-■c -ÍM Qỉ ugc V Hl LỜI CĂM ƠN Lời đầu tiên, em xin bây to lòng biết on sáu sẳc tới Ban Giám hiệu trưởng Đại học Y Hà Nội phông Quan lý Đào tạo Thầy Cô cua môn (là dạy dỏ chi bao em suốt năm học tập tu dường mái trường Đại học Y Hà Nội Trong suốt trinh hục tập vã thực khóa luận Trung tàm Nghiên cứu Gen - Protein, em đà dược tạo điều kiện thuận lụi nhộn dược chi bao tận tình cua cãcThầy Cơ anh chị Với trân trọng bict cm cm xin gửi lòi cam ơn sâu sác tới TS Nguyền Thu Thủy người trục tiếp hưởng dần em suốt trinh thực khóa luận, người đà lụn tinh giúp đò chia sẻ cho em kinh nghiệm hữu ich vá gõpý tâm huyết giúp em hoãn thành tot khóa luận cua minh Lởi cuối củng, em xin gưi lời cam ơn tói gia dính, bạn bẽ vã người thân đà ln dộng viêạ khích lộ tạo chỗ dựa vừng cho em suốt trinh học tập vã hồn thánh khóa luận Hà Nội tháng 05 nám 202ỉ Sinh viên Nguyễn Thị Anh -ÍM Qỉ ugc V Hl CỘNG HÒA Xà HỢI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Dộc lập - Tự - Hạnh phúc ******* LÒI CAM ĐOAN Kính gũrỉỉ Phịng Quan lý Đào tạo Đại hục - Trường Dại học Y Hà Nội Hội (lồng chấm khóa luận tốt nghiệp Tòi Nguyen Thị Anh sinh viên khoa Kỹ thuật y học Trường Đại học Y llà Nội, xin cam đoan: Đây lã khóa luận trực tiếp thực hướng dan cùa TS Nguyen Thu Thúy Còng trinh nghiên cứu khơng trùng lặp với bất kí nghiên cửu khác dà còng bố lại Việt Nam Hà Nội ngày 20 tháng 05 nám 2021 Người viết khóa luận Nguyễn Thị Anh -c -ÍM Qỉ ugc V Hl DANH MỤC CÁC CHỦ VIẾT TÁT HCC Hepatocell Carcinoma TERT Telomerase reverse Transcriptase HBV Hepatitis B virus HCV Hepatitis c virus Vascular endothelial growth factor VEGF DNA Dioxyribonucleotide acid mRNA Messenger ribonucleic acid TF Transcription Factor A FBI Aflatoxin Bl CT Computed Tomography- MRI Magnetic Resonance Imaging ALPPS Associating liver partition and portal vein ligation for staged liepatectomy OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate ddNTP Dideoxy ribonu Cleo tide triphosphate bp Base paữ Kilo base kb r-u -ÍM Qỉ ugc V Hl MỤC LỤC -ÍM Qỉ ugc V Hl DANH MỤC BÀNG r-u -ÍM Qỉ ugc V Hl DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hĩnh ảnh vi thê tế bào gan trường họp ung thư biếu mô te bảo gan ĐẠT VÁN ĐẼ Ngày ung thư cho nguyên nhãn gày tư vong hãng đầu toàn giới Sỗ ca mắc ung ihtr vã sổ ca tư vong ung thư dự kien sè lâng nhanh dân số dang tiếp tục tảng lên giả vã áp dụng hành vi lỗi sống làm tàng nguy ung thư: Trong loại ung thư nay, ung thư biêu mô te bào gan (Hepatocellular carcinoma - HCC) bệnh ung thư rat bicn Theo Globocan 2020 sổ ca mắc ung thư gan 905677 ca, chiếm 4.7% số ca mắc càc bệnh ung thư sổ ca tư vong ung thư gan 830180 ca chiếm 8.3% số ca tư vong ung thư thề giới Tý lệ mấc ung thư biêu mõ tể bão gan thay đôi theo khu vực dịa lý chiếm tỹ lệ cao cảc khu vực phát triên Sự hình thành khối u cua ung thư bicu mõ tề bảo gan lã trình phức tạp liên quan đến nhiều yếu tố nguy như: nhiềm virus viêm gan B viêm gan c Aflatoxin Bl dột biên gen bệnh gan nhiễm mờ không rượu, Đen che gày ung thư biếu mõ tế bào gan chưa dược làm sảng