TỔNG QUAN
Vị trí phân loại của loài Polyscias guilfoylei
Theo nghiên cứu về phân loại thực vật, chi Polyscias có vị trí phân loại nhƣ sau: [47]
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Bộ Sơn thù du (Cornales)
Chi Đinh lăng (Polyscias) Loài Polyscias guilfoylei thuộc chi Đinh lăng (Polyscias)
Đặc điểm thực vật của loài Polyscias guilfoylei
Polyscias guilfoylei Bail là một loài cây thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), thường được biết đến với chiều cao từ 3-4m và thân cây ít phân nhánh Loại cây bụi này có lá đa dạng, mang màu lục sáng với viền trắng, được chia lông chim đều đặn Cuống lá ngắn và to, có thể có sọc hoặc đốm, trong khi lá chét thuôn có răng không đều.
Năm 2019, Đinh Thị Vân và cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Đinh lăng răng, một loại cây gỗ nhỏ cao từ 2-3m với rễ cọc ăn sâu và nhiều rễ phụ Thân cây phân nhánh từ gốc, với thân già có màu nâu và đường kính từ 4-6 cm, trong khi thân non có màu xanh đậm, đường kính từ 0,8-1,2 cm và có đốm trắng nhỏ Bề mặt thân cây có nhiều nốt sần và sẹo dạng nhẫn, là dấu tích của bẹ lá sau khi rụng.
Lá kép lông chim có chiều dài từ 18-36 cm, với cuống lá dài 12-20 cm và bẹ lá ôm lấy thân dài 1,5-2 cm Mặt ngoài của lá có màu xanh đậm với nốt sần, trong khi mặt trong là màu xanh nhạt Ở mấu đầu tiên của lá, có từ 2-5 nhánh và số lượng lá chét dao động từ 22 đến 32 Cuống lá dài 1-3 cm, đường kính 0,1-0,2 cm, với cánh rộng khoảng 0,1-0,2 cm mỗi bên Phiến lá có màu xanh đậm, nhẵn cả hai mặt, với hình dạng đa dạng như gần tròn, gốc lệch, và ngọn lá có thể chia thành 2-3 thùy đều hoặc không đều, kích thước từ 2-6 cm.
3 lá thường tròn hoặc hơi tù; gân lá hình mạng có 2-5 gân chính xuất phát từ gốc, nổi rõ
2 mặt; mép lá có răng thƣa cách nhau 0,5 đến 1 cm [20]
Phân bố của loài Polyscias guilfoylei
Loài Polyscias guilfoylei, theo tờ Kewscience, được công nhận và phân bố từ Đông Malaysia đến Tây Nam Thái Bình Dương, với nguồn gốc tự nhiên tại quần đảo.
Bismarck, Maluku, New Caledonia, New Guinea, đảo Santa Cruz, Vanuatu Loài
Polyscias guilfoylei has been introduced and cultivated in various regions, including the Bahamas, Caroline Islands, southeastern China, Cook Islands, Dominican Republic, Gilbert Islands, Guinea, Hainan, Haiti, Leeward Islands, Line Islands, Marianas, Mozambique, Niue, Puerto Rico, Society Islands, Thailand, Tonga, Trinidad and Tobago, Tuamotu, Tubuai, Tuvalu, the Antilles of Venezuela, and Wallis-Futuna.
Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Đinh lăng (Polyscias)
Chi Đinh lăng, thuộc họ Nhân sâm, là một trong những chi lớn nhất với nhiều loài khác nhau Tuy nhiên, cho đến nay, chỉ một số loài của chi Polyscias như P fruticosa, P filicifolia, P scutellaria và P amplifolia đã được nghiên cứu trên toàn thế giới.
Harms, P dichroostachya Baker, P fulva, P murrayi Harms và Polyscias sp nov [8], [20];
Năm 1992, trên loài Polyscias fruticosa (L.) Harm, Lutomski J Luan Tran Cong và các cộng sự đã công bố kết quả phân lập đƣợc 5 hợp chất polyacetylen [4], [27] nhƣ sau:
(8 E ) –heptadeca–1,8–dien–4,6– diyn–3–ol–10–on (2)
10–on (3) falcarinol (4) panaxydol (5) Các sterol và glycosid của sterol
Trên hai loài Polyscias filicifolia Balf và loài Polyscias scutellaria, có 3 hợp chất đã đƣợc phân lập và xác định thuộc nhóm sterol đó là stigmasterol (7); spinasterol
Ba hợp chất quan trọng thuộc nhóm chất này bao gồm β–sitosterol, 3–O–β–D–glucopyranosyl β–sitosterol và 3–O–β–D–glucopyranosyl stigmasterol, được phân lập từ loài Polyscias fulva Các hợp chất này bao gồm β–sitosterol, stigmasterol và spinasterol, cùng với 3–O–β–D–glucopyranosyl β–sitosterol.
Năm 1990, Brophy Joseph V Lassak Erich và các cộng sự đã phân lập đƣợc từ lá cây của loài Polyscias fruticosa (L.) Harm 4 tinh dầu [15], cụ thể nhƣ sau:
Năm 1991, Lussignol M, Raynaud J và các cộng sự đã công bố việc phân lập hai hợp chất phenol, bao gồm 3–O–β–D–glucopyranosyl tetramethyl quercetin và 3–O–β–D–galactopyranosylquercetin, từ loài Polyscias sp nov.
In 2001, Bedir Erdal Toyang and colleagues isolated a flavonoid compound known as 3–O–β–D–glucopyranosyl-tetramethyl quercetin from the species Polyscias fulva (Hiern) Harms.
Năm 2005, Buchanan Malcolm S Carroll và các cộng sự đã công bố việc phân lập năm hợp chất từ Polyscias murrayi Harms, trong đó có acid 3–(4–hydroxyphenyl)propanoic và acid 3–(3,4–dihydroxyphenyl)propanoic.
