉ sử dụng với nồng độ ≤ 1% để đảm bảo an toàn thực phẩm Do đó, chúng tôi đã chọn hệ dung môi ethanol – nước – HCl (1%) cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi (ethanol – nước) đến khả năng trích ly anthocyanin
Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi (ethanol – nước) đến hàm lượng anthocyanin trích ly từ hạt đậu đen được thể hiện trong bảng 3.3 và hình 3.2
Bảng 3.3 Kết quả hàm lượng anthocyanin theo tỷ lệ dung môi (mean ± SD, n = 3) a
% ethanol % Nước Tỷ lệ ethanol:nước Hàm lượng anthocyanin (mg/100g)
Các số liệu thống kê cho thấy các giá trị lần lượt là 81.46 ± 0.89 b, 94.4 ± 1.88 c, 123.49 ± 1.19 e, 117.85 ± 2.46 d, 82.25 ± 1.47 b và 66.64 ± 1.83 a Những nghiệm thức có cùng chữ số ký tự theo cột dọc không khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 5%.
Hình 3.2 Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi (ethanol – nước) đến hàm lượng anthocyanin
Kết quả từ bảng 3.3 và hình 3.2 cho thấy nồng độ ethanol 50% (1% HCl) mang lại hàm lượng anthocyanin cao nhất, đạt 123.49mg/100g Hàm lượng anthocyanin tăng dần khi nồng độ ethanol trong nước từ 30% đến 50%, nhưng giảm khi vượt quá 50% Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Chandrasekhar và Patil, trong đó nồng độ ethanol 50% cũng cho hàm lượng anthocyanin cao nhất trong bắp cải tím và củ cải đỏ, lần lượt là 387.6mg/l và 37.26mg/100ml Điều này có thể giải thích bởi sự giảm nồng độ nước trong môi trường chiết tách, khiến anthocyanin ưa nước dễ hòa tan hơn.
Nghiên cứu cho thấy rằng nước là yếu tố cần thiết để chiết tách các anthocyanin hydrophilic, trong khi ethanol tinh khiết không phải là dung môi phù hợp (Chandrasekhar, Madhusudhan, & Raghavarao, 2012b) Dựa trên kết quả này, chúng tôi đã chọn hệ dung môi ethanol – nước với tỷ lệ 1:1 và 1% HCl để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly anthocyanin
Kết quả ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng anthocyanin được thể hiện trong bảng 3.4 và hình 3.3
Bảng 3.4 Kết quả hàm lượng anthocyanin theo thời gian trích ly (mean ± SD, n = 3) a
Thời gian (phút) Hàm lượng anthocyanin (mg/100g)
Các số liệu thống kê cho thấy giá trị trung bình lần lượt là 87.49 ± 0.62 c, 89.28 ± 1.04 c, 96.06 ± 1.78 d, 72.65 ± 0.85 b, và 67.02 ± 0.8 a Các nghiệm thức có cùng ký tự trong cột dọc không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng anthocyanin
Dựa vào kết quả thực nghiệm, hàm lượng anthocyanin tăng dần từ 40 đến 80 phút, đạt giá trị cao nhất là 96.06mg/100g tại 80 phút Tuy nhiên, sau 80 phút, hàm lượng anthocyanin giảm mạnh do tác động của nhiệt độ 60°C làm phân hủy các phân tử anthocyanin Vì vậy, thời gian chiết được chọn là 80 phút cho các thí nghiệm tiếp theo.
Xác định hàm lượng anthocyanin trích từ hạt đậu đen và hoạt tính chống oxy hóa của chúng
3.3.1 Hàm lượng anthocyanin trích ly từ hạt đậu đen
Dựa trên các điều kiện chiết tách với hệ dung môi ethanol - nước tỉ lệ 1:1 và bổ sung 1% HCl, thời gian chiết là 80 phút, hàm lượng anthocyanin từ hạt đậu đen đã được xác định trong phòng thí nghiệm, như thể hiện trong bảng 3.5.