tò < Chinh vi việc xảc định nguồn gỗc tiên phát cua bộnh het sức quan trọng Chânde đoản sớm ung thư biêu mò tế bào gan cịn gãp lỉhiều khó khản the, bời việc xác triệu định chững dược lãm sàng yếu thường tổ nguy xuất tữ bẽn muộn Vì (TERT) lã cầp mà hóa thiết cho tiêu Gen Telomerase dơn vị xúc reverse tãc cua transcriptase enzyme phiên mà ngược cua enzym telomerase telomerase Sự biểu xay ởvũng cua tế gen bảo TERT mẩm và ung hoạt thư’ hỏa Ỡlã hoạt tế telomerase bão ung thư xay biêu mạnh mè quã dẫn mức đến cúa TERT tâng lãm sinh kích khơng lợi cho giới hạn xảm cua lan tể bão di cân ung cùa thư khối từ dớ u tạo Dột diều biến kiện vùng thuận promoter phát sinh gen ung TERT thư biêu dược mị cho tế bào có gan ánh hướng dền loại quã ung trinh thư khác cần thiết Xác Việc xác có ý định nghía đột chân biến đoán vùng phát promoter gen sớm TERT ung thư đê đề có tài phương nghiên pháp cứu: điều "ỉ ng trị dụng hiệu kỹ qua thuật cho giãi bộnh trìnlt nhân Do tự gen phát hiệu dột mò biển vùng promoter ” thực gen TERT vói mục bệnh tiêu: nhân ung thư định biêu dược mô đột tế biển bào gan promoter gen TERT ưẽn bệnh CHlTơNG TÔNG QUAN 1.1 Tồng quan ung thir biếu mõ tế bào gan 1.1 J Sơ lược ung thư hiểu mô tể bào gan Gan phận quan trụng thê cầu tạo từ loại tế bão chinh: te bào gan tế bão nội mô tế bão Kupffer vã tế bào hĩnh Mồi loại tế bão sơ hữu chức nâng l iêng biệt, hợp tác điều hỏa chức nâng gan nhiều cấp độ Gan thực nhiều chức nâng thiết yếu, bao gồm san xuất mật điều hòa protein glucose huyết tương, chuyên hóa si nil học cua thuốc vã chất dộc Gan quan dầu tiên tiếp xúc -ÍM CỊỈ ugc V Hl với cãc chất dinh dường dược hấp thụ qua dường ruột xcnobiotics thông qua tinh mạch cứa Do chi cẩn phối hợp lệch nhịp, chức nâng gan sè gập vần dề Đó lã hội đê cảc bệnh lý gan tiến triền Ưng thư biểu mõ tế bào gan (HCC) lã ung thư gan nguyên phát phổ biển nhất, chiếm 75% - 85% trường hợp ung thư gan ' Quá trinh hình thành ung thư biêu mò tế bào gan trinh pliửc tạp cớ liên quan đến số yếu tổ cân nguycn dó dẫn dền hoạt hóa khơng bính thưởng cùa dưỡng te bào phản tư khác nhau, phá vờ cân giừa hoạt hóa vã bất hoạt cua gcn sinh ung thư gen ức chế ung thư tương ứng Ví ung thư biêu mơ tế bào gan thường xây bệnh lý gan xơ gan hầu het bệnh nhân đưục chân doán giai đoạn muộn cùa bệnh, nên tiên lượng thưởng kẽms Ưng thư biêu mõ tề bãơ gan ngày gia lâng vẽ tỳ lệ mằc vã có tỷ lộ tứ vong rẩt cao Theo Globocal 2020 Việt Nam, ti lệ ung thư gan mắc 14.5% (26.418 ca), phân chia theo giới thi nam chiếm 20.5% (20.256 ca) nừ 7.4% (6.162 ca) Ti lộ tư vong cua ung thư gan năm 2020 nước ta lên tới 20.6% Và ung thư gan loại ưng thư có tý lộ mắc tư vong ung thư cao loại ung thư Việt Nam t0 tinh nhạy câm cua giới đỗi với HCC tẩt cã vùng dịa lý nam cỏ ti lệ mắc bệnh cao nừ Ti lệ nam : nữ xấp xi : : khu vực Châu Á - Thái Bình Dương Châu Phi cận Sahara : cãc khu vực cỏ ti lộ mầc HCC thấp Nhưng lý mã nam giới có nguy phát triển HCC cao nừ giới vần chưa làm sáng to có the giai thích phần xem xét tý lệ cãc yếu tổ nguy HCC nam giới nhiễm viêm