TỔNG QUAN
Tổng quan về thực vật
1.1.1 Vị trí phân loại chi Smallanthus Mack ex Small
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (2009), chi Smallanthus Mack ex Small có vị trí phân loại được tóm tắt như sau [40]:
Chi: Smallanthus Mack ex Small
1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Smallanthus Mack ex Small
1.1.2.1 Đặc điểm hình thái chi Smallanthus Mack ex Small
Cây thảo và cây bụi là những loại cây sống lâu năm, có chiều cao từ 1,5 đến 3 mét Thân cây có hình trụ, mọc thẳng và rỗng, trong khi phần thân rễ phân nhánh không đều, thường tạo ra các củ dài với hình dạng trục.
Rễ củ có đường kính từ 30-80 mm và chiều dài khoảng 200 mm, phát triển từ một hệ thống thân chia nhỏ với các thân rễ Vỏ rễ củ có màu sắc đa dạng như nâu, hồng, tía, kem hoặc trắng ngà, mỏng chỉ từ 1-2 mm, và chứa các ống dẫn nhựa với tinh thể màu vàng bên trong.
Lá đơn mọc đối, với các lá trên hình trứng mác không có thùy, trong khi lá dưới thấp có hình trứng rộng, đỉnh chóp và gốc cắt cụt, mép có răng cưa Cuống lá có cánh xếp thành các rãnh chồng lên nhau, thường tụ ở gốc Kích thước trung bình của lá dài khoảng 17 cm.
Cụm hoa đầu nằm ở đầu nhánh, bao gồm 1-5 trục với mỗi trục có 3 đầu chùm và cuống hoa phủ nhiều lông tơ Hoa có màu vàng cam, với các hoa xung quanh tạo thành hình vòng tròn Cánh hoa hình lưỡi có 2 hoặc 3 răng, kích thước dài 12 mm và rộng 7 mm, trong khi các hoa nhỏ ở bên trong tạo nên sự đa dạng cho cụm hoa.
3 trong là hoa đĩa, dài khoảng 7 mm, có nhị Quả chưa trưởng thành màu tím, chuyển sang màu nâu thẫm hoặc đen khi trưởng thành [19]
1.1.2.2 Phân bố chi Smallanthus Mack ex Small
Chi Smallanthus Mack.ex Small có khoảng 23 loài, chủ yếu tập trung ở Trung, Nam và Bắc Mỹ, ở Trung Quốc có 2 loài [20] Phân bố của một số loài trong chi
Smallanthus Mack.ex Small [19] được tóm tắt ở bảng sau:
Bảng 1.1 Phân bố của một số loài trong chi Smallanthus Mack.ex Small
STT Tên khoa học Phân bố
Nam Mỹ, Trung Quốc (Phúc Kiến, Quý Châu, Hải Nam, Hồ Bắc, Hồ Nam, Sơn Đông, Đài Loan, Vân Nam và Chiết Giang) [20]
Bắc và Trung Mỹ, Trung Quốc (Giang
10 Smallanthus macroscyphus (Baker ex Martius) A Grau
Bolivia và tây bắc Argentina [19]
Mexico, Guatemala, Honduras, El Salvador, Nicaragua và Costa Rica
(Sch.Bip ex Klatt) H Robinson
Tổng quan về thành phần hoá học
1.2.1 Thành phần hóa học rễ củ Hoàng Sin Cô Đối với rễ củ Hoàng Sin Cô tươi, nước chiếm trên 70%, chỉ chứa 0,3- 3,7% protein 70-80% tổng hàm lượng các chất trong củ khô Hoàng Sin Cô là carbohydrat
[27] Những carbohydrat bao gồm fructose, glucose, sucrose và fructooligosaccharid (FOS) [9] Trong đó, FOS chiếm ưu thế (60%), chủ yếu là các oligomer (GF2-GF16),
3 FOS chính là 1-kestose, nystose, 1-β-D-fructofuranosylnystose (GF2-GF4) [27]
Các oligosaccharid có mặt trong Hoàng Sin Cô đã được xác định là β-(2→1) - fructooligosaccharid với tận cùng là sucrose (oligofructan loại inulin) [17]
Hình 1.1 Công thức một số đường trong rễ củ Hoàng Sin Cô
Các hợp chất phenolic cũng được tìm thấy trong rễ củ Hoàng Sin Cô:
+ Các phenyl propanoid: acid ferulic, acid chlorogenic, acid p-coumaric [37], acid caffeic và dẫn chất (acid 2,5-dicaffeoylaltraric, acid 3,5-dicaffeoylquinic, acid 2,4- or 3,5-dicaffeoylaltraric và acid 2,3,5- or 2,4,5-tricaffeoylaltraric) [39]
Rễ củ Hoàng Sin Cô không chỉ chứa carbohydrat dự trữ mà còn cung cấp một lượng nhỏ chất xơ, vitamin và khoáng chất Cụ thể, rễ tươi của Hoàng Sin Cô giàu vitamin C, B1, B2, B3, cùng với các tiền chất và dẫn xuất của vitamin A như retinol và caroten.
Hoàng Sin Cô chứa nhiều khoáng chất quan trọng như canxi, sắt, phốt pho, đồng, mangan và kẽm, được phân bố ở rễ củ, lá và thân Đặc biệt, trong số các acid amin, tryptophan có vai trò nổi bật.
6 thế, là tiền chất của melatonin và serotonin, được quan tâm bởi hoạt tính chống oxy hóa [44]
1.2.2 Thành phần hóa học lá Hoàng Sin Cô
Các flavonoid được phát hiện trong dịch chiết ethanol và nước từ lá Hoàng Sin Cô bao gồm luteolin-3’,7-di-O-glucosid, luteolin-7-O-glucosid, apigenin và luteolin Ngoài ra, tùy thuộc vào giống Hoàng Sin Cô, điều kiện môi trường, phương pháp và dung môi chiết, có thể xuất hiện một số hợp chất khác như myricetin, rutin, quercetin và kaempferol.
The Hoàng Sin Cô leaf contains several identified phenolic compounds, including chlorogenic acid, ferulic acid, protocatechuic acid, caffeic acid, and its derivatives, along with gallic acid and p-coumaric acid.
Sử dụng sắc ký GC-MS phân tích các thành phần trong tinh dầu lá Hoàng Sin
Cô chứa các thành phần chính: β-phellandren (26.3%), β-cubeben (17.7%), β- caryophyllen (14.0%) và β-bourbonen (10,2%) [24]
+ Các sesquiterpen lacton loại melampolid (có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm): sonchifolin, polymatin-B, uvedalin, enhydrin, fluanin, 8-β-tigloyloxymelampolid- 14-oic acid methyl ester, 8-β-methacryloyloxymelampolid-14-oic acid methyl ester
Nghiên cứu của Genta đã thành công trong việc phân lập và tinh chế enhydrin từ dịch chiết cloroform lá Hoàng Sin Cô, với kết quả cho thấy hàm lượng enhydrin đạt 94,1% và uvedalin 5,9% qua phân tích GC Đồng thời, Ying Yuan và cộng sự đã lần đầu tiên phân lập sesquiterpen lacton mới mang tên chlorodalin từ dịch chiết ethanol 60% lá Hoàng Sin Cô, cùng với bốn hợp chất đã được biết đến trước đó, bao gồm [2R-(1R*, 2α, 4α)] 4 - (2,4-dihydroxy-2,6,6-trimethylcyclohexyliden)-3-buten, adenin, benzyl-O-β-D-glucopyranosid, và (3S)-1,2,3,4-tetrahydro-β-carbolin-3-carboxylic acid.
Kakuta and colleagues identified that the methanol extract from Hoàng Sin Cô leaves contains ent-kaurenoic acid and related diterpenoid compounds, including 15-angeloyloxy ester, 18-angeloyloxy-ent-kaur-16-en-19-oic acid, and 15-angeloyloxy-ent-kauren-19-oic 16-epoxide.