(22); acid 3,4–di–O–3–(4-hydroxyphenyl)propionyl–1,5- dihydroxycyclohexancarboxylic (23); acid 3,5–di–O–3–(4–hydroxyphenyl)propionyl– 1,4-dihydroxycyclohexancarboxylic (24); acid 3,5–dicaffeoyl–muco–quinic (25) β–elemen (12a) β–germacren–D (12b) E–γ–bisabolen (13) α–bergamoten (14)
Năm 2007, Nguyễn Thuý Anh Thƣ đã công bố thành phần hóa học của loài
Polyscias filicifolia Balf trong đó có hai hợp chất phenol là quercetin–3,7,3’,4’– tetrametyl eter (17) và kaempferol–3,7–di–O–α–L–rhamnopyranosid (18) [7] acid 3,5–di– O –3–(4– hydroxyphenyl)propionyl–1,4– dihydroxycyclohexancarboxylic (24) acid 3,5–dicaffeoyl– muco –quinic (25)
Các saponin có aglycon là acid oleanolic
Trong nhóm saponin có aglycon là acid oleanolic, có tới 25 hợp chất đã đƣợc phân lập và xác định trên 6 loài thuộc chi Đinh lăng, cụ thể:
Bảng 1.1 Một số saponin có aglycon là acid oleanolic đƣợc phân lập từ các loài thuộc
3– O – β –D– galactopyranosylquerc etin (16) quercetin–3,7,3’,4’– tetrametyl eter (17) kaempferol–3,7–di– O – α –
L–rhamnopyranosid (18) lichexanthon (19) acid 3–(4– hydroxyphenyl) propionyl choline (20)
Tên loài Hợp chất phân lập đƣợc TLTK
(Baker) Harms acid 3–O–β–D–galactopyranosyloleanolic (28); acid 3–
O–β–D–galactopyranosyl–(14)–β–D– galactopyranosyloleanolic (29); acid 3–O–β–D– galactopyranosyl–(14)–β–D–xylopyranosyloleanolic (30); acid 3–O–β–D–galactopyranosyl–(14)–α–L– arabinopyranosyloleanolic (31)
Polyscias filicifolia Balf acid oleanolic (26); acid 3–O–β–D–glucopyranosyl–
(Hiern) Harms acid oleanolic (26); acid 3–O–α–L–rhamnopyranosyl–
Harm acid 3–O–β–D–galactopyranosyl–(12)–β–D– glucopyranosyloleanolic (34); acid 3–O–α–L– rhamnopyranosyl–(14)–β–D–glucopyranosyl–28–O–β–
[35] acid 3–O–β–D–glucopyranosyl–(14)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (32); acid 3–O–β–D– glucopyranosyl–(12)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (36); acid 3–O–[β–D– glucopyranosyl–(12),β–D–glucopyranosyl–(14)]–β–
D–glucuronopyranosyloleanolic (38); acid 3–O–[β–D– galactopyranosyl–(12),β–D–glucopyranosyl–(13)]– β–D–glucuronopyranosyloleanolic (39); 3–O–β–D– glucopyranosyl–(14)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic–28–O–β–D–glucopyranosyl ester (40); 3–O–[β–D–glucopyranosyl–(12),β–D– glucopyranosyl–(14)]–β–D–
8 glucuronopyranosyloleanolic–28–O–β–D–glucopyranosyl ester (41); 3–O–[α–L–arabinopyranosyl–(12), β–D– glucopyranosyl–(14)]–β–D– glucuronopyranosyloleanolic–28–O–β–D–glucopyranosyl ester (42); 3–O–[β–D–galactopyranosyl–(12), β–D– glucopyranosyl–(13)]–β–D– glucuronopyranosyloleanolic–28–O–β–D–glucopyranosyl ester (43); 3–O–β–D-glucopyranosyl–(14)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic–28–O–α–L– rhamnopyranosyl–(13)–β–D–glucopyranosyl ester (44);
3–O–[β–D–glucopyranosyl–(12), β–D– glucopyranosyl– (14)]–β–D–7– glucuronopyranosyloleanolic–28–O–α–L– rhamnopyranosyl–(13)–β–D–glucopyranosyl ester (45)
(Burm f.) Merr acid 3–O–β–D–glucopyranosyl–(12)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (36); acid 3–O–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (46); acid 3–O–β–D– glucopyranosyl–(13)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (47); 3–O–β–D– glucopyranosyl–(13)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic–28–O–β–D–glucopyranosyl ester (48); acid 3–O–β–D–glucopyranosyl–(12)–β–D– glucopyranosyl–(14)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (49); 3–O–β–D– glucopyranosyl–(14)–β–D–glucopyranosyl–(12)–β–
Polyscias scutellaria acid 3–O–β–D–glucopyranosyl–(14)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (32); 3–O–β–D– glucopyranosyl–(14)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic–28–O–β–D–
(14)–β–D–glucuronopyranosyloleanolic–28-O-metyl ester (51) acid oleanolic (26)
Các saponin có phần aglycon là hederagenin
Có 6 saponin có phần aglycon là hederagenin đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc trên hai loài, cụ thể:
In 1990, Gopalsamy N Gueho and colleagues isolated four saponins from the species Polyscias dichroostachya Baker These include 3–O–α–L–arabinopyranosylhederagenin, 3–O–α–L–rhamnopyranosyl–(1→2)–α–L–arabinopyranosylhederagenin, 3–O–β–D–glucopyranosyl–(1→2)–α–L–arabinopyranosylhederagenin, and 3–O–α–L–rhamnopyranosyl–(1→2)–α–L–arabinopyranosylhederagenin-28–O–β–D–glucopyranosid.
Trên loài Polyscias fulva (Hiern) Harm, năm 2004, Mitaine-Offer AC
Tapondjou LA và các cộng sự đã phân lập đƣợc 4 chất saponin nhóm này [28], cụ thể là: hederagenin (27); 3–O–α–L–arabinopyranosylhederagenin (52); 3–O–α–L– rhamnopyranosyl– (12) –α–L–arabinopyranosylhederagenin (53); 3–O–α–L– rhamnopyranosyl– (1→2) –α–L– arabinopyranosylhederagenin–28–O–β–L– rhamnopyranosyl–(1→4)–β–D–glucopyranosyl–(1→6)–β–D–glucopyranosyl ester (kalopanax saponin B) (56)
Năm 1988, PaPhassarang và cộng sự đã phân lập đƣợc 3–O–β–D– glucopyranosyloleanan (60) từ loài Polyscias scutellaria (Burm f.) Merr [39] Năm
2001, trên loài Polyscias fulva (Hiern) Harm, Bedir Erdal Toyang và các cộng sự đã công bố kết quả phân lập 1 saponin nhóm này là 12–oxo–3–β–16–β–20(S)– trihydroxydammar–24–en–3–O–α–L–rhamnopyranosyl–(12)–β–D–glucopyranosid
In 2004, Mitaine-Offer AC Tapondjou LA and colleagues isolated two saponin compounds from this species: arabinopyranosylcollinsogenin (also known as collinsonin) and 3–O–[α–L–rhamnopyranosyl–(1→2)–α–L–arabinopyranosyl]echynocystic acid.