gan B (Hepatitis B virus HBV) viém gan c (Hepatitis c virus HCV) hút thuốc vã uổng rượu thưởng cao nữ giỏi vai trở cua nội tiết tố androgen việc thúc ticn tricn thành ung thư bicu mò te bào gan nam giới tim hiêu n 1.12 Nguyên nhản gáy bệnh Một số yếu tố nguy có liên quan đến phát triền vã tiến triển cua HCC đặc -ÍM CỊỈ ugc V Hl biệt xiêm gan virus tính, viêm gan không virus, uổng rượu tinh, sổ tinh trạng bệnh định (béo phi tiêu đường), vã tiêu thụ mặt hàng lực bị nhiễm độc tổ 1.12.1 Viẻni gan virus Nhẻm virus viêm gan B tinh (HBV) lã yếu tố nguy cãc nước dang phát triên Trung Qc vã An Độ (5 cãc nước dã phát triên ung thư biêu mô tế bào gan chu yếu phát triền từ xơ gan virus viêm gan c bệnh gan nhỉcm mờ không rượu Virus gảy raxiêm bệnh gan viêm Bmò gan vàgia xirus virus viêm dần!:gan đền c sựlà phát nguyên triền nhản cua xơ HBV gan vã ung HCV thư cõ thê biêu tham tế bảo xàogan việc Các protein cua xirus chiếm quyền điều khiên máy tế bào Sự công cùa virus cỏ the trực tiếp gảy phát triển mỏ xơ gan thòng qua việc giai phông cãc cytokine tiền viêm Ty lộ mắc I ICC tăng mạnh nhùng thập ky gần dây dược cho lả nhiễm HCV tinh Đo dó nhiễm HCV mãn tính yếu tố nguy chínlì cho pliât triển HCC Mồi năm có tử 4-5% bệnh nhản viêm gan c tinh phát triên thảnh HCC Các dầu hiệu huyết cua nhiễm HCV bệnh nhân HCC dao dộng từ 27% đến 80% nhicm HCV làm lãng nguy phát triển HCC ước tinh gấp 17 lần so với người khoe mạnh 13 Nhiẻm virus xiêm gan B tinh chiếm it nhắt 50% trưởng hợp ung thir biêu mõ tề bào gan ưên toàn the giới Các yểu tổ từ virus viêm gan B thủc dẩy HCC bao gồm nhi cm trũng kẽo dài mức dộ chép virus viêm gan B tảng, tich họp DNA cua xirus xảo gen vật chu dột bicn HBV cãc oncoprotein mà hỏa bin hộ gen cua HBV Viêm gan tái phát phan ủng miền dịch cua vật chu ưong trinh nhiễm HBV tinh cỏ dần den xơ gan dồng thời dây nhanh toe độ lảm te bào gan thúc dẩy tích tụ đột biến ỉ4 1.1.2.2 Rượu Uống rượu có hại cho sức khoe, lâu dần dản đến xơ gan sau dỏ ung thư biêu mò tế bào gan Bệnh gan rượu lả ưong nhùng nguyên nhàn hàng dầu cua HCC -ÍM CỊỈ ugc V Hl Theo nghiên cứu lạm dụng rượu (uống 50 - 70 g / ngày thởi gian dài) có liên quan dến việc tảng nguy mắc ung thư biêu mô tế bão gan gấp lần 15 Ethanol nguyên chất không trực tiếp gáy viêm tòn thương gan nhiên, sân phàm phụ dộc hại cua q trinh dị hóa rượu tích tụ acetaldehyde gốc tự có the anh hưởng đến trinh stress oxy hỏa Ngoải quã trinh dị hóa rượu tác dộng den sổ bước chuyến hỏa lipid, dần đến gan nhiẻm mở ức chế trinh oxy hỏa axit bẽo 16 1.12.3 Aflatoxin Bỉ Aflatoxin giãi phóng từ thực phàm bị nhicm nẩm Aspetgillus ílavus vả Aspergillus parasiticus Một loạt biến đỏi hóa học xảy dần đến việc hĩnh thảnh chắt bò sung vả chât trung gian 26 Aflatoxin Bl chu yếu gày dột biến codon 249 gen ức chế khối u TP53 (AGG thảnh AGT) dần đến thay the arginine thành serine ( đột bicn R249S) diều dược quan sãt thầy cãc bệnh ung thư khác IICC Dột biến R.249S chiếm 50-90% đột biến TP53 dược tìm thấy HCC từ vũng có mức độ phơi nhiễm aflatoxin cao Ty lộ dột biến giam