Dou và cộng sự cũng đã xác định sự có mặt của các acid smallanthaditerpenic A,
B, C và D trong lá Hoàng Sin Cô [12]
1.2.3 Thành phần hóa học thân Hoàng Sin Cô
Theo các tài liệu đã công bố, thân Hoàng Sin Cô chủ yếu chứa các chất khoáng: canxi, sắt, đồng, mangan, kẽm, phốt pho [27]
Tên, công thức cấu tạo của một số hợp chất phenolic phân lập từ các bộ phận của cây Hoàng Sin Cô được trình bày trong bảng 1.2
Bảng 1.2 Một số hợp chất phenolic phân lập từ cây Hoàng Sin Cô
STT Tên Công thức cấu tạo Bộ phận
Tác dụng dược lý
- Hoạt tính gây độc tế bào
Nghiên cứu của Siriwan và cộng sự (2011) cho thấy các sesquiterpen (enhydrin, uvedalin và sonchifolin) từ Hoàng Sin Cô có khả năng gây độc tế bào qua quá trình apoptosis trên tế bào Hela Các tác giả chỉ ra rằng sesquiterpenic lacton trong Hoàng Sin Cô kích thích apoptosis bằng cách tăng cường hoạt hóa caspase-3/7 và ức chế hoạt động của protein NF-κB Đặc biệt, enhydrin có thể có cơ chế chống ung thư cổ tử cung khác biệt do hoạt tính caspase-3/7 thấp hơn so với uvedalin và sonchifolin, mặc dù nó lại có độc tính tế bào cao nhất.
Một nghiên cứu in vitro về độc tính tế bào của dịch chiết methanol lá Hoàng
Nghiên cứu cho thấy Sin Cô có hoạt tính gây độc tế bào đáng kể trên dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan người (HepG2) với IC50 là 58,2 ± 1,9 μg/ml Các thành phần hoạt tính trong dịch chiết methanol có thể là sesquiterpenoid loại melampolid, có khả năng ức chế sự tăng sinh và di chuyển của tế bào HepG2.
Dịch chiết Hoàng Sin Cô cho thấy tiềm năng đáng kể trong hoạt tính gây độc tế bào Nghiên cứu in vitro đã đánh giá khả năng gây độc tế bào của các dịch chiết n-hexan, methanol và dichloromethan từ lá Hoàng Sin Cô trên các dòng tế bào ung thư vú (MCF-7), ung thư trực tràng (HT-29) và nguyên bào sợi da người bình thường (HDFn) Kết quả cho thấy, khả năng sống sót của tế bào MCF-7 giảm đáng kể khi tiếp xúc với dịch chiết lá Hoàng Sin Cô, đặc biệt là dịch chiết dichloromethan Ngoài ra, dịch chiết dichloromethan cũng cho thấy hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với HT-29, với IC50 thấp hơn so với 5-fluorouracil Hiệu quả trên HDFn cho thấy ba loại dịch chiết từ lá Hoàng Sin Cô có tiềm năng trong nghiên cứu điều trị ung thư.
Cô có độc tính tế bào thấp hơn đáng kể so với đối thuốc đối chứng (colchicin, 5- fluorouracil, methotrexat, tamoxifen), trong đó dịch chiết dicloromethan ít độc tính nhất [29]
- Tác dụng hạ đường huyết
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Hoàng Sin Cô có tác dụng hạ đường huyết hiệu quả Trong một nghiên cứu trên động vật, chuột mắc tiểu đường do streptozotocin (STZ) cho thấy mức đường huyết giảm đáng kể khi được điều trị bằng trà từ lá và thân Hoàng Sin Cô 2% qua đường uống Sau 30 ngày điều trị, các chỉ số cơ thể như glucose huyết tương, nồng độ insulin trong huyết tương, trọng lượng cơ thể, trọng lượng thận và độ thanh thải creatinin đều được cải thiện Tác động hạ đường huyết có thể liên quan đến việc tăng số lượng tế bào β đảo tụy, kích thích tổng hợp và giải phóng insulin, cũng như ức chế phân hủy insulin Nghiên cứu của Honoré và cộng sự cho thấy lượng insulin tiết ra từ tế bào β đảo tụy ở chuột bị tiểu đường do STZ được điều trị bằng Hoàng Sin Cô cao hơn so với nhóm đối chứng.
Một nghiên cứu cho thấy dịch chiết ethanol 70% từ lá Hoàng Sin Cô giúp giảm đường huyết đáng kể ở chuột không mắc bệnh tiểu đường (28%) và chuột mắc tiểu đường do STZ (59%) Ngược lại, các dịch chiết khác như nước nóng và nước lạnh không có tác dụng hạ đường huyết, cho thấy phương pháp chiết và dung môi ảnh hưởng lớn đến hiệu quả sinh học của dược liệu Các hợp chất phenolic trong lá Hoàng Sin Cô, như quercetin, acid caffeic và acid chlorogenic, có khả năng hạ đường huyết và chống oxy hóa, giúp loại bỏ gốc tự do gây bệnh tiểu đường Nghiên cứu của Baroni và cộng sự đã phát hiện các hợp chất phenolic như acid caffeic, acid chlorogenic, acid ferulic và acid gallic trong dịch chiết ethanol 70%, góp phần giải thích khả năng chống oxy hóa và giảm đường huyết của Hoàng Sin Cô.
- Tác dụng hạ lipid máu
Nghiên cứu của Genta và cộng sự cho thấy việc tiêu thụ bột rễ củ khô Hoàng Sin Cô trong 4 tháng đã làm giảm đáng kể nồng độ triacylglycerol (TG) huyết thanh ở chuột bình thường Trong thí nghiệm, nhóm chuột đối chứng được cho ăn chế độ ăn tiêu chuẩn, trong khi nhóm chuột sử dụng Hoàng Sin Cô được bổ sung liều FOS 340 mg/kg/ngày và 6800 mg/kg/ngày Kết quả cho thấy mức TG giảm rõ rệt ở cả hai liều, mặc dù không có sự thay đổi ý nghĩa về cholesterol và glucose Phát hiện này cũng được xác nhận qua một nghiên cứu quan sát trên chuột mắc tiểu đường do STZ, cho thấy bột Hoàng Sin Cô có tác dụng giảm nồng độ đáng kể sau 90 ngày sử dụng.
Liều FOS thấp (340 mg/kg) có tác dụng hạ lipid máu hiệu quả hơn so với liều cao (6800 mg/kg) trong việc giảm TG huyết thanh và lipoprotein tỷ trọng rất thấp (VLDL).
Ngoài ra, Oliveira và công sự nhận thấy rằng nồng độ lipoprotein tỷ trọng cao
(HDL) và cholesterol toàn phần đã được cải thiện đáng kể ở những con chuột Wistar đực được cho ăn chiết xuất từ Hoàng Sin Cô trong 14 ngày [31]
Kết quả từ các nghiên cứu trên động vật thường thuyết phục hơn so với nghiên cứu trên người, trong đó một nghiên cứu cho thấy siro Hoàng Sin Cô có thể làm giảm đáng kể lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) ở phụ nữ tiền mãn kinh rối loạn lipid máu nhẹ Tuy nhiên, một nghiên cứu mù đôi có đối chứng với giả dược không ghi nhận sự giảm mức lipid huyết tương ở nhóm người cao tuổi được bổ sung bột Hoàng Sin Cô trong 9 tuần.
- Hoạt tính chống oxy hóa
Lá Hoàng Sin Cô chứa nhiều hợp chất phenolic, nổi bật với khả năng bắt giữ gốc tự do Các acid như acid protocatechuic, acid chlorogenic, acid caffeic và acid ferulic có trong chiết xuất từ lá này thể hiện hoạt động chống oxy hóa mạnh mẽ qua các thử nghiệm DPPH và khả năng ức chế xanthin oxidase, góp phần ngăn chặn quá trình oxy hóa lipid trong màng tế bào gan chuột.
Một nghiên cứu đã xác định tác dụng chống oxy hóa in vivo của dịch chiết nước và dịch chiết phân đoạn ethylacetat từ lá Hoàng Sin Cô Nghiên cứu cho thấy các dịch chiết này có khả năng loại bỏ gốc oxy hóa và bảo vệ tế bào gan chuột khỏi tổn thương oxy hóa do allyl alcohol và tert-butyl hydroperoxide Hơn nữa, dịch chiết Hoàng Sin Cô còn làm giảm sản xuất glucose ở gan, góp phần vào việc ngăn ngừa và điều trị bệnh tiểu đường.
Các hợp chất phenolic trong Hoàng Sin Cô, bao gồm acid phenolic, flavonoid và tanin, nổi bật với hoạt tính sinh học chống oxy hóa Một nghiên cứu đã được thực hiện để đánh giá tổng hàm lượng các hợp chất này.