Thành phần hóa học của loài Polyscias guilfoylei
Năm 2009, Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã công bố kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học của Polyscias guilfoylei gồm các hợp chất sau [8]:
12 isophytol (63) acid oleanolic (26) acid 3– O – β –D– glucuronopyranosyloleanolic (64) acid 3– O – β –D–glucopyranosyl–(13)– β – D–glucuronopyranosyloleanolic (65) acid 3– O – β –D–glucopyranosyl–(14)– β –D–glucuronopyranosyloleanolic (66) acid 3– O –[ β –D–glucopyranosyl–(13), β –D–glucopyranosyl–(14)]– β –D– glucuronopyranosyloleanolic (67) acid 3– O –[ β –D–glucopyranosyl
Năm 2019, Ashmawy và cộng sự đã công bố 9 hợp chất phân lập đƣợc từ lá
Polyscias guilfoylei [12], cụ thể là: ent -labda-8(17),13-diene-15,18-diol
(8 Z )–2–(2–hydroxypentacosanoylamino) octadeca–8–en–1,3,4–triol (73) acid 4–hydroxybenzoic (74)
Năm 2019, Đinh Thị Vân và cộng sự đã phân lập đƣợc 6 hợp chất từ lá của
Polyscias guilfoylei [9], đó là các hợp chất: methyl 3,5-dicaffeoylquinate (76) acid chlorogenic (77) kaempferol 3-O- β -D-glucopyranoside
(79) acid oleanolic (26) acid 3-O- β -D-glucopyranosyl-(1→4)- β -D-glucuronopyranosyloleanolic
Năm 2019, Lê Hương Giang và cộng sự đã phân lập được 2 hợp chất từ thân cây Polyscias guilfoylei [1], bao gồm: acid chlorogenic (77) acid rosmarinic (81)
Tác dụng sinh học của loài Polyscias guilfoylei
Năm 2008, Giuseppina Cioffi đã nghiên cứu tác dụng chống tế bào ung thư của hợp chất 3–β–O–[β–D–glucopyranosyl–(1→2)–α–L–arabinopyranosyl]–echinocystic acid–28–[O–β–D–glucopyranosyl–(1→6)–O–β–D–glucopyranosyl] ester trên ba dòng tế bào ung thư: J774.A1, HEK-293 và WEHI-164 Kết quả cho thấy hợp chất này ức chế cả ba dòng tế bào ung thư với IC50 lần lượt là 0.19 ± 0.001 μM đối với J774.A1, 0.35 ± 0.003 đối với HEK-293, và 0.64 ± 0.045 đối với WEHI-164.
Năm 2015, Reksi và cộng sự nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá của lá cây
Polyscias guilfoylei, kết quả cho thấy dịch chiết methanol của lá Polyscias guilfoylei cho kết quả hoạt tính chống oxy hoá rất có triển vọng [42]
Năm 2018, Ashmawy và các cộng sự đã nghiên cứu tinh dầu lá Polyscias guilfoylei, cho thấy hoạt tính kháng tụ cầu vàng với giá trị MIC đạt 313 μg/mL, cùng với hoạt tính gây độc tế bào Caco-2 với IC50 là 70,62 μg/mL.
Năm 2019, Ashmawy và cộng sự đã công bố rằng dịch chiết lá của Polyscias guilfoylei có tác dụng kháng khuẩn đối với vi khuẩn Escherichia coli với giá trị IC 50 là 9.76 µg/ml Họ cũng đã phân lập được hợp chất N-(1,3-dihydroxyoctadecan-2-yl) palmitamide từ lá, cho thấy tiềm năng ức chế giải phóng histamin khi thử nghiệm trên tế bào đơn nhân U937 của người.
ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu
Cây Đinh lăng răng, thuộc loài Polyscias guilfoylei (W.Bull) L.H.Bailey cv quinquefolia, đã được giám định tại Tiền Hải, Thái Bình vào ngày 25/3/2019 Hiện tại, tiêu bản thực vật của cây này đang được lưu giữ tại Phòng tiêu bản cây thuốc.
Bộ môn Thực Vật, Trường Đại học Dược Hà Nội (Số hiệu HNIP/18547/19) (Phụ lục
Đối tượng nghiên cứu là vỏ thân cây Đinh lăng, được thu hái vào tháng 8/2020 tại vùng trồng đã được quy hoạch và giám định tên khoa học vào tháng 3/2019 Dược liệu được rửa sạch, cắt nhỏ và phơi sấy ở nhiệt độ 65 độ C cho đến khi đạt độ ẩm dưới 10%, sau đó được bảo quản trong túi PE kín tại Bộ môn Dược học cổ truyền.
Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hóa chất
Hóa chất: Bản mỏng tráng sẵn pha thường silicagel F 254 (Merck), pha đảo RP 18
F 254s (Merck), chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 µm, Merck), pha đảo RP-18 (30 - 50 µm, Merck) và DPPH (Merck) là những thành phần quan trọng trong nghiên cứu Dung môi công nghiệp bao gồm n-hexan, ethyl acetat, n-butanol, aceton, dichloromethan (CH2Cl2), methanol (MeOH) và nước cất (H2O) được sử dụng để thực hiện các thí nghiệm và phân tích.
Các hóa chất, thuốc thử khác đều đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dƣợc điển Việt Nam V
2.2.2 Phương tiện và máy móc
Sắc ký cột dựng chất hấp phụ là silica gel F 254 cỡ hạt 60 - 200 àm (Merck), sephadex LH-20
Máy đo phổ khối LCMS8045 của Shimadzu, Nhật Bản
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HMBC) của hãng Bruker (500MHz), Viện Hàn lâm Khoa học
Máy đo HPLC điều chế của Shimadzu, Nhật Bản tại Viện Dƣợc liệu
Mỏy cụ quay 5 lớt và 20 lớt của BĩCHI, Thụy Sĩ
Máy gia nhiệt BATHS HH-S2, BATHS HH-S4, Bộ môn Dƣợc cổ truyền
Máy siêu âm Elmasonic S, Bộ môn Dƣợc cổ truyền
Máy soi UV Vilber, Bộ môn Dƣợc cổ truyền
Tủ sấy Memmert, tủ sấy Shellab, tủ sấy Wiseven, Bộ môn Dƣợc cổ truyền
Cân phân tích Adapter, Bộ môn Dƣợc cổ truyền
Cân kỹ thuật Precisa, Bộ môn Dƣợc cổ truyền
Bơm RAMBOO EP-8000, Bộ môn Dƣợc cổ truyền
Micropipet cỏc cỡ (0,5 àl - 1000 àl), pipet 1-20ml, pipet paster
Ống đong các loại (10 – 100ml)
Bình cầu đáy tròn các loại (50 - 2000 ml)
Ống nghiệm, lọ thủy tinh 100-500ml
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn
Trong nghiên cứu này, vỏ thân được tách riêng, cắt nhỏ và sấy ở 65 độ C để đạt độ ẩm dưới 10% Sau đó, vỏ thân được xay thô và chiết xuất bằng phương pháp siêu âm với dung môi ethanol 96%, sau khi cất thu hồi dung môi, sản phẩm thu được gọi là cao toàn phần Quy trình chi tiết được mô tả trong mục 2.3.1.1.
Trong phương pháp chiết phân đoạn, để thu được các loại cao với độ phân cực khác nhau, cần sử dụng các dung môi chiết có độ phân cực tương ứng Nguyên tắc chung là lựa chọn dung môi phù hợp nhằm tách biệt các hợp chất dựa trên tính chất phân cực của chúng.
Các chất kém phân cực sẽ hòa tan tốt trong dung môi kém phân cực, trong khi các chất phân cực sẽ tan trong dung môi phân cực hơn Để chiết cao phân đoạn, cần sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng dần Trong khóa luận, cao toàn phần được hòa vào nước cất, sau đó lắc phân đoạn với dung môi n-hexan, ethyl acetat và n-butanol theo thứ tự Quá trình cất sẽ thu hồi các phân đoạn dung môi như cắn n-hexan, cắn ethyl acetat, cắn n-butanol và dịch nước Quy trình chi tiết được trình bày trong mục 2.3.1.2.
2.3.1.2 Chiết xuất cao toàn phần
Bước 1: Xử lý nguyên liệu:
Vỏ thân được tách riêng và cắt nhỏ, sau đó được dải đều lên khay và đưa vào tủ sấy ở nhiệt độ 65 độ C Trong quá trình sấy, nguyên liệu cần được đảo một lần mỗi giờ cho đến khi độ ẩm đạt dưới 10% Cuối cùng, sử dụng thuyền tán để làm nhỏ nguyên liệu vỏ thân đã được sấy khô.
Sau khi nghiền nhỏ phần vỏ thân, chuyển vào bình thủy tinh 10L, đổ khoảng 4/5 thể tích bình với vỏ thân Tiếp theo, bổ sung ethanol 96% cho đến khi vỏ thân ngập trong dung môi chiết và để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
Bước 2: Ngâm ấm và chiết siêu âm:
Để thực hiện quá trình ngâm ấm, sau khi các bình vỏ thân đã hấp thụ dung môi và mực dung môi thấp hơn mực nguyên liệu, cần bổ sung thêm ethanol để đảm bảo dung môi ngập hoàn toàn trên vỏ thân Sau đó, đặt bình nguyên liệu vào bếp gia nhiệt, điều chỉnh nhiệt độ ở mức 45 độ C và duy trì quá trình ngâm liên tục trong 24 giờ.
Siêu âm là quy trình quan trọng trong việc xử lý bình sau khi ngâm ấm ít nhất 24 giờ Quá trình này bao gồm ba lần siêu âm liên tiếp, mỗi lần kéo dài 30 phút và cách nhau 30 phút Ngay sau lần siêu âm cuối cùng, dịch lọc sẽ được thu bằng phương pháp lọc nóng, trong khi phần bã vỏ thân sẽ được đưa trở lại bình ngâm và bổ sung ethanol 96% đủ để ngập vỏ thân.
Bước 3: Lặp lại bước 2 thêm 2 lần
Dịch chiết thu đƣợc của 3 lần chiết siêu âm đƣợc gộp lại, cô quay thu hồi dung môi, cắn thu đƣợc sau cô quay là cao toàn phần
2.3.1.1 Chiết xuất cao phân đoạn
Bước đầu tiên trong quy trình là xác định khối lượng cao toàn phần sau khi đã cô quay hết dung môi Chia cao thành các phần khoảng 200g và sử dụng bình gạn 2 lít để cho mỗi 200g cao vào Tiếp theo, thêm nước cất để đạt tổng thể tích khoảng 1,5 lít, bao gồm cả cao và nước Cuối cùng, lắc mạnh để đảm bảo cao phân bố đều trong nước.
Bước 2: Bổ sung khoảng 500ml dung môi n-hexan Lắc bình gạn liên tục trong
20 phút sau đó lắng hỗn hợp trong bình gạn tự phân lớp trong khoảng 24h Sau đó
19 chiết lấy phần dịch n-hexan phía trên đem cô quay thu hồi dung môi đƣợc cắn n- hexan, phần dịch chiết nước phía dưới tiếp tục cho vào bình gạn
Bước 3: Lặp lại bước 2 thêm 2 lần nữa Cắn thu được trong 3 lần chiết được gộp vào thành cắn n-hexan
Bước 4: Tiến hành chiết 3 lần dịch chiết nước từ bước 3 bằng ethyl acetat (500ml mỗi lần), sau đó tiếp tục chiết 3 lần dịch chiết nước thu được từ ethyl acetat bằng n-butanol (500ml mỗi lần), thực hiện theo quy trình chiết tương tự như ở các bước 2 và 3 với dung môi n-hexan.
Sau cùng thu đƣợc cắn n-hexan, cắn ethyl acetat, cắn butanol của vỏ thân Đinh lăng răng
Sắc ký là phương pháp vật lý dùng để tách hỗn hợp nhiều hợp chất thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của chúng đối với hai pha trong hệ thống Khi hỗn hợp được đặt vào hệ thống hai pha, mỗi hợp chất sẽ tương tác với pha tĩnh với mức độ khác nhau, dẫn đến sự di chuyển ngang qua pha tĩnh với tốc độ không giống nhau Nhờ vào sự khác biệt này, kỹ thuật sắc ký có khả năng tách riêng các loại hợp chất hiệu quả.
Trong nghiên cứu này, các phân đoạn của vỏ thân được tách chiết bằng phương pháp sắc ký cột silica gel pha thường (Merck), sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18 và HPLC điều chế Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn 60 GF 254 (Merck).
Sắc ký lớp mỏng (TLC) là phương pháp hiệu quả để theo dõi vết của các chất từ các phân đoạn Quá trình này được thực hiện bằng cách quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc sử dụng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.
2.3.2.1 Phân lập bằng sắc ký cột
Sắc ký cột hấp phụ là phương pháp phân tách các thành phần trong mẫu dựa trên sự phân bố khác nhau giữa hai pha không trộn lẫn: pha động là chất rửa giải và pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn trong cột thủy tinh Phương pháp này có thể được triển khai liên tục với các hệ dung môi có độ phân cực thay đổi từ yếu đến mạnh Chất nhồi cột thường là silica gel pha thường hoặc silica gel pha đảo.
Cột thủy tinh: chọn cột thủy tinh thành dày thích hợp, chiều dài cột gấp 3 lần thể tích silicagel cần thiết cho quá trình phân lập
Pha tĩnh: lựa chọn pha tĩnh phụ thuộc vào độ phân cực của mẫu cần tách
2.3.2.1.1 Phân lập bằng sắc ký cột silica gel pha thường (Merck)
Bước 1: Xác định khối lượng cao cần lên cột
Bước 2: Tiến hành khảo sát hệ dung môi cho việc lên cột bằng cách sử dụng phương pháp chấm TLC với các tỷ lệ dung môi khác nhau Dựa vào kết quả từ TLC, lựa chọn hệ dung môi phù hợp để tiếp tục quá trình lên cột.
Bước 3: Cân silicagel gấp ba lần lượng mẫu cao cần lên cột và chọn cột sao cho silicagel cao khoảng 20cm Hòa silicagel vào khoảng 1000 ml dung môi đã chọn để tạo hỗn dịch DM-silicagel Đồng thời, trộn mẫu cao với một lượng silicagel tối thiểu để thu được hỗn hợp cao-silicagel tơi xốp, sau đó đem vào tủ sấy ở 50°C trong 8 giờ.
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ
Kết quả chiết xuất vỏ thân cây Đinh lăng răng Polyscias guilfoylei
Vỏ thân cây Đinh lăng răng (1,1 kg mẫu khô, độ ẩm dưới 10%) được nghiền nhỏ và ngâm chiết với ethanol 96% ở nhiệt độ 45°C Sau khi chiết siêu âm và lọc nóng, thu được cao toàn phần (225,24 g, độ ẩm 37%) Cao này được hòa tan trong nước cất và chiết lần lượt với n-hexan, EtOAc và n-butanol, mỗi loại 3 lần Kết quả thu được các phân đoạn dịch chiết n-hexan (43,84 g), EtOAc (17,65 g) và n-butanol (20,19 g) sau khi cô quay thu hồi dung môi.
Sơ đồ 3.1 Kết quả chiết xuất vỏ thân cây Đinh lăng răng Polyscias guilfoylei
Kết quả phân lập một số hợp chất vỏ thân cây Đinh lăng răng Polyscias
Phân đoạn n-butanol (20,19 g) đƣợc chạy qua cột sắc ký (3 x 60 cm) pha tĩnh là silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi diclomethan-methanol (20:1, 10:1,
5:1, 1:1 v/v), thu đƣợc 26 phân đoạn (VB-1 đến VB-26) Phân đoạn VB-19 đến VB-
Mẫu 21 được gộp lại (kí hiệu VB19; 1,64 g) và được phân tích bằng cột sắc kí pha đảo RP-18 (2 x 45 cm) với pha động methanol và nước theo các tỷ lệ 1:2,5, 1:2, 1:1,5, 1:1, 2:1, 3:1 v/v, thu được 240 phân đoạn (LB19-1 đến LB19-240) Trong đó, phân đoạn VB19-143 chứa hợp chất 1 (3,5 mg, kí hiệu VB4), và phân đoạn VB19-150 đến VB19-205 được gộp lại với tổng khối lượng 120,34 mg, sử dụng phương pháp HPLC để điều chế.
Kết quả lựa chọn chương trình chạy HPLC điều chế như sau:
Trước tiên, khóa luận khảo sát bằng TLC pha đảo và chọn ra hệ aceton : nước 1:1 cho các vết tách nhau
Hình 3.2.1 Khảo sát TLC phân đoạn VB19-150 đến VB19-205 pha đảo, hệ Aceton : nước =1:1
HPLC điều chế được thực hiện bằng hệ thống HPLC của Shimadzu, Nhật Bản, sử dụng cột sắc ký Discovery HS C18 với kích thước 25cm x 21,2mm và kích thước hạt 10µm Chương trình sắc ký sử dụng hệ pha động gradient với tỷ lệ methanol : nước từ 40% : 60% (v/v) đến 100% : 0% (v/v) trong thời gian 120 phút, với tốc độ dòng 5,00 ml/phút Mỗi lần tiêm mẫu có thể tích 500 µl, và quy trình HPLC điều chế được thực hiện 2 lần.
Kết quả chạy HPLC cho 7 phân đoạn nhỏ được trình bày dưới đây:
Hình 3.2.2 Sắc kí đồ HPLC điều chế của VB19-150 đến VB19-205
Bảng 3.2 Thời gian lưu của các chất thu được từ HPLC điều chế
Sau khi kiểm tra bằng phương pháp TLC pha thường, chúng tôi đã quyết định tiến hành đo phổ NMR cho các phân đoạn 1, 3, 4, 5 và 6 Kết quả từ phổ NMR của phân đoạn 4 và 5 cho phép xác định hai hợp chất là VB1 với khối lượng 5,4mg và VB2 với khối lượng 4,6mg.
Hình 3.2.3 Hình ảnh TLC pha thường các phân đoạn thu được sau chạy HPLC điều chế
Kết quả phân lập một số hợp chất vỏ thân cây Đinh lăng răng đƣợc trình bày theo sơ đồ 3.2
Sơ đồ 3.2 Kết quả phân lập một số hợp chất vỏ thân cây Đinh lăng răng
3.3 Kết quả xác định cấu trúc một số hợp chất vỏ thân cây Đinh lăng răng
Hợp chất 1 (VB4) được thu nhận dưới dạng vô định hình, màu trắng, và qua kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), cho thấy VB4 trùng khớp với hợp chất LB1.1 phân lập từ lá cây Đinh lăng răng Do đó, hợp chất VB4 được xác định là acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic.
Hình 3.3.1 Hình ảnh kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) của hợp chất LB 1.1 (kí hiệu: T) và hợp chất VB4 (ký hiệu: 143)
Kết quả kiểm tra bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho LB1.1 phân lập từ lá và VB19-143 phân lập từ vỏ thân cây Đinh lăng răng cho thấy chương trình chạy theo gradient nồng độ, bắt đầu từ tỉ lệ Methanol : nước là 70% : 30% (v/v) và kết thúc ở 100% : 0% (v/v) trong thời gian 30 phút.
Hình 3.3.2 Sắc kí đồ HPLC của chất LB1.1 phân lập từ lá Đinh lăng răng
Datafile Nam e:Chat sach LB1.lcd Sample Nam e:Chat sach LB1
Hình 3.3.3 Sắc kí đồ HPLC của VB19-143 phân lập từ vỏ thân Đinh lăng răng
Hợp chất 1 (VB4 hay LB1.1) được chiết xuất từ phân đoạn VB19-143 của vỏ cây Đinh lăng răng và có cấu trúc tương tự như hợp chất LB1.1 từ lá cây Polyscias guilfoylei Hợp chất này xuất hiện dưới dạng bột vô định hình, màu trắng, với công thức phân tử C42H66O14 (M = 794) được xác định qua phổ khối ESI-MS và phổ 13C NMR Phổ 1H NMR cho thấy các tín hiệu singlet đặc trưng của nhóm methyl (CH3) tại nhiều vị trí khác nhau, chỉ ra rằng đây là các tín hiệu đặc trưng của nhóm methyl trong khung triterpen Kết hợp với phổ 13C NMR, có 42 tín hiệu được ghi nhận, trong đó có hai tín hiệu carbon tại δC 122,4 (C-12) và 144,6 (C-13) đặc trưng cho nối đôi ở vị trí C12-C13 của khung olean, cùng với tín hiệu tại δC 180,1 (C-28) gợi ý về sự hiện diện của nhóm -COOH tại vị trí C-28.