Bảng 3.5: Kết quả hàm lượng anthocyanin trích ly từ hạt đậu đen
Lần Hàm lượng anthocyanin (mg/100g)
Hàm lượng anthocyanin trong hạt đậu đen đạt 104.28 ± 2.13mg/100g, cho thấy hạt đậu đen chứa một lượng lớn chất màu này So với một số nguyên liệu khác, hàm lượng anthocyanin trong hạt đậu đen cao hơn đáng kể, như quả mâm xôi tím chỉ có 43.42mg/100g (Sun, Liao, Wang, Hu, & Chen, 2007), lúa mì màu tía với 49.13mg/100g (Hosseinian, Li, & Beta, 2008), và hoa trà Hibiscus sabdariffa đạt 86.1mg/100g.
(Xiaowei et al., 2014)…nhưng thấp hơn so với một số nguyên liệu như hoa trà Rosa rugosa là 117.9mg/100g, hoa trà Rosa chinensis là 110.1mg/100g (Xiaowei et al., 2014), lá
O triangularis là 195mg/100g lá (Alexandra Pazmio-Durán & Mónica Giusti, 2001)…
3.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa của anthocyanin trích ly từ hạt đậu đen
Mẫu cao anthocyanin và acid galic được đem thử hoạt tính chống oxy hóa và được thể hiện kết quả trong bảng 3.6
Bảng 3.6 Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của anthocyanin và acid galic (mean ±
Giá trị IC50 (àg/ml) được ghi nhận là 34.06 và 4.76 Các số liệu thống kê cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa giữa các hàng, trong khi các nghiệm thức có cùng chữ số ký tự ở hàng ngang không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Kết quả từ bảng 3.6 cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của anthocyanin chiết xuất từ hạt đậu đen tương đối mạnh, mặc dù yếu hơn so với acid galic, một chất chống oxy hóa mạnh điển hình Ở nồng độ 100 µg/ml, anthocyanin thể hiện khả năng ức chế DPPH mạnh nhất, đạt 89.44%, trong khi acid galic ức chế 88.15% So với nghiên cứu của Duan và các cộng sự năm 2007, anthocyanin chiết xuất từ Litchi chinenesis Sonn cho thấy khả năng ức chế DPPH gần như hoàn toàn ở cùng nồng độ.
Nghiên cứu năm 2007 cho thấy khi pha loãng anthocyanin đến nồng độ 10 µg/ml, hoạt tính chống oxy hóa của nó giảm đáng kể, chỉ còn khả năng ức chế 15.19% DPPH Trong khi đó, acid galic vẫn duy trì khả năng ức chế cao hơn nhiều, đạt 70.04% DPPH.
Ngoài ra, còn có thể nhận thấy khả năng chống oxy hóa của anthocyanin qua giá trị
Theo kết quả từ bảng 3.6, để đạt được khả năng ức chế 50% DPPH, anthocyanin cần được pha loãng đến nồng độ 34.06 µg/ml, trong khi acid galic chỉ cần nồng độ 4.76 µg/ml để có hiệu quả ức chế tương tự.
Nghiên cứu cho thấy anthocyanin trích từ hạt đậu đen có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, với khả năng ức chế 50% DPPH đạt được ở nồng độ 38 µg/ml So với báo cáo của Yang và các cộng sự năm 2010, nồng độ cần thiết để ức chế 50% DPPH từ hạt ngụ tôm là 48.5 ± 0.5 µg/ml và từ cựu ngụ tôm là 40.1 ± 0.8 µg/ml, cho thấy sự cải thiện đáng kể trong khả năng chống oxy hóa của anthocyanin từ hạt đậu đen.