Nghiên cứu về 12 chất phenolic và hoạt tính chống oxy hóa trong vỏ và ruột của Hoàng Sin Cô dạng bột cho thấy vỏ Hoàng Sin Cô chứa tổng hàm lượng hợp chất phenolic cao hơn so với ruột, cả ở dạng tự nhiên và dạng bột Hàm lượng phenolic trong bột vỏ Hoàng Sin Cô cũng vượt trội hơn so với lá và rễ củ, theo các nghiên cứu trước đó Hoạt tính chống oxy hóa, được đánh giá qua phương pháp DPPH và ABTS, cho thấy bột vỏ Hoàng Sin Cô có hoạt tính cao hơn đáng kể so với ruột tươi, chứng tỏ tiềm năng chống oxy hóa hứa hẹn của bột vỏ này.
Nghiên cứu cho thấy dịch chiết lá Hoàng Sin Cô có tác dụng chống viêm hiệu quả, nhờ vào sự hiện diện của sesquiterpen lacton ở nồng độ cao trong lá Các hợp chất chính như vedalin, enhydrin, sonchifolin và polimatin B đã được xác định, trong đó enhydrin và uvedalin nổi bật với khả năng ức chế yếu tố phiên mã NF-κB Dịch chiết này không chỉ giảm phù nề mà còn hạn chế di chuyển của bạch cầu trung tính đến các vị trí viêm nhiễm, đồng thời ức chế sản sinh TNF-α và PGE2.
- Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Lin và cộng sự đã phát hiện ra sáu sesquiterpen lacton loại melampolid, bao gồm 8β-tigloyloxymelampolid-14-oic acid methyl ester, 8β-methacryloyloxymelampolid-14-oic acid methyl ester, sonchifolin, uvedalin, enhydrin và fluctuanin, cho thấy tác dụng kháng khuẩn qua việc ức chế Bacillus subtilis Trong số các hợp chất này, fluctuanin có hoạt tính mạnh nhất, tiếp theo là uvedalin và enhydrin Ngoài ra, nghiên cứu cũng chỉ ra hoạt tính kháng nấm trên mầm bào tử.
Pyricularia oryzae kết quả cho thấy 8β-methacryloyloxymelampolid-14-oic acid methyl ester có hoạt tính mạnh nhất, fluctuanin có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhưng kháng nấm lại rất thấp [28]
Padla và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của acid ent-kaurenoic, một hợp chất được chiết xuất từ lá Hoàng Sin Cô bằng dung môi dichloromethan Kết quả cho thấy acid ent-kaurenoic có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn gram dương, bao gồm Staphylococcus aureus và Staphylococcus epidermidis.
Tác dụng không mong muốn
Nghiên cứu của Genta và cộng sự cho thấy khi sử dụng siro Hoàng Sin Cô với liều 0,29 g FOS/kg/ngày trên phụ nữ tiền mãn kinh béo phì và rối loạn lipid máu nhẹ, các tác dụng phụ như tiêu chảy, đầy hơi, buồn nôn và chướng bụng đã xảy ra Tuy nhiên, những triệu chứng này đã biến mất khi giảm liều xuống 0,14 g FOS/kg/ngày.
Hai trường hợp nghiêm trọng liên quan đến tác dụng phụ của Hoàng Sin Cô đã được ghi nhận Trường hợp đầu tiên là một phụ nữ 55 tuổi bị sốc phản vệ với triệu chứng ngất và nổi mày đay toàn thân chỉ trong 5 phút sau khi sử dụng củ Hoàng Sin Cô, kèm theo phản ứng dương tính với test dưới da dịch chiết Hoàng Sin Cô Đây là trường hợp đầu tiên được báo cáo về sốc phản vệ sau khi tiêu thụ củ này Trường hợp thứ hai là một nghiên cứu trên chuột cho thấy tổn thương thận phát triển sau khi sử dụng dịch chiết lá Hoàng Sin Cô trong 90 ngày, với mức creatinin tăng cao và phân tích mô học cho thấy tổn thương nghiêm trọng, bao gồm thoái hóa cầu thận và lắng đọng protein miễn dịch ở ống thận.
Sau 28 ngày sử dụng Hoàng Sin Cô, các chỉ số chức năng gan ở chuột không cho thấy sự khác biệt đáng kể, cho thấy rằng việc bổ sung Hoàng Sin Cô không gây độc tính cho gan Những phát hiện này nhất quán với một nghiên cứu trước đó về bột Hoàng Sin Cô.
Sin Cô ( FOS liều 340 mg/kg và 6800 mg/kg) ở chuột trong 4 tháng, các chỉ số AST, ALT và khối lượng gan không thay đổi đáng kể [14].
Công dụng, cách dùng
Công dụng của sản phẩm bao gồm khả năng điều chỉnh lượng đường trong máu, ngăn ngừa tiểu đường, giảm cholesterol xấu, hỗ trợ giảm cân, hạ huyết áp, chống tích tụ chất béo trong gan, nhuận tràng và tăng cường hệ miễn dịch.
Ngày dùng 50-100 g củ tươi (ăn sống), 5-50 g dạng bột khô, dùng riêng hay phối hợp với các vị thuốc khác [4]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng và phương tiện nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là mẫu cây tươi mang đầy đủ cả thân, lá, hoa và củ được thu hái tại xã Y Tý, huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai vào tháng 10 năm 2020 Sau khi thu hái, một phần lá và thân được ngâm trong ethanol 50% để nghiên cứu đặc điểm hiển vi Một phần trên mặt đất (thân, lá và hoa) được ép thành tiêu bản khô để nghiên cứu đặc điểm hình thái và lưu mẫu Củ đã được gọt vỏ và thái mỏng, thân cắt nhỏ, tách riêng lá và hoa; sau đó mang sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 60ºC, bảo quản ở túi nilon sạch kín, để nơi khô mát để sử dụng làm nghiên cứu đặc điểm bột và thành phần hóa học
Tiêu bản mẫu nghiên cứu đã được sấy khô, ép và hiện đang được lưu trữ tại Bảo tàng Thực vật thuộc Khoa Sinh Học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Hóa chất và dung môi dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích DĐVN V gồm có:
- Các dung môi hữu cơ : ethanol 96%, methanol; cloroform; ethyl acetat; propanol, toluen, acid formic
- Các chất tẩy – nhuộm tiêu bản: Nước Javen, acid acetic 5%, đỏ son phèn, xanh methylen
- Các thuốc thử cho phản ứng định tính và định lượng: TT Bouchardat, TT Mayer,
TT Dragendorff, TT Diazo, FeCl3 5%, NaOH 10%, HCl, H2SO4 đặc, TT Folin- Ciocalteu, TT NP/PEG …
- Các chất đối chiếu: acid gallic, acid caffeic, luteolin được mua từ Biopurify Phytochemicals (Trung Quốc), độ tinh khiết 98 %
- Dụng cụ thuỷ tinh: pipet, bình định mức, ống nghiệm, ống đong, phễu, bình gạn, cốc có mỏ…
- Cân phân tích AND GR-200
- Cân xác định hàm ẩm Ohaus
- Bể siêu âm Daihan Scientific
- Kính hiển vi Leica DM 100
- Máy cất quay chân không Heidolph Laborota 4000 efficient
- Máy ly tâm Centrifuge Harmonic Series
Hệ thống thiết bị SKLM hiệu năng cao từ CAMAG, Thụy Sĩ, bao gồm hệ thống chấm Linomat 5, bình triển khai sắc ký đôi và hệ thống chụp ảnh sắc ký TLC visualizer, mang đến giải pháp tối ưu cho các ứng dụng phân tích sắc ký.
- Bản mỏng Silicagel 60 F254 của Merk (Đức) tráng sẵn.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật
- Mô tả đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu
- Mô tả đặc điểm bột và vi phẫu của mẫu nghiên cứu
2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học
- Định tính sơ bộ các nhóm chất trong Hoàng Sin Cô bằng phản ứng hóa học với các thuốc thử chung của từng nhóm
Định tính bằng sắc ký lớp mỏng được thực hiện để phân tích các bộ phận khác nhau của cây Hoàng Sin Cô trên cùng một bản mỏng Quá trình này sử dụng một số chất đối chiếu nhằm so sánh thành phần hóa học và xác định sự hiện diện của các chất trong các mẫu nghiên cứu Kết quả được dựa trên giá trị Rf và màu sắc của các vết trước và sau khi phun thuốc thử, trong các điều kiện quan sát khác nhau.
- Định lượng polyphenol toàn phần trong dược liệu bằng phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật Đặc điểm hình thái thực vật và giám định tên khoa học
Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu cây thuốc là bước đầu tiên quan trọng Việc đối chiếu các đặc điểm của cây với tài liệu có sẵn, cùng với sự tư vấn từ các chuyên gia, giúp xác định chính xác tên khoa học của mẫu nghiên cứu Bên cạnh đó, việc tìm hiểu đặc điểm cấu tạo giải phẫu thực vật cũng đóng vai trò quan trọng trong việc phân tích và nhận diện cây thuốc.
Vi phẫu được thực hiện bằng phương pháp cắt trực tiếp và nhuộm kép Mẫu dược liệu được ngâm mềm và cắt bằng dao lam, chọn những lát cắt mỏng và nguyên vẹn Sau đó, mẫu được ngâm trong nước javen hoặc dung dịch cloramin B để tẩy trắng, và cuối cùng rửa sạch nhiều lần bằng nước.
Sau khi ngâm mẫu trong acid acetic 5% trong 15 phút và rửa lại bằng nước, tiến hành nhuộm vi phẫu bằng xanh methylen 1% pha loãng với nước trong 20 phút, sau đó rửa lại bằng nước Tiếp theo, nhuộm bằng đỏ son phèn trong khoảng 30 phút và rửa lại bằng nước Cuối cùng, lên tiêu bản và soi dưới kính hiển vi quang học để chụp ảnh và mô tả đặc điểm vi phẫu.
[2], [5] Đặc điểm bột dược liệu
Sau khi thu hái, mẫu dược liệu được phơi, sấy khô và nghiền thành bột thô, sau đó rây qua lưới 150 Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại x10 và x40 để xác định đặc điểm của bột, đồng thời chụp ảnh để mô tả các đặc điểm này.
2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học
2.3.2.1 Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học Định tính các nhóm chất trong củ Hoàng Sin Cô bằng các thuốc thử thường quy [2]
Để tiến hành chiết xuất dược liệu, cân khoảng 1 g dược liệu và cho vào bình nón 50 ml có nút mài Thêm 10 ml dung dịch H2SO4 1N, đun sôi, sau đó để nguội và lọc lấy dịch lọc Tiếp theo, cho dịch lọc vào bình gạn 50 ml và kiềm hóa bằng dung dịch amoniac 1N đến đạt pH mong muốn.
= 9-10 (thử bằng chỉ thị màu vạn năng) Lắc với cloroform 2 lần (lần 1 x 10 ml, lần
2 x 5 ml), gạn lấy lớp cloroform Gộp lấy dịch chiết cloroform, lắc dịch chiết với
H2SO4 1N (2 lần x 5 ml), gạn lấy dịch chiết acid, chia dịch chiết này vào 3 ống nghiệm
- Ống 1: Nhỏ 2 - 3 giọt TT Mayer Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng
- Ống 2: Nhỏ 2 - 3 giọt TT Dragendorff Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa da cam
- Ống 3 : Nhỏ 2- 3 giọt TT Bouchardat Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa nâu đỏ
Để chuẩn bị dịch chiết từ dược liệu, cân khoảng 1 g bột dược liệu cho vào bình nón 50 ml, thêm 20 ml ethanol 30% Đun cách thủy trong 5 phút, sau đó lọc nóng qua bông Dịch chiết thu được cho vào cốc có mỏ và bốc hơi dung môi trên cách thủy cho đến khi còn khoảng 5 ml Dịch chiết này sẽ được sử dụng cho các phản ứng hóa học.
Lấy 10 giọt dịch chiết trên cho chảy nhỏ giọt cho vào ống nghiệm lớn đã có sẵn
Để kiểm tra sự hiện diện của saponin trong dược liệu, cho 5 ml nước vào ống nghiệm, dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều đứng trong 1 phút (khoảng 30 lần) Sau đó, để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt; nếu bọt vẫn còn bền vững sau 15 phút, có thể kết luận sơ bộ rằng dược liệu chứa saponin.
Lấy 3 ml dịch chiết ở trên cho vào 1 chén sứ, cô cách thủy đến cắn, để nguội Hòa tan cắn này bằng hỗn hợp gồm 1 ml anhydrid acetic và 1 ml cloroform, lọc nhanh qua bông lấy dịch trong cho vào 1 ống nghiệm khô Để nghiêng ống nghiệm, dùng pipet hút khoảng 1 ml acid sulfuric đậm đặc cho chảy nhẹ nhàng dọc theo thành ống nghiệm, không lắc ống nghiệm
Khi có phản ứng dương tính, mặt ngăn cách giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu nâu đỏ, đỏ tím hoặc tím Lớp chất lỏng phía trên thường có màu xanh lá, xanh rêu hoặc nâu đỏ.
Để chuẩn bị dược liệu, cân 2 g bột dược liệu và cho vào bình nón 100 ml Thêm 40 ml nước cất và đun sôi trong 2 phút Sau đó, lọc qua giấy lọc gấp nếp vào bình gạn và để nguội Tiếp theo, thêm 10 ml ethyl acetat, lắc đều và để yên cho tách lớp Gạn lấy lớp ethyl acetat vào cốc có mỏ và cô cách thủy đến cặn Cuối cùng, hòa tan cặn bằng 10 ml ethanol 90.
% thu được dịch chiết để làm các phản ứng hóa học
Cho 1 ml vào một ống nghiệm, thêm khoảng 10 mg bột magnesi kim loại, thêm 2-3 giọt HCl đặc, lắc đều, đun cách thủy 5 phút Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ
- Phản ứng với hơi amoniac (NH 4 OH):
Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết lên một tờ giấy lọc, sấy nhẹ đến khô Hơ lên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nắp Phản ứng dương tính khi thấy màu vàng đậm dần lên
- Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%:
Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl 3 5% Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa màu xanh đen
- Phản ứng với dung dịch kiềm:
Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 3-5 giọt dung dịch NaOH 10% sẽ xuất hiện kết tủa màu vàng Thêm khoảng 1-2 ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch được tăng thêm
- Phản ứng với thuốc thử Diazo
Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (NaOH,
KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha, lắc đều sẽ xuất hiện màu đỏ
Để tiến hành phân tích dược liệu, cần chuẩn bị 2 g bột dược liệu cho vào bình nón 50 ml Tiếp theo, thêm 10 ml ethanol 90% và đun cách thủy sôi trong khoảng 3-5 phút Sau đó, lọc nóng qua giấy lọc và thu được dịch để thực hiện các phản ứng định tính.
- Phản ứng mở, đóng vòng lacton:
Trong thí nghiệm, cho vào hai ống nghiệm mỗi ống 2 ml dịch chiết Ở ống 1, thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% và để ống 2 yên Sau đó, đun sôi cả hai ống nghiệm và để nguội Kết quả quan sát cho thấy ống 1 xuất hiện tủa đục, trong khi ống 2 vẫn trong suốt.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất Lắc đều thấy: Ống 1: Trong suốt Ống 2: Xuất hiện tủa đục
Thêm vào ống 1 vài giọt dung dịch HCl đặc, ống 1 sẽ đục trở lại như ống 2 (phản ứng dương tính)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu đặc điểm thực vật
3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật
Cây thảo là loại cây sống lâu năm, có thân cao từ 1-3 m, với thân thẳng hình trụ và rỗng ở giữa, bề mặt có lông Lá cây đơn, mọc đối, mỏng và có lông ở cả hai mặt, với cuống lá dài từ 2.5-5 cm Gốc lá có hình mác và ngọn lá nhọn, phiến lá non có hình trứng với kích thước khoảng 7,5 x 5 cm, trong khi phiến lá già có hình tam giác hoặc hình trứng rộng.
Cây có kích thước lá 10 x 10 cm, với gân lá hình chân vịt và mép lá có răng cưa to, không đều, hướng lên và hơi nhọn Rễ của cây phân nhánh không đều, hình thành các củ có hình trụ; củ chưa trưởng thành có màu tím, trong khi củ trưởng thành có màu vàng nâu hoặc nâu thẫm.
Cụm hoa ngù đầu gồm 7-8 cụm hoa đầu mọc ở ngọn cây, với đường kính mỗi cụm hoa từ 1-1,5 cm và cuống hoa dài 4-8 cm, phủ lông tơ Tổng bao lá bắc có 2 hàng lá bắc xếp kết hợp, hình bầu dục thuôn nhọn, dài 8 mm và rộng 4 mm, mặt ngoài cũng phủ lông tơ Cụm hoa có màu vàng hoặc vàng cam, gồm hai loại hoa: hoa cái xếp thành vòng bên ngoài và hoa đực ở trong Hoa cái có hình lưỡi, dài 5-6 mm, rộng 2 mm, với mặt ngoài tràng hoa có lông Đầu nhụy hình thuôn dài, màu vàng cam đậm, có rãnh ở giữa Hoa đực hình ống, tràng hoa dài 4 mm, rộng 1 mm, với 5 thùy ở đỉnh và bộ nhị gồm 6 nhị, bao phấn dài 1 mm, đính gốc.
Hình 3.1 Mẫu tiêu bản Hoàng Sin Cô
Hình 3.2 Đặc điểm hoa Hoàng Sin Cô
1,2,3- Cụm hoa; 4- Lá bắc, Hoa cái; 5, 6(a)- Hoa cái; 6 (b)- Hoa đực;
Dựa trên các đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu và đối chiếu với tài liệu phân loại thực vật như thực vật chí Trung Quốc, cùng với sự tư vấn của các chuyên gia, mẫu nghiên cứu được xác định là Smallanthus sonchifolius (Poepp.) H Rob., thuộc họ Cúc (Asteraceae).
Vi phẫu thân Hoàng Sin Cô
Vi phẫu cắt ngang hình tròn cho thấy lớp biểu bì bên ngoài gồm tế bào hình chữ nhật kích thước không đồng nhất, với bề mặt chứa long che chở đa bào và một dãy tế bào dài Dưới lớp biểu bì là mô dày với 7-10 lớp tế bào hình bầu dục có vách dày ở góc Mô mềm vỏ gồm 4-6 lớp tế bào tròn hoặc đa giác gần tròn, kích thước không đều Trụ bì hóa sợi tạo thành cụm không đồng nhất trên đầu các bó libe gỗ, với tế bào hình đa xác, vách dày, xếp khít nhau Libe và gỗ tạo thành các bó rời có kích thước khác nhau, xen kẽ với khoảng gian bó Libe được sắp xếp thành cụm trên bó gỗ, với libe cấp 2 gồm tế bào hình tròn nhỏ, không đều, xếp lộn xộn, trong khi tế bào hình đa xác xếp theo hướng xuyên tâm; tầng sinh libe gỗ nằm giữa libe cấp 2 và gỗ cấp 2.
Gỗ cấp 2 có đặc điểm là các mạch gỗ không đều, được sắp xếp thành từng dãy, với mô mềm tế bào hình chữ nhật hoặc đa giác, vách hóa gỗ xếp khít nhau Ngược lại, gỗ cấp 1 có mạch gỗ được xếp thành từng bó, mỗi bó gồm 2-5 mạch gỗ không đều, phân hóa ly tâm, và mô mềm gỗ tế bào hình tròn Khoảng gian bó chứa từ 2-10 dãy tế bào hình chữ nhật xếp xuyên tâm, khít nhau, trong khi mô mềm ruột đạo chiếm một vùng rộng, có hình tròn hoặc bầu dục, kích thước không đều và xếp chừa những đạo nhỏ.
Vi phẫu lá Hoàng Sin Cô
Gân lá có cấu trúc vi phẫu cắt ngang với mặt trên lõm hình chữ V và mặt dưới lồi tròn Biểu bì gồm một hàng tế bào hình tròn hoặc chữ nhật, với nhiều lông che chở được xếp thành hàng dọc, đầu nhọn từ 2-8 tế bào Lông tiết ít hơn, thuộc loại đa bào với chân dài hoặc ngắn và đầu hình tròn Dưới lớp biểu bì là mô dày gồm 3-9 lớp tế bào hình đa giác, có vách dày ở góc Mô mềm có các tế bào hình đa giác hoặc gần tròn, không đều, với vách uốn lượn, tạo thành những khoảng trống nhỏ Các bó libe gỗ nằm thành cụm, trong đó libe hình cung bao phía dưới và bó gỗ ở trên, bao gồm các mạch gỗ nhỏ với kích thước không đều Mô dày dưới có 5-7 lớp tế bào không đều, với vách dày ở góc, tạo thành một cung liên tục.
Phiến lá có cấu trúc gồm biểu bì với lớp tế bào hình đa giác kích thước không đồng nhất, cùng với lông che chở đa bào dài từ 2-4 tế bào Mô giậu bao gồm hai lớp tế bào dưới biểu bì trên, với tế bào hình chữ nhật thuôn dài, vách mỏng và xếp khít nhau Mô mềm khuyết có tế bào hình đa giác không đều Bó libe và gỗ được sắp xếp với gỗ ở trên và libe ở dưới, tạo hình bầu dục, trong khi mạch dẫn nằm ở giữa phiến lá.
1- Lông che chở; 2- Biểu bì; 3- Mô dày; 4- Mô mềm vỏ ngoài; 5- Mô cứng;
6- Libe cấp 2; 7- Gỗ cấp 2; 8- Gỗ cấp 1; 9- Mô mềm ruột
Hình 3.3 Đặc điểm vi phẫu thân Hoàng Sin Cô
1- Lông che chở; 2- Biểu bì dưới; 3- Mô dày dưới; 4- Mô mềm; 5- Libe; 6- Gỗ;
7- Mô dày trên; 8- Biểu bì trên; 9- Lông tiết; 10- Mạch dẫn
Bột màu vàng cam, không mùi và không vị, có cấu trúc đặc biệt khi quan sát dưới kính hiển vi Mảnh mô mềm gồm các tế bào hình đa giác xếp khít nhau, kết hợp với lông che chở đa bào Ngoài ra, bột còn chứa nhiều hạt phấn hoa nằm riêng lẻ hoặc tập trung thành cụm, với hình dạng đẳng cực, hình cầu, có kích thước trung bình đường kính từ 30-35 µm, màu vàng đậm và bề mặt đặc trưng.
Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu lá Hoàng Sin Cô
34 có gai; sợi có thể xếp thành bó hay riêng rẻ (3); mảnh mạch xoắn (4); mảnh cánh hoa
1- Mảnh mô mềm; 2- Lông che chở đa bào, 3- Bó sợi, 4- Mảnh mạch xoắn,
5- Mảnh cánh hoa , 6- Hạt phấn hoa
Bột màu xanh lục có mùi thơm đặc trưng và không vị Dưới kính hiển vi, mảnh mô mềm bao gồm các tế bào thành dày màu nâu, trong khi mảnh biểu bì có lỗ khí rải rác, đứng riêng lẻ Các mảnh mang màu có sắc vàng nâu.
Tinh thể canxi oxalat có hình dạng lăng trụ, thường được bao bọc bởi nhiều lông che chở đa bào, với đầu lông có thể nhọn hoặc tù Ngoài ra, trong cấu trúc còn xuất hiện bó sợi và nhiều mảnh mạch xoắn cùng với mảnh mạch thang.
Hình 3.5 Một số đặc điểm bột hoa Hoàng Sin Cô
1- Mảnh mô mềm; 2- Lỗ khí; 3- Mảnh biểu bì mang lỗ khí; 4-Mảnh mang màu; 5- Tinh thể canxi oxalat; 6- Lông che chở; 7- Bó sợi; 8- Mảnh mạch thang;
Hình 3.6 Một số đặc điểm bột lá Hoàng Sin Cô
Bột màu vàng nhạt hoặc trắng ngà có mùi thơm đặc trưng và vị nhạt Khi quan sát dưới kính hiển vi, có thể thấy mảnh biểu bì thân và các loại mảnh mạch, bao gồm mảnh mạch mạng, mảnh mạch điểm và mảnh mạch xoắn Ngoài ra, còn xuất hiện tinh thể canxi oxalat hình cầu gai.
(6) hoặc hình khối (7); lông che chở đơn bào (8)
1- Mảnh biểu bì thân; 2- Mảnh mạch mạng; 3,4- Mảnh mạch điểm;
5- Mảnh mạch xoắn; 6- Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai; 7- Tinh thể canxi oxalat hình khối; 8- Lông che chở đơn bào
Bột có màu vàng nhạt, mùi thơm và vị ngọt Dưới kính hiển vi, bột chủ yếu bao gồm mảnh mô mềm với các tế bào hình đa giác kích thước không đều và vách tế bào mỏng, cùng với các sợi và mảnh mạch mạng Ngoài ra, bột còn chứa các hạt tinh bột có hình dạng khác nhau, thường có hình tròn và nằm riêng lẻ.
Hình 3.7 Một số đặc điểm bột thân Hoàng Sin Cô
1- Mảnh mô mềm; 2- Sợi; 3- Mảnh mạch mạng; 4- Hạt tinh bột.
Nghiên cứu thành phần hóa học
3.2.1 Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học
Kết quả định tính các nhóm chất trong rễ củ Hoàng Sin Cô bằng phản ứng hóa học được tóm tắt ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả định tính rễ củ Hoàng Sin Cô bằng phản ứng hóa học
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận
1 Alcaloid - Phản ứng với TT Mayer ( - )
- Phản ứng với TT Dragendorff ( - )
- Phản ứng với TT Bouchardat ( - )
Hình 3.8 Một số đặc điểm bột rễ củ Hoàng Sin Cô
2 Saponin - Hiện tượng tạo bọt ( + )
- Phản ứng Liebermann-Bouchardat ( ++ ) Có
- Phản ứng với dung dịch kiềm ( +++ )
- Phản ứng với TT Diazo (++)
4 Coumarin - Phản ứng mở, đóng vòng lacton ( - )
- Phản ứng chuyển dạng Cis-Trans ( +++ )
5 Glyccosid tim - Phản ứng xác định khung steroid ( + )
6 Anthranoid - Định tính Anthranoid toàn phần ( - ) Không
7 Acid hữu cơ - Phản ứng với Na2CO3 ( +++ ) Có
8 Đường khử - Phản ứng với TT Fehling A và
9 Acid amin - Phản ứng với TT Ninhydrin ( +++ ) Có
10 Tanin - Phản ứng với FeCl3 5% ( +++ )
- Phản ứng với chì acetat 10% ( +++ )
11 Polysaccharid - Phản ứng với TT Lugol ( + ) Có Chú thích: (-): Phản ứng âm tính (++): Phản ứng dương tính rõ
(+): Phản ứng dương tính (+++): Phản ứng dương tính rất rõ
3.2.2 Định tính Hoàng Sin Cô bằng sắc ký lớp mỏng
Kết quả của sắc ký lớp mỏng từ dịch chiết các bộ phận của cây Hoàng Sin Cô được trình bày chi tiết trong hình 3.9, 3.10 và bảng 3.2, 3.3, với các hệ dung môi đã được lựa chọn.
❖ Hệ dung môi (II) ethyl acetat- acid formic- nước (8:1:1).
Sắc ký đồ được chụp ảnh ở bước sóng 254 nm và 366 nm, sau đó được hiện màu bằng thuốc thử NP/PEG và chụp ảnh ở bước sóng 366 nm (Hình 3.9) Kết quả phân tích được trình bày trong bảng 3.2.
Hình 3.9 trình bày sắc ký đồ dịch chiết Hoàng Sin Cô sử dụng hệ dung môi ethyl acetat- acid formic- nước theo tỷ lệ 8:1:1 Quan sát được thực hiện ở ba điều kiện: (a) ở bước sóng UV 254 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG, (b) ở bước sóng UV 366 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG, và (c) ở bước sóng UV 366 nm sau khi phun thuốc thử NP/PEG.
( L: dịch chiết lá, C: dịch chiết củ, H: dịch chiết hoa, T: dịch chiết thân )
Kết quả từ bảng 3.2 cho thấy SKLM dịch chiết Hoàng Sin Cô được thực hiện với hệ dung môi ethyl acetat- acid formic- nước theo tỷ lệ 8:1:1, được quan sát ở bước sóng UV 366 nm sau khi phun thuốc thử NP/PEG.
(+): Có vết (++) : Vết đậm (+++) : Vết rất đậm
Trên sắc ký đồ ở bước sóng 366 nm sau khi phun thuốc thử, dịch chiết của các mẫu đều quan sát thấy các vết tách rõ
Tại vị trí Rf = 0,77 và Rf = 0,86, cả sắc ký đồ của củ và hoa đều hiển thị vết phát huỳnh quang với vị trí tương đồng, tuy nhiên cường độ vết trên sắc ký đồ của hoa lại mạnh hơn.
Bên cạnh đó, tại vị trí R f = 0,20 có vết tương đồng về màu sắc và vị trí ở cả sắc ký đồ của củ, hoa và thân
Sắc ký đồ của hoa Hoàng Sin Cô cho thấy nhiều vết với màu sắc và cường độ khác nhau Cụ thể, sắc ký đồ dịch chiết từ lá, củ, hoa và thân của cây này sử dụng hệ dung môi ethyl acetat - acid formic - nước (tỷ lệ 8:1:1) chỉ có một vài vết tương đồng, trong khi hầu hết các vết khác biệt về màu sắc, vị trí và cường độ.
❖ Với hệ dung môi (I) toluen - ethyl acetat- acid formic (14:10:1), các chất đối chiếu acid caffeic và luteolin được sử dụng
Sau khi triển khai sắc ký đồ, hình ảnh được ghi lại ở bước sóng 254 nm và 366 nm Tiếp theo, mẫu được hiện màu bằng thuốc thử NP/PEG và chụp ảnh ở bước sóng 366 nm (Hình 3.10) Kết quả phân tích được tóm tắt trong bảng 3.3.
Hình 3.10 trình bày sắc ký đồ của dịch chiết Hoàng Sin Cô với chất chuẩn, sử dụng hệ dung môi toluen - ethyl acetat - acid formic (tỉ lệ 14:10:1) Sắc ký đồ được quan sát ở hai bước sóng UV khác nhau: (a) 254 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG và (b) 366 nm trước khi phun thuốc thử NP/PEG.
UV 366 nm sau khi phun thuốc thử NP/PEG
( L: dịch chiết lá, C: dịch chiết củ, Ca: acid caffeic, Lu: luteolin, H: dịch chiết hoa,
Kết quả SKLM của dịch chiết Hoàng Sin Cô và chất chuẩn được thực hiện trong hệ dung môi toluen - ethyl acetat - acid formic (14:10:1) đã được quan sát ở bước sóng UV 366 nm sau khi phun thuốc thử NP/PEG.
R f và màu sắc huỳnh quang Chất được xác định
Lá 4 0,01; 0,33 (xanh lam); 0,4; 0,5 (xanh) Acid caffeic
Trên sắc ký đồ ở bước sóng 366 nm sau khi phun thuốc thử, dịch chiết của các mẫu đều quan sát thấy các vết tách rõ
Tại vị trí R f = 0,33, sắc ký đồ của dịch chiết lá, củ và hoa đều cho thấy vết tương đồng với vết acid caffeic chuẩn, trong đó cường độ vết acid caffeic trong sắc ký đồ của hoa là mạnh nhất.
Trên sắc ký đồ của dịch chiết thân xuất hiện vết phát huỳnh quang màu vàng, có vị trí tương đồng với vết luteolin chuẩn ở R f = 0,32
Qua phân tích sắc ký đồ, chúng tôi nhận thấy sự hiện diện của acid caffeic trong lá, củ và hoa, trong khi luteolin chỉ xuất hiện ở thân cây Mặc dù sắc ký đồ của lá và củ có nhiều điểm tương đồng, nhưng cường độ các vết trên lá lại mạnh hơn Đồng thời, sắc ký đồ của hoa và thân cũng cho thấy nhiều vết tương đồng.
❖ Kết quả sắc ký lớp mỏng củ Hoàng Sin Cô với hệ dung môi ethyl acetat- propanol- nước- acid acetic băng (1:1:0.5:0.5) được trình bày ở hình 3.11
Sau khi triển khai sắc ký đồ, hình ảnh được ghi lại ở bước sóng 254 nm và 366 nm Tiếp theo, mẫu được hiện màu bằng thuốc thử acid sulfuric 10% và chụp ảnh dưới ánh sáng thường (Hình 3.11).
Hình 3.11 trình bày sắc ký đồ dịch chiết củ Hoàng Sin Cô dưới ba điều kiện khác nhau: (a) ở bước sóng UV 254 nm trước khi phun thuốc thử acid sulfuric 10%, (b) ở bước sóng UV 366 nm trước khi phun thuốc thử acid sulfuric 10%, và (c) dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử acid sulfuric 10%.
Sắc ký đồ sau khi phun thuốc thử acid sulfuric 10% cho thấy các vết tách nhau rõ ràng khi quan sát dưới ánh sáng thường Dịch chiết từ củ Hoàng Sin Cô tạo ra 9 vết màu nâu đen với các giá trị R f lần lượt là 0,07; 0,09; 0,11; 0,15; 0,20; 0,25; 0,35; 0,50; và 0,56, trong đó cường độ các vết tăng dần theo giá trị R f Các vết này có thể là các hợp chất đường đã biết trong củ, nhưng do chưa có chất đối chiếu, chúng tôi chưa thể xác định các thành phần đường cụ thể.
Định lượng polyphenol toàn phần trong dược liệu
Xây dựng đường chuẩn định lượng
Để xác định nồng độ acid gallic, tiến hành lấy 1 ml dung dịch chuẩn với các nồng độ 20 àg/ml, 40 àg/ml, 60 àg/ml, 80 àg/ml và 100 àg/ml vào bình định mức 10ml Thêm 2,5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% và để phản ứng trong 5 phút Sau đó, thêm 1 ml nước cất, lắc đều, rồi thêm 4 ml dung dịch Na2CO3 7,5% và định mức bằng nước cất Qua đó, thu được dãy chuẩn G1 đến G5 với nồng độ lần lượt là 2 àg/ml, 4 àg/ml, 6 àg/ml, 8 àg/ml và 10 àg/ml Sau 60 phút phản ứng ở nhiệt độ phòng, xác định độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ tại bước sóng 745,5 nm, mẫu trắng được chuẩn bị song song Kết quả độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn và đồ thị tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ acid gallic chuẩn được trình bày trong bảng và hình tương ứng.
Bảng 3.4 Kết quả đo độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn
(10àg/ml) Độ hấp thụ A trung bình 0,183 0,381 0,543 0,76 0,917
Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ acid gallic chuẩn
Có sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ acid gallic chuẩn với hệ số tương quan R 2 = 0,9979
Dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0923x + 0,0027 và mdl = 1,0023 g; mật độ quang A = 0,650; hàm ẩm a = 6,40 %; hệ số pha loãng K= 20; thể tích V
= 50 ml ta xác định được hàm lượng polyphenol toàn phần là 7,475 (mg GAE/g dược liệu khô) y = 0.0923x + 0.0027 R² = 0.9979
Nồng độ acid gallic chuẩn (μg/ml)
BÀN LUẬN
Về đặc điểm thực vật
Nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân tích và so sánh các đặc điểm hình thái của cây với tài liệu đã được mô tả Kết quả cho thấy mẫu cây nghiên cứu thuộc về loài Smallanthus sonchifolius (Poepp.) H.Rob., thuộc họ Cúc (Asteraceae).
Loài thực vật này có những đặc điểm nổi bật như thân mọc thẳng hình trụ và được bao phủ bởi lông Lá gốc có hình mác với chóp nhọn và mép lá có răng cưa, cả hai mặt của lá cũng có lông Thân rễ phân nhánh và củ có hình trụ Cụm hoa ngù đầu gồm 7-8 cụm hoa đầu với màu vàng cam rực rỡ.
Nghiên cứu các đặc điểm thực vật giúp xây dựng cơ sở dữ liệu quan trọng để kiểm nghiệm dược liệu, đồng thời phân biệt cây Hoàng Sin Cô với các loài khác trong cùng chi.
Về đặc điểm vi học
Vi phẫu thực vật có những đặc điểm nổi bật như cả thân và lá đều được bao phủ bởi lớp lông che chở đa bào bên ngoài Thêm vào đó, lá còn có lông tiết và phiến lá có hệ thống mạch dẫn, giúp cây thực hiện các chức năng sinh lý hiệu quả.
Bột dược liệu có những đặc điểm vi phẫu đặc trưng như lông tiết và lông che chở Cụ thể, bột lá chứa tinh thể canxi oxalat hình trụ, trong khi bột thân có tinh thể canxi oxalat hình cầu gai và mảnh mang màu Bột hoa được nhận diện qua hạt phấn hoa hình cầu với bề mặt có gai, còn bột rễ củ lại chứa nhiều hạt tinh bột.
Quá trình thực nghiệm đã cung cấp hình ảnh và mô tả chi tiết về vi phẫu thực vật, cùng với đặc điểm của bột, nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu cho việc phân biệt và thiết lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu.
Về thành phần hóa học
Nghiên cứu định tính dược liệu Hoàng Sin Cô cho thấy dịch chiết chứa saponin, flavonoid, đường khử, acid hữu cơ, acid amin và polysaccharid Trong đó, flavonoid và đường khử là hai thành phần chính, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về thành phần hóa học của dược liệu này.
47 quan Do vậy nhóm nghiên cứu đã tiến hành định tính bằng sắc ký lớp mỏng và định lượng hàm lượng polyphenol toàn phần trong dược liệu
Polyphenol là chất chuyển hóa thứ cấp trong thực vật, đóng vai trò quan trọng trong nhiều tác dụng sinh học của dược liệu Nghiên cứu cho thấy polyphenol trong Hoàng Sin Cô có khả năng chống oxy hóa và chống tăng đường huyết Phương pháp đo quang UV-Vis đã được sử dụng để định lượng polyphenol toàn phần, trong đó các hợp chất phenol phản ứng với Folin – Ciocalteu Kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol trong Hoàng Sin Cô đạt 7,475 mg GAE/g dược liệu khô, góp phần xây dựng tiêu chuẩn cho mẫu nghiên cứu và định hướng cho các nghiên cứu hóa học sâu hơn.
Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để định tính thành phần hóa học của Hoàng Sin Cô, một phương pháp phổ biến trong kiểm nghiệm dược liệu Qua khảo sát các hệ dung môi, hai hệ tách hiệu quả được xác định là toluen-ethyl acetat-acid formic (14:10:1) và ethyl acetat-acid formic-nước (8:1:1) Kết quả sắc ký cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các mẫu lá, thân, củ, hoa dựa vào số lượng, vị trí và màu sắc các vết Đặc biệt, sắc ký đồ của lá và củ có nhiều vết tương đồng, trong khi hoa và thân cũng có sự tương đồng về vị trí và màu sắc So sánh với chất chuẩn cho thấy sự hiện diện của acid caffeic trong dịch chiết lá, củ và luteolin trong thân Acid caffeic nổi bật với tác dụng chống oxy hóa và giảm stress oxy hóa, trong khi luteolin có nhiều tác dụng sinh học như chống viêm, chống dị ứng và hoạt tính chống ung thư Tác dụng chống oxy hóa của Hoàng Sin Cô liên quan đến sự xuất hiện của acid caffeic và luteolin trong rễ củ.
48 dự trữ một lượng lớn carbohydrat, thành phần chính của carbohydrat này là oligofructan hoặc fructooligosaccharid, ngoài ra còn có glucose, fructose và sucrose
Nhóm nghiên cứu đã thực hiện sắc ký lớp mỏng để xác định sơ bộ đường trong củ Hoàng Sin Cô Dựa trên tài liệu tham khảo, chúng tôi đã áp dụng phương pháp chiết xuất củ Hoàng Sin Cô theo nghiên cứu của Zhen-Yuan và cộng sự.
Sử dụng hệ dung môi ethyl acetat- propanol- nước- acid acetic băng (1:1:0.5:0.5) cho thấy kết quả sắc ký với nhiều vết, chứng tỏ dịch chiết củ Hoàng Sin Cô chứa nhiều loại carbohydrat Tuy nhiên, do thiếu các chất chuẩn đối chiếu, việc xác định các chất tương ứng với các vết vẫn chưa thực hiện được Ngoài ra, các vết có Rf lớn hơn thường có cường độ đậm hơn, cho thấy rằng các hợp chất có tính phân cực thấp có hàm lượng cao hơn trong mẫu.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Sau một thời gian thực nghiệm, khóa luận đã thu về được một số kết quả sau:
❖ Về đặc điểm thực vật
Mẫu nghiên cứu đã được mô tả và phân tích đặc điểm hình thái một cách chi tiết Dựa trên các đặc điểm này, mẫu nghiên cứu đã được xác định tên khoa học là Smallanthus.
Sonchifolius (Poepp.) H.Rob (tên thường gọi là Hoàng Sin Cô, Yacon, Khoai Sâm…), thuộc họ Cúc (Asteraceae)
- Đã mô tả đặc điểm vi phẫu thân, vi phẫu lá, đặc điểm bột góp phần vào tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu sau này
❖ Về thành phần hóa học
Nghiên cứu đã xác định các nhóm chất hữu cơ phổ biến thông qua các phản ứng hóa học, với kết quả sơ bộ cho thấy mẫu nghiên cứu chứa flavonoid, saponin, đường khử, acid hữu cơ, acid amin và polysaccharid.
Nghiên cứu đã tiến hành định tính dịch chiết từ các bộ phận lá, củ, hoa và thân của cây Hoàng Sin Cô bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, đồng thời so sánh với các chất chuẩn acid caffeic và luteolin.
- Đã định tính sơ bộ carbohydrat trong dịch chiết củ Hoàng Sin Cô
- Đã định lượng hàm lượng tổng polyphenol toàn phần trong dịch chiết dược liệu cho kết quả 7,475 (mg GAE/g dược liệu khô)
Dưới điều kiện thời gian và khả năng hiện tại, đề tài đã đạt được một số kết quả ban đầu, góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu về cây Hoàng Sin Cô tại Việt Nam Tuy nhiên, để hoàn thiện hơn, cần tiến hành nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây này.
Nhóm nghiên cứu đề xuất một số ý kiến cho các đề tài sau:
- Nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học của Hoàng Sin Cô
- Nghiên cứu định lượng thành phần đường trong củ Hoàng Sin Cô
- Nghiên cứu về tác dụng sinh học của Hoàng Sin Cô như tác dụng hạ đường huyết, tác dụng chống oxy hóa, chống viêm…
Tài liệu tham khảo Tài liệu Tiếng Việt
1 Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2016), Thực vật dược, NXB Y học, tr 17-423
2 Bộ môn Dược liệu (2019), Thực tập dược liệu, Trung tâm thư viện Đại học Dược Hà Nội, tr 64-133
3 Đỗ Quyên (2015), Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ thiên nhiên, NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội, tr 21-59
4 Nguyễn Viết Thân (2020), Cây thuốc Việt Nam và những bài thuốc thường dùng, NXB Y Học, Hà Nội, tr 234
5 Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr 13-21
6 Aybar Manuel, Riera Alicia, et al (2001), "Hypoglycemic effect of the water extract of Smallanthus sonchifolius (Yacon) leaves in normal and diabetic rats",
7 Baroni Silmara, Rocha Bruno, et al (2016), "Hydroethanolic extract of Smallanthus sonchifolius leaves improves hyperglycemia of streptozotocin induced neonatal diabetic rats", Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 9, pp 432-436
8 Baroni Silmara, Suzuki-Kemmelmeier Fumie, et al (2008), "Effect of crude extracts of leaves of Smallanthus sonchifolius (yacon) on glycemia in diabetic rats",
Revista Brasileira De Ciencias Farmaceuticas - RBCF, 44, pp 522-527
9 Cao Y., Ma Z F., et al (2018), "Phytochemical Properties and Nutrigenomic Implications of Yacon as a Potential Source of Prebiotic: Current Evidence and Future Directions", Foods, 7(4), pp 2-11
10 De Andrade Eriel Forville, Leone Roberta de Souza, et al (2014), "Phenolic profile and antioxidant activity of extracts of leaves and flowers of yacon (Smallanthus sonchifolius)", Industrial Crops and Products, 62, pp 499-506
11 de Oliveira R B., de Paula D A., et al (2011), "Renal toxicity caused by oral use of medicinal plants: the yacon example", J Ethnopharmacol, 133(2), pp 434-41
12 Dou D Q., Tian F., et al (2008), "Structure elucidation and complete NMR spectral assignments of four new diterpenoids from Smallantus sonchifolius", Magn
13 Gasparoto Thais Helena (2013), "Topical anti-inflammatory activity of yacon leaf extracts", Revista Brasileira de Farmacognosia, pp 497-505
14 Genta S B., Cabrera W M., et al (2005), "Subchronic 4-month oral toxicity study of dried Smallanthus sonchifolius (yacon) roots as a diet supplement in rats",
15 Genta S B., Cabrera W M., et al (2010), "Hypoglycemic activity of leaf organic extracts from Smallanthus sonchifolius: Constituents of the most active fractions", Chem Biol Interact, 185(2), pp 143-52
16 Genta Susana, Habib Natalia, et al (2009), "Yacon syrup: Beneficial effects on obesity and insulin resistance in humans", Clinical nutrition (Edinburgh, Scotland), 28, pp 182-7
17 Goto Keiichi, Fukai Katsuhiko, et al (1995), "Isolation and Structural Analysis of Oligosaccharides from Yacon (Polymnia sonchifolia)", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 59(12), pp 2346-2347
18 Graefea S., Hermannb M., et al (2003), "Effects of post-harvest treatments on the carbohydrate composition of yacon roots in the Peruvian Andes", Field Crops Research, 86(2004), pp 157-165
19 Grau A., Rea J (1997), "Yacon Smallanthus sonchifolius(Poepp & Endl.) H Robinson", Andean roots and tubers: Ahipa, arracacha, maca and yacon, IPGRI, Rome, 174, pp 199-256
20 Guo Bao, Shu Ju Flora of China, pp 867
21 Habib Natalia, Honoré Stella, et al (2011), "Hypolipidemic effect of Smallanthus sonchifolius (yacon) roots on diabetic rats: Biochemical approach",
22 Honoré Stella, Genta Susana, et al (2015), "Smallanthus sonchifolius (Yacon) leaves: an emerging source of compounds for diabetes management", Journal of Research in Biology, 5, pp 21-42
23 Honoré Stella, Genta Susana, et al (2012), "Protective effect of yacon leaves decoction against early nephropathy in experimental diabetic rats", Food and chemical toxicology : an international journal published for the British Industrial Biological Research Association, 50, pp 1704-15
24 Jingwei Li, Jian Liu, et al (2009), "GC-MS analysis of the chemical constituents of the essential oil from the leaves of yacon (Smallanthus sonchifolia)",
Frontiers of Agriculture in China, 3(1), pp 40
25 Kakuta Hideo, Seki Takuhiko, et al (1992), "Ent-kaurenic Acid and Its Related Compounds from Glandular Trichome Exudate and Leaf Extracts of Polymnia sonchifolia", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 56(10), pp
26 Khajehei F., Merkt N., et al (2018), "Yacon (Smallanthus sonchifolius Poepp
& Endl.) as a Novel Source of Health Promoting Compounds: Antioxidant Activity, Phytochemicals and Sugar Content in Flesh, Peel, and Whole Tubers of Seven Cultivars", Molecules, 23(2), pp 278
27 Lachman Jaromir, Fernández Eloy, et al (2003), "Yacon [Smallanthus sonchifolia (Poepp et Endl.) H Robinson] chemical composition and use - A review", Plant, Soil and Environment, 49(6), pp 283-290
28 Lin F., Hasegawa M., et al (2003), "Purification and identification of antimicrobial sesquiterpene lactones from yacon (Smallanthus sonchifolius) leaves",
29 Mendoza Rachelle, Vidar Warren, et al (2018), "In vitro Cytotoxic Potential of Yacon (Smallanthus sonchifolius) Against HT-29, MCF-7 and HDFn Cell Lines",
Journal of Engineering and Applied Sciences, 13, pp 3683-3691
30 Myint Phyu, Dao Thien, et al (2019), "Anticancer Activity of Smallanthus sonchifolius Methanol Extract against Human Hepatocellular Carcinoma Cells",
31 Oliveira PM, Coelho RP, et al (2016), "Supplementation with the yacon root extract (Smallanthus sonchifolius) improves lipid, glycemic profile and antioxidant parameters in wistar rats hypercholesterolemic", World J Pharm Pharm Sci, 5, pp 2284-2300
32 Padla Eleanor, Solia Ludivina, et al (2012), "Antibacterial and antifungal properties of ent-kaurenoic acid from Smallanthus sonchifolius", Chinese Journal of
33 Pereira Juciane, Teixeira Meryene, et al (2016), "Total antioxidant activity of yacon tubers cultivated in Brazil", Ciência e Agrotecnologia, 40(5), pp 596-605
34 Phuong Nguyen Thi, Tuyet Hoang Thi, et al (2018), "HPTLC Densitometry Method for the Quantification of Nystose in Radix Morindae officinalis Collected from Different Regions in Vietnam", Journal of Medicinal Materials, 23(3), pp 131-
35 Russo D., Malafronte N., et al (2015), "Antioxidant activities and quali- quantitative analysis of different Smallanthus sonchifolius [(Poepp and Endl.) H Robinson] landrace extracts", Nat Prod Res, 29(17), pp 1673-7
36 Scheid M M., Genaro P S., et al (2014), "Freeze-dried powdered yacon: effects of FOS on serum glucose, lipids and intestinal transit in the elderly", Eur J
37 Simonovska B., Vovk I., et al (2003), "Investigation of phenolic acids in yacon (Smallanthus sonchifolius) leaves and tubers", J Chromatogr A, 1016(1), pp 89-98.