Dữ liệu phân tích cho thấy hợp chất này là một triterpen thuộc khung oleanan, với sự hiện diện của hai carbon anomer được xác định qua hai mũi cộng hưởng ở δ C = 106,4.
Datafile Nam e:VB19 - 143.lcd Sample Nam e:VB19 - 143
Hợp chất 1 được xác định là một saponin với phần aglycon là acid oleanolic và hai phân tử đường gồm glucose và glucuronat Phân tích NMR cho thấy các tín hiệu hóa học tại δ C = 106,4 và 105,4 cho biết sự hiện diện của hai carbon loại -CH trong phân tử đường, với các tín hiệu ở δH = 5,32 và 4,94 xác nhận cấu hình β của hai proton anomer Phổ ESI-MS cũng hỗ trợ việc xác định hợp chất này, cho thấy cấu trúc cuối cùng là acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic, như được trình bày trong tài liệu tham khảo.
Bảng 3.3.1 So sánh số liệu NMR của hợp chất 1 với tài liệu tham khảo
(Pyridine) [41] δ H (ppm) ( J , Hz) δ C (ppm) δ H (ppm) ( J , Hz) δ C (ppm)
Hình 3.3.4 Công thức cấu tạo của hợp chất 1 (VB4 hay LB1.1)
Hợp chất 2 (VB1) được thu nhận dưới dạng bột vô định hình màu trắng với công thức phân tử C13H12O2 (M = 200) Phân tích phổ 1H NMR cho thấy có 8 proton vòng thơm, với tín hiệu cộng hưởng ở vùng trường thấp δH 6,70 (4H, d, J = 8,0) và δH 6,99 (4H, d, J = 7,5), cho thấy sự hiện diện của 2 cặp vòng thơm với proton ở vị trí meta và ortho Ngoài ra, hợp chất còn có một nhóm -CH2 với tín hiệu δH 3,77 (2H, s, H-1′′), trong khi cầu nối methylene tại vị trí C-1′′ được xác định qua tín hiệu 41,1.
Phổ NMR của hợp chất VB1 cho thấy tín hiệu tại 33 ppm của phổ ^13C, giúp xác định vị trí gắn của cầu nối methylene trong cấu trúc 4-hydroxyphenyl So sánh với dữ liệu đã công bố trong tài liệu tham khảo, kết quả cho thấy hợp chất VB1 được xác định là 4,4′-dihydroxydiphenylmethane.
Bảng 3.3.2 So sánh số liệu NMR của hợp chất 2 với tài liệu tham khảo
Hợp chất VB1 (MeOD) 4,4′-dihydroxydiphenylmethane
((CD 3 ) 2 CO) [50] δ H (ppm) ( J , Hz) δ C (ppm) δ H (ppm) ( J , Hz) δ C (ppm)
Hình 3.3.5 Công thức cấu tạo của hợp chất 2
Hợp chất 3 (VB2) là bột vô định hình màu trắng với công thức phân tử C13H12O2 (M = 200) Phân tích phổ 1H NMR cho thấy có 8 proton vòng thơm với các tín hiệu cộng hưởng tại δH 7,04 (2H, d, J = 7,0, H-2′, 6′), δH 7,02 (1H, d, J = 7,5, H-6), δH 6,99 (1H, d, J = 7,5, H-4), δH 6,97 (2H, d, J = 7,5, H-3, 5) và δH 6,96 (2H, d, J = 7,5, H-3′, 5′), cho thấy có 2 cặp vòng thơm So sánh dữ liệu phổ NMR của VB2 với VB1 cho thấy sự khác biệt ở vị trí nhóm hydroxyl tại C-4 (VB1) và C-2 (VB2), dẫn đến kết luận rằng VB2 là 2,4′-dihydroxydiphenylmethane.
Bảng 3.3.3 So sánh số liệu NMR của hợp chất 3 với tài liệu tham khảo
Hợp chất VB2 (MeOD) 2,4′-dihydroxydiphenylmethane
((CD 3 ) 2 CO) [21] δ H (ppm) ( J , Hz) δ C (ppm) δ H (ppm) ( J , Hz) δ C (ppm)
35 Hình 3.3.4 Công thức cấu tạo của hợp chất 3
BÀN LUẬN
Về chiết xuất cao tổng và cao phân đoạn từ vỏ thân của cây Polyscias
Khóa luận này nghiên cứu thành phần hóa học của vỏ thân cây Đinh lăng răng, mặc dù theo y học cổ truyền, bộ phận được sử dụng chủ yếu là rễ Sự khác biệt này mở ra những tiềm năng mới trong việc khai thác giá trị dược liệu của cây Đinh lăng.
Tri thức dân gian tại Thái Bình cho thấy cây Đinh lăng răng, đặc biệt là phần trên mặt đất (thân và lá), được sử dụng để tăng cường sức khỏe, nâng cao sức đề kháng và giảm đau đầu, mệt mỏi Khóa luận này tập trung vào việc phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất trong vỏ thân cây Đinh lăng răng, nhằm làm rõ các thành phần có tác dụng sinh học của cây được trồng và thu hái tại Thái Bình.
Bộ phận rễ của cây Đinh lăng thường được chế biến bằng cách sao khô hoặc ngâm rượu, trong khi người dân Thái Bình thường sắc lấy nước Mặc dù rễ cây đã được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học, phần trên mặt đất như lá và thân cây lại ít được chú ý Để đóng góp thêm vào nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Đinh lăng, khóa luận này tập trung vào việc phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất ở vỏ thân cây Khóa luận áp dụng phương pháp chiết siêu âm thay vì các phương pháp chiết thông thường nhằm nâng cao hiệu quả nghiên cứu.
Saponin là hợp chất đặc trưng có nhiều trong họ Nhân sâm và chi Đinh lăng, với tiềm năng nghiên cứu về hoạt tính diệt khối u, bảo vệ gan, tan máu và chống viêm Ngoài ra, saponin còn giúp giảm cholesterol trong máu và có thể được sử dụng làm chất bổ trợ trong vắc xin Nhóm nghiên cứu mong muốn tách chiết các saponin từ vỏ thân cây Đinh lăng.
Nghiên cứu “Nghiên cứu quá trình trích ly saponin triterpenoid tổng từ lá đinh lăng với sự hỗ trợ của kỹ thuật siêu âm” của Ths Hà Thị Thanh Nga và các cộng sự vào năm 2020 cho thấy rằng phương pháp siêu âm mang lại hiệu quả vượt trội trong việc trích ly các hợp chất saponin triterpenoid, gấp 2,5 lần so với phương pháp truyền thống không sử dụng siêu âm.
Nghiên cứu cho thấy thời gian siêu âm tối ưu cho mẫu lá Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms là 20,75 phút; nếu kéo dài đến 30 phút, hiệu suất trích ly saponin triterpenoid sẽ giảm Khóa luận thực hiện siêu âm trong 30 phút cho mỗi lần, đồng thời sử dụng vỏ thân thay vì lá và dung môi Ethanol 96% thay vì nước như trong nghiên cứu trước Sự khác biệt về tần số siêu âm của máy cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả Để khẳng định tính tối ưu của quá trình chiết suất saponin trong vỏ thân cây Đinh lăng, cần thực hiện thêm các nghiên cứu đánh giá trên nhiều yếu tố như nguyên liệu, dung môi, thời gian chiết, thời gian ngâm và tần số siêu âm.
Khóa luận sử dụng dung môi chiết là ethanol 96% vì những lý do sau:
Theo cuốn “Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ” của Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), các nhà hóa học thường sử dụng dung môi ancol 80% (ethanol, methanol) để chiết xuất toàn bộ các hợp chất trong cây Loại dung môi này có khả năng thấm xuyên qua màng tế bào thực vật và tạo cầu nối hydrogen liên phân tử với các nhóm phân cực khác nhau, do đó được coi là dung môi vạn năng.
Ethanol là một dung môi lý tưởng cho quá trình chiết xuất hợp chất thiên nhiên nhờ vào khả năng chiết xuất cả hợp chất có độ phân cực mạnh, vừa và yếu Theo cuốn “Chiết xuất và phân lập hợp chất thiên nhiên” của TS Đỗ Quyên, việc lựa chọn dung môi chiết cần dựa vào độ tan của chất cần tách, độ an toàn, tính dễ thao tác, độ tinh khiết và hiệu quả kinh tế Mặc dù ethanol dễ cháy và có thể gây nổ, nhưng nó vẫn được ưa chuộng nhờ vào độ tinh khiết cao, giá thành thấp và khả năng tự phân hủy, trở thành dung môi phổ biến nhất trong “chiết xuất xanh” Do đó, nhóm nghiên cứu đã quyết định sử dụng ethanol thay vì methanol.
Đinh lăng là một loại cây có giá trị dinh dưỡng cao, được người dân Thái Bình sử dụng bằng cách sắc lá và thân với nước để uống, trong khi rễ được ngâm trong rượu ethanol Tuy nhiên, theo TS Đỗ Quyên, phương pháp chiết xuất bằng nước có nhiều hạn chế so với chiết xuất bằng ethanol, điều này cho thấy cần nghiên cứu sâu hơn về hiệu quả của các phương pháp chiết xuất khác nhau để tối ưu hóa lợi ích sức khỏe từ cây Đinh lăng.
Nước không phải là dung môi lý tưởng cho việc chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học, vì nó khó thấm vào dược liệu hơn ethanol và chỉ hòa tan được nhóm chất phân cực Để tăng khả năng hòa tan các chất kém phân cực, cần phải tăng nhiệt độ chiết, nhưng điều này có thể dẫn đến nguy cơ nấm mốc cao trong dịch chiết nước nếu quá trình kéo dài Hơn nữa, nhiệt độ sôi cao của nước cũng gây khó khăn trong việc làm khô khi cất quay thu hồi dung môi Do đó, nhóm nghiên cứu đã chọn ethanol 96% để chiết cao toàn phần thay vì nước, mặc dù nước là dung môi truyền thống được người dân Thái Bình sử dụng để sắc thân và lá cây Đinh lăng trong sinh hoạt.
Về phân lập một số hợp chất từ vỏ thân của cây Polyscias guilfoylei
Khóa luận lựa chọn phân đoạn n-butanol để phân lập hợp chất vì một số lý do sau:
Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của phân đoạn ethyl acetat từ cây Đinh lăng răng đã được thực hiện, và khóa luận này tiếp tục khám phá các phân đoạn khác nhằm bổ sung và hoàn thiện cơ sở dữ liệu về thành phần hoá học của cây.
- Saponin là nhóm hợp chất đặc trƣng và xuất hiện nhiều trong các loài thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) và chi Đinh lăng (Polyscias) [40], là nhóm hợp chất tiềm
Saponin có nhiều hoạt tính tiềm năng trong nghiên cứu, bao gồm khả năng diệt khối u, bảo vệ gan, tan máu và chống viêm Ngoài ra, chúng còn giúp giảm mức cholesterol trong máu và có thể được sử dụng như chất bổ trợ trong vắc xin Các hợp chất saponin thường tập trung tại phân đoạn n-butanol, do đó, việc nghiên cứu phân đoạn này từ vỏ thân cây Đinh lăng sẽ giúp phân lập các hợp chất saponin hiệu quả.
Trong nghiên cứu này khóa luận có sử dụng HPLC điều chế để phân lập đoạn VB19-
150 đến VB19-205 do các nguyên khách quan nhƣ sau:
Trong quá trình tách các phân đoạn VB19-150 đến VB19-205 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), các vết saponin cho thấy giá trị Rf tương đối gần nhau Do đó, để tách hiệu quả trên cột pha đảo, yêu cầu chiều dài cột phải rất lớn Việc thay đổi hệ dung môi cũng gặp nhiều khó khăn, vì hệ dung môi hiện tại đã cho kết quả tách biệt tốt hơn so với các hệ dung môi khác đã được khảo sát.
- Khóa luận đã xem xét tới việc sử dụng TLC điều chế tuy nhiên saponin không bắt
UV - 254nm cũng như UV- 365nm nên không phải phương án khả thi
Nhóm nghiên cứu nhận thấy rằng việc sử dụng HPLC điều chế mang lại nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp khác, bao gồm tiết kiệm thời gian và khả năng theo dõi thời gian lưu cũng như lựa chọn các peak tách nhau trong quá trình chạy Điều này góp phần nâng cao hiệu suất và hiệu quả tách chất Kết quả thực tế cho thấy khóa luận đã thành công trong việc phân lập hai hợp chất 4,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB1) và 2,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB2), cả hai đều thuộc nhóm phenolic Đối với việc không tách được saponin từ phân đoạn VB19-150 đến VB19-205, nhóm nghiên cứu đã đưa ra một số lý do để giải thích.
Khóa luận đã thực hiện nhiều cột pha đảo và TLC trước khi quyết định sử dụng HPLC để điều chế Quyết định này cũng là một trong những nguyên nhân dẫn đến việc giảm lượng mẫu chạy HPLC, với tổng lượng mẫu được sử dụng cho HPLC điều chế là 120,34 mg.
Saponin là các phân tử có trọng lượng phân tử lớn, do đó, để đo phổ NMR của chúng, cần ít nhất khoảng 10mg chất.
- Thứ 3, do bản thân thiết bị máy HPLC không đƣợc sử dụng hết đƣợc lƣợng mẫu đem tách chất
Khóa luận không thể tách các phân đoạn có khối lượng đủ lớn để xác định sự hiện diện của saponin, điều này giải thích vì sao các phân đoạn số 1 và 3 được đo phổ nhưng không thu được kết quả như mong đợi.
Về các hợp chất xác định đƣợc trong vỏ thân cây Đinh lăng răng Polyscias
Nghiên cứu này đã áp dụng kỹ thuật sắc ký cột và HPLC để phân lập các hoạt chất từ phân đoạn n-butanol của dịch chiết ethanol từ vỏ thân loài Polyscias guilfoylei cv quinquefolia Sử dụng hạt silica gel và RP-C18 làm chất nhồi cột, nghiên cứu đã xác định ba hợp chất, trong đó có acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (VB4) thuộc nhóm saponin, cùng với hai hợp chất phenolic là 4,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB1) và 2,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB2) Hợp chất VB4, còn gọi là Kalopanax Saponin E hay Spinasaponin A, lần đầu tiên được phân lập bởi Shao Chun-Jie và cộng sự vào năm 1989, và hiện tại rất ít nghiên cứu ghi nhận về hợp chất này trên thế giới Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Thị Ánh Tuyết (2009) đã phân lập hỗn hợp chứa hai saponin tương tự Ngoài ra, hợp chất này cũng được tìm thấy trong các nghiên cứu khác từ cây Đinh lăng và cây Sâm vũ diệp Đây là lần đầu tiên hợp chất tinh khiết VB4 được phân lập từ loài Polyscias guilfoylei.
Hợp chất 4,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB1), hay còn gọi là Bisphenol F (BPF), có cấu trúc tương tự như bisphenol A (BPA), như thể hiện trong Hình 4.3.1 Bên cạnh đó, hợp chất 2,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB2) được biết đến với tên gọi 2,4'-bisphenol F.
Bisphenol A, một chất làm dẻo có mặt trong bao bì nhựa, đã được ghi nhận có thể gây hại cho sức khỏe con người, bao gồm rối loạn nội tiết tố và các vấn đề tâm thần kinh Vì vậy, nhóm nghiên cứu đã đặt câu hỏi về nguồn gốc của bisphenol F (VB1) và 2,4'-bisphenol F (VB2), liệu chúng có phải là thành phần tự nhiên có trong cây hay chỉ là tạp chất trong quá trình nghiên cứu.
Hình 4.3.1 Cấu trúc hóa học của hai hợp chất Bisphenol A và Bisphenol F
Năm 1993, trong G Faberi, một loại thuốc dân gian Trung Quốc chữa rắn độc cắn, đã phát hiện Bisphenol F (VB1) Đến năm 1995, G elata, một vị thuốc cổ truyền của Trung Quốc dùng để điều trị co giật, uốn ván, nhức đầu, chóng mặt, tê bì chân tay và đau do thấp khớp, cũng được ghi nhận chứa bisphenol.
Năm 2002, trong thân rễ của Coeloglossum viride var Bracteatum, một vị thuốc cổ truyền của người Tây Tạng chữa ho và hen xuyễn, đã phát hiện Bisphenol F Đến năm 2008, C L Lee và các cộng sự đã phân lập 26 hợp chất từ loài X Strumarium, trong đó có 4,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB1) và 2,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB2) Vào năm 2016, BPF được phát hiện trong mù tạt từ hạt Sinapis alba với hàm lượng 8 mg/kg, và có thể loại trừ nhiễm bẩn từ sản phẩm thô hoặc bao bì Mặc dù các nghiên cứu đã chỉ ra sự hiện diện của VB1 và VB2 trong các loài thuốc cổ truyền Trung Quốc, nhưng hầu hết chưa loại trừ khả năng chúng là tạp chất do dung môi hoặc nhiễm bẩn từ bao bì; chỉ có một nghiên cứu khẳng định loại trừ được nhiễm bẩn từ sản phẩm thô và bao bì.
Các tạp chất như dialkyl phthalat, tri-n-butyl phosphat và tri-n-butyl acetyl citrat thường được sử dụng làm chất làm dẻo trong bao bì chứa dung môi và hóa chất Đặc biệt, dung môi methanol thường có di(2-etylhexyl)phthalat là một tạp chất phổ biến.
Quyên, hai tạp là chất hóa dẻo thường gặp trong nghiên cứu là esterphthalat và dioctylphthalat [6]
Nhóm nghiên cứu đã tiến hành kiểm tra TLC pha đảo để xác nhận khả năng phân lập 4,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB1) và 2,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB2) như các thành phần có trong cao chiết từ vỏ thân cây Đinh lăng răng Polyscias guilfoylei.
Bước sóng 254 nm Bước sóng 365 nm Hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 10%
Hình 4.3.2 Hình ảnh TLC pha đảo của cao toàn phần vỏ thân Polyscias guilfoylei; 4,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB1) và 2,4′- dihydroxydiphenylmethane (VB2)
Kết quả thực nghiệm cho thấy cao tổng vỏ thân cây Đinh lăng (Polyscias guilfoylei) chứa hai thành phần chính là 4,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB1) và 2,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB2) Tuy nhiên, chưa thể loại trừ khả năng hai thành phần này có mặt trong dung môi ethanol 96% dùng để chiết xuất Trong thời gian hạn chế của khóa luận, nhóm nghiên cứu chưa thực hiện được thí nghiệm để xác định sự hiện diện của VB1 và VB2 trong dung môi chiết này Hai hợp chất này đã được chứng minh có tác dụng rối loạn hệ nội tiết, và mức độ ảnh hưởng phụ thuộc vào hàm lượng của chúng trong dược liệu cũng như khối lượng dược liệu sử dụng Do đó, cần tiến hành thêm nghiên cứu để khẳng định sự có mặt của hai hợp chất này.
Cần tiến hành nghiên cứu định lượng để xác định hàm lượng của hai hợp chất trong vỏ thân cây Đinh lăng răng và đánh giá độc tính của chúng.