Một số đặc tính của chất màu anthocyanin chiết từ hạt đậu đen
3.4.1 Ảnh hưởng của pH đến màu sắc của anthocyanin
Kết quả khảo sát sự thay đổi màu, giá trị λmax, độ hấp thụ và DI của anthocyanin tại
10 giá trị pH khác nhau được thể hiện trong hình 3.4, 3.5, 3.6 và bảng 3.7
Hình 3.4 Ảnh hưởng của giá trị pH khác nhau đến màu sắc của anthocyanin
Màu sắc của anthocyanin thay đổi theo pH môi trường, chuyển từ màu đỏ ở pH acid (1÷3) sang màu tím tại pH 6, và cuối cùng là màu xanh đen ở pH 10 Ở pH = 4, 5, anthocyanin nhạt dần và gần như không màu Nghiên cứu của Nguyễn Thị Phương Anh và Nguyễn Thị Lan (2007) cũng cho thấy sự chuyển màu này khi pH thay đổi từ acid sang bazơ Nguyên nhân của hiện tượng này là do ở pH thấp, anthocyanin tồn tại chủ yếu ở dạng cation flavylium, trong khi khi pH tăng, chúng chuyển sang dạng carbinol pseudobase và chalcone không màu, thể hiện quá trình hydrat hóa.
Trong dung dịch có pH cao, sự dịch chuyển H+ từ nhóm -OH dẫn đến việc mất proton cation flavylium, làm cho anthocyanin chuyển sang dạng anion với màu xanh (Guo & Xia, 2013) Màu tím xuất hiện khi cả hai dạng cation và anion đồng thời tồn tại trong dung dịch.
Bảng 3.7 Bảng kết quả λ max mới, độ hấp thụ ở bước sóng 520nm và DI theo giá trị pH
(mean ± SD, n = 3) a pH λmax (nm) Độ hấp thụ (A520) DI (A 420 /A 520 )
Các số liệu thống kê cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức trong cùng một cột, với mức ý nghĩa 5% Cụ thể, các giá trị trung bình được ghi nhận là: 0.275 ± 0.001 a, 0.284 ± 0.001 a, 0.354 ± 0.003 b, 0.644 ± 0.021 c, 1.013 ± 0.011 e, 1.208 ± 0.011 g, 0.953 ± 0.01 d, 0.947 ± 0.009 d, 1.069 ± 0.004 f, và 1.233 ± 0.003 g Những nghiệm thức có cùng ký tự trong cột dọc không khác biệt có ý nghĩa thống kê.
Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đến bước sóng hấp thụ cực đại λ max
Kết quả từ bảng 3.7 và hình 3.5 cho thấy rằng bước sóng hấp thụ cực đại của anthocyanin thay đổi sang bước sóng dài hơn khi pH tăng, đạt giá trị cao nhất tại pH = 8 (597nm) Đặc biệt, trong khoảng pH từ 6 đến 8, giá trị λmax tăng rõ rệt từ 549nm lên 597nm Tuy nhiên, khi pH vượt quá 8, bước sóng hấp thụ hầu như không thay đổi Nguyên nhân cho sự thay đổi này ở các giá trị pH acid là do sự gia tăng số lượng các nhóm thế oxy (hydroxyl hoặc methoxyl) trên vũng B của anthocyanidin.
1999) Kết quả này có tương quan với báo cáo trước đây của Carita cùng các cộng sự
Nghiên cứu của Cabrita, Fossen và Andersen (2000) đã chỉ ra rằng anthocyanin chứa aglycone với một nhóm hydroxyl trên vòng B có giá trị λ max gần như không thay đổi Ngược lại, anthocyanidin có hai hoặc ba hydroxyl trên vòng B cho thấy sự thay đổi đáng kể với hấp thụ cực đại ở bước sóng ngắn hơn trong khoảng pH 8.1 đến 8.6.
Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của pH đến độ hấp thụ (A) và giá trị DI (B)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Đ ộ hấp t hụ t ại 520 nm pH
Sự biến đổi của pH ảnh hưởng đáng kể đến độ hấp thụ màu sắc của anthocyanin, với giá trị hấp thụ đạt cực đại tại pH = 1 (0.884) và giảm xuống mức tối thiểu tại pH = 5 (0.053) Khi pH tăng từ 1 đến 5, độ hấp thụ giảm, nhưng sau đó lại tăng lên và giảm khi pH vượt quá 8 Kết quả này tương đồng với nghiên cứu trước đó của Cabrita và luận văn thạc sĩ của Nguyễn Thị Lệ Quyên Điều này cho thấy tại pH = 1, dạng flavylium chiếm ưu thế, trong khi ở pH = 5, các carbinol không màu dạng pseudobase xuất hiện Khi pH > 6, độ hấp thụ màu sắc tăng và đạt cực đại tại pH = 8, lúc này anthocyanin chủ yếu ở dạng anion quinonoidal.
Sự thay đổi pH ảnh hưởng đến chỉ số thoái hóa màu sắc (DI) của anthocyanin, với DI bao gồm ba yếu tố: tăng độ hấp thụ do nâu hóa, giảm độ hấp thụ do hình thành carbinol không màu, và chuyển đổi sang bước sóng dài hơn do cấu trúc anthocyanin không ổn định (Francis, 1982) Kết quả cho thấy, tại pH từ 1 đến 3, giá trị DI không thay đổi nhiều, nhưng khi pH vượt quá 3, giá trị DI tăng mạnh, đạt đỉnh tại pH 6 rồi giảm, và lại tăng khi pH trên 8 (hình 3.6B) Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Cevallos-Casals & Cisneros-Zevallos, cho thấy chỉ số D của các loại thực phẩm như khoai lang đỏ, ngô tím, cà rốt tím và nho đỏ đều tăng khi pH lớn hơn 3 (Cevallos-Casals & Cisneros-Zevallos, 2004).
3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian gia nhiệt đến độ bền màu anthocyanin
Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian gia nhiệt đến độ bền màu anthocyanin được thể hiện trong bảng 3.8 và hình 3.7
Bảng 3.8 Bảng kết quả % màu còn lại và giá trị DI ở các nhiệt độ gia nhiệt khác nhau (mean ± SD, n = 3) a
% màu còn lại Giá trị DI
Các giá trị thống kê được trình bày như sau: 0.35 ± 0.008 a, 0.358 ± 0.001 ab, 0.358 ± 0.006 ab, 0.363 ± 0.005 b, 0.358 ± 0.002 ab, 0.362 ± 0.001 b, và 0.362 ± 0.002 b Các số liệu này có ý nghĩa thống kê theo cột, với những nghiệm thức có cùng ký tự trong cột dọc không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian gia nhiệt đến % màu còn lại (A) và giá trị DI (B)
Kết quả từ bảng 3.8 và hình 3.7 cho thấy hàm lượng anthocyanin giảm khi gia nhiệt, với tốc độ phân hủy phụ thuộc vào nhiệt độ Cụ thể, ở nhiệt độ 55°C, hơn 80% anthocyanin vẫn được giữ lại sau 6 giờ, trong khi ở 95°C và 75°C, tốc độ phân hủy màu tăng đáng kể.
Nghiên cứu cho thấy anthocyanin bị thoái hóa mạnh sau 1 giờ gia nhiệt, với phần trăm màu còn lại lần lượt là 67.43% và 70.03%, cho thấy rằng màu anthocyanin bền hơn ở nhiệt độ thấp và tốc độ thoái hóa tăng nhanh khi nhiệt độ cao Điều này khẳng định nhận định của Markakis và Jurd rằng nhiệt độ tăng thì tốc độ phân hủy anthocyanin cũng tăng Tỷ lệ anthocyanin bị thoái hóa được thể hiện qua giá trị DI, với giá trị D tăng trong suốt thời gian gia nhiệt ở cả 3 nhiệt độ Cụ thể, ở 55°C và 75°C, giá trị D tăng nhẹ, trong khi ở 95°C, giá trị D tăng mạnh đạt 1.042 sau 6 giờ, cho thấy sự gia tăng màu nâu ở bước sóng 420nm và mức độ nâu hóa phụ thuộc vào nhiệt độ.
3.4.3 Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến độ bền màu màu anthocyanin
Kết quả ảnh hưởng của điều kiện bảo quản khác nhau đến độ bền màu anthocyanin được thể hiện trong bảng 3.9 và hình 3.8
Bảng 3.9 Bảng kết quả % màu còn lại và giá trị DI ở các điều kiện bảo quản khác nhau (mean ± SD, n = 3) a,b
% màu còn lại Giá trị DI Điều kiện 1 Điều kiện 2 Điều kiện 3 Điều kiện 1 Điều kiện 2 Điều kiện 3
Các số liệu thống kê cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức với các mức độ nhiệt độ và ánh sáng khác nhau Cụ thể, ở điều kiện 1 (nhiệt độ 10°C trong bóng tối), giá trị trung bình là 0.343 ± 0.001 Điều kiện 2 (nhiệt độ thường 34°C ± 4 trong bóng tối) cho giá trị 0.376 ± 0.001, trong khi điều kiện 3 (nhiệt độ thường 34°C ± 4 trong ánh sáng) có giá trị cao nhất là 1.471 ± 0.055 Các nghiệm thức có cùng ký tự theo cột dọc không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Biểu đồ trong Hình 3.8 thể hiện tác động của các điều kiện bảo quản khác nhau đến tỷ lệ phần trăm màu còn lại (A) và giá trị DI (B) Cụ thể, điều kiện 1 là bảo quản ở 10 độ C trong bóng tối, trong khi điều kiện 2 là ở nhiệt độ thường.
(34 0 C ± 4) trong bóng tối, điều kiện 3: nhiệt độ thường (34 0 C ± 4) trong ánh sáng
Kết quả từ bảng 3.9 và hình 3.8 cho thấy hàm lượng màu anthocyanin giảm trong suốt thời gian bảo quản, và sự giảm này phụ thuộc vào điều kiện bảo quản như nhiệt độ và ánh sáng Khi bảo quản ở nhiệt độ thấp và trong bóng tối, tốc độ phân hủy màu anthocyanin chậm hơn so với bảo quản ở nhiệt độ cao và trong ánh sáng Cụ thể, ở điều kiện bảo quản 10°C trong bóng tối, hơn 60% màu anthocyanin được giữ lại, trong khi ở nhiệt độ thường trong bóng tối chỉ còn 18.04% màu.
A Điều kiện 1 Điều kiện 2 Điều kiện 3
B Điều kiện 1 Điều kiện 2 Điều kiện 3
Sau 40 ngày bảo quản, chỉ còn 47% anthocyanin được giữ lại, khẳng định rằng nhiệt độ cao làm tăng tốc độ phân hủy màu Bảo quản ở nhiệt độ thường trong ánh sáng dẫn đến sự thoái hóa màu anthocyanin nhanh hơn, với chỉ 15% màu còn lại sau 40 ngày Ánh sáng được xác định là yếu tố chính tăng tốc độ phân hủy, như đã được báo cáo bởi Ochoa và Bakowska Sự giảm phần trăm màu tương ứng với sự tăng giá trị DI; ở nhiệt độ thấp 10°C, giá trị DI chỉ tăng nhẹ, trong khi ở nhiệt độ thường, giá trị DI tăng mạnh, đạt 1.355 trong bóng tối và 1.471 trong ánh sáng Điều này cho thấy nhiệt độ cao và ánh sáng làm gia tăng sự nâu hóa và giảm độ hấp thụ màu sắc, dẫn đến tăng giá trị DI.
Ứng dụng bổ sung chất màu anthocyanin vào trong chế biến kẹo dẻo
3.5.1 Sản phẩm kẹo dẻo màu anthocyanin
Hình 3.9: Sản phẩm kẹo dẻo màu anthocyanin
Sản phẩm được chiết xuất từ các hợp chất tự nhiên như anthocyanin, acid citric và tinh chất dâu, mang lại màu đỏ tươi sáng, hương vị thơm ngon và vị chua đặc trưng Sự kết hợp hoàn hảo giữa anthocyanin và hương dâu tạo nên một sản phẩm nổi bật về màu sắc và hương vị.
Sản phẩm được làm hoàn toàn từ nguyên liệu tự nhiên như đường, sirô bắp, gelatin, acid citric, tinh mùi dâu và anthocyanin từ hạt đậu đen, không chứa hợp chất tổng hợp, đảm bảo an toàn cho sức khỏe Ngoài việc cung cấp năng lượng, sản phẩm còn chứa anthocyanin, một chất chống oxy hóa mạnh mẽ, có lợi cho sức khỏe con người.
Sản phẩm được tạo màu từ anthocyanin, một chất màu tự nhiên, nên màu sắc của sản phẩm có thể dễ dàng phai theo thời gian Để giữ màu sắc lâu bền, sản phẩm cần được bảo quản ở nhiệt độ thấp và tránh tiếp xúc với không khí cũng như ánh sáng.
3.5.2 Đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm kẹo dẻo màu anthocyanin
Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan của sản phẩm kẹo dẻo màu anthocyanin được thể hiện trong hình 3.10
Biểu đồ trong Hình 3.10 thể hiện điểm thị hiếu trung bình của người tiêu dùng đối với sản phẩm kẹo dẻo màu anthocyanin, với thang điểm từ 1 (cực kỳ ghét) đến 9 (cực kỳ thích) Kết quả khảo sát được thực hiện trên 30 người tiêu dùng cho thấy sự đánh giá tổng quát về sản phẩm này.
Màu sắc Mùi Vị Cấu trúc Ưa thích chung Điểm 7.07 7.07 7.7 6.87 7.57
9 Điểm thị hiếu trung bình
Kết quả từ hình 3.10 cho thấy người tiêu dùng đánh giá cao sản phẩm kẹo dẻo màu anthocyanin với điểm ưa thích chung là 7.57 Cụ thể, màu sắc của sản phẩm nhận được điểm 7.07, cho thấy sự yêu thích của người thử Các yếu tố mùi, vị và cấu trúc cũng được đánh giá cao với các điểm lần lượt là 7.07, 7.7 và 6.87 Điều này chứng tỏ sản phẩm không chỉ đạt được yêu cầu về màu sắc, mùi vị và cấu trúc mà còn phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng Đặc biệt, sản phẩm hoàn toàn tự nhiên, không chứa chất phụ gia tổng hợp, mang lại lợi ích cho sức khỏe nhờ hạn chế hóa chất độc hại và cung cấp anthocyanin cùng các chất dinh dưỡng từ nguyên liệu tự nhiên.
3.5.3 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến độ màu của sản phẩm
Kẹo dẻo được bảo quản ở nhiệt độ thường, tránh tiếp xúc với không khí và ánh sáng trong 30 ngày để khảo sát độ bền màu Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.10.
Bảng 3.10 Bảng kết quả giá trị L * , H, C * của mẫu kẹo dẻo theo thời gian bảo quản
Các số liệu thống kê được trình bày như sau: 10.19 ± 0.47 a, 10.08 ± 1.18 a, 20.64 ± 1.58 b, 19.49 ± 0.92 b, 19.78 ± 3.52 b, 20.08 ± 1.38 b, và 18.46 ± 1.26 b Các nghiệm thức có cùng chữ số ký tự theo cột dọc không khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 5%.
Sau 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ thường, giá trị L* của kẹo tăng từ 34.84 lên 67.12, cho thấy độ đậm màu giảm và độ sáng của sản phẩm tăng lên Đồng thời, góc màu H cũng có sự thay đổi đáng kể.
Trong quá trình bảo quản, màu đỏ của sản phẩm kẹo giảm dần, trong khi màu vàng tăng lên, với góc màu H chuyển từ 13.5° đến 65.69° Điều này cho thấy màu đỏ ban đầu của kẹo chuyển dần sang màu đỏ nâu và gần như chuyển sang màu vàng nâu khi góc màu lớn hơn.
Sản phẩm kẹo dẻo chứa anthocyanin có xu hướng mất màu nhanh chóng khi được bảo quản ở nhiệt độ thường, dẫn đến giảm giá trị cảm quan và dinh dưỡng do mất chất chống oxi hóa Để bảo quản màu sắc tự nhiên của sản phẩm, cần giữ ở nhiệt độ thấp hơn và tránh tiếp xúc với không khí cũng như ánh sáng.