xuống 6% bệnh nhàn HCC Hoa Kỳ Cùng có tương tác mạnh mè giừa việc tác dụng hiệp dồng cua aflatoxin với HBV nguy gày ung thư biểu mô tể bào gan Nhiễm HBV tính có the tạo cytochrome P45OS chun hóa AFB1 khơng hoạt dộng thành AFB1 - S.9 - epoxit gãy dột biến Hoại tư tải tạo tế bào gan nhiễm HBV mãn tính làm tâng xác suất đột biến TP53 AFB1 gãy 1.12 Triệu chứng tônt sàng Chânđau thức doãn bin hâu sớm hèt vàtãn diều bệnh trị nhản hiệu khơng qua có HCC triệu vần chứng cỏn lã vã biêu thách lãm giai sảng đoạn xay' nặng, cảc triệu giai chứng doạn tiền phát triển cua lâm bệnh sàng (í bao gồm nghèn, rối bụng loạn mơ hổ vủng huyết hạ vã sườn sốt phai, không gan rỏ to nguyên vàng nhản da tắc Các triệu chán ân chứng buồn không nôn dặc thờ hiộu vã sụt bệnh cân ảc thường tinh tiến tồn triền Bệnh biết nhân xư có gan the khơng cỏ biêu dirợc hiộn phát cua gan bủ xơ Các gan biến bú chừng đà bao gồm tấc tinh mạch gan tiến triển thành hội chủng Budd-Chiari vã thường xuyên xâm lẩn tihh mạch cưa vã huyết khối1S 1.1.4 Cliấn đốn ung thư biển mơ tể bào gan -ÍM CỊỈ ugc V Hl 31 - Hình anh diện di 3.3 cho thầy sán phàm PCR chi gồm I bảng DNA đặc hiệu, tương dối rò nét kích thước khoang 363bp tương ửng với đoạn DNAđích cần khuếch đại so sánh vói thang DNA chuẩn Điện di sán phẩm khuếch đại vùng promoter gcn TERT lừ 21 mẫu DNA lại cho kết tương lự Như vậy, san phàm PCR thu dược dam bao chất lưạng lốt cho kỳ thuật giúi trinh tự dế xác định dột biến vùng promoter gcn TERT 3.4 Kct xác định dột biến vùng promoter gen TERT San phẩm cua trình PCR sau dược diện di kiêm ira chất lượng sè dược tiep lục sứ dụng cho phan ứng khuếch đại gan huỳnh quang đoạn gcn can giái trinh tự sư dụng moi TERT-F Sán phàm giai trinh tự tinh trước cho vào máy giãi trình lự gcn tự dộng Sau thu kct qua trinh tụ đoạn gcn đổi chiều so sánh với trinh tự gcn TERT chuân (NG 009265) trẽn GcnBank bang phan mềm CLC Main Workbench 6.0.1 Kct quà giai trinh lự cùa dạng đột bicn phát dtrực the hình 3.4.3.5.3.6 |-145C>T |-124C>T P NG_00926S-TERT IGACCCCTCCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAi Consensus :GACCCCTCCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCA< Coverage UTG1 :GACCCC TCCCGCGT CCCCGGCCC AGCCCCC T CCGGGCCC T CCC A* Hìnlt Kct quà giai trìnli tirgen cùa mầu bệnh nhân UTG1 Nhận xét: Mầu-124 giai trinh tựràng, gen cua bệnh ƯTGTại cho qua -146 tín hiệu vả cácchi đinh córị dinh khơng tín bịnhãn nhiều cáckết vị trí -ÍM CỊỈ ugc V Hl 32 hiệu tương ứng với nucleotide c (Hình 3.4) Như mầu UTG khơng có dột biến -146OT vả -124C>T (ã144OT 12ôOT r > W.OOWW-TERT GTCCCGACCCCTCCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCC CorT r14«C>T r124C»T NG_OƠ»tó-TERT rCCCGACCCCTCCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCT CCCA< Conscmu* Coverage ƯĨG21 rCCCGACCCCTTCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAI Traco đau Hình 3.6 Kết giãi trinh tựgen cha mẫn bệnh nhân UTG 21 Nhận xét: -ÍM CỊỈ Qỉ ugc -■c -ÍM ugcVVHl Hl 33 Mau giái trinh tự gcn cua bệnh nhân ƯTG 21 cho kết qua tín hiệu dinh rị ràng, khơng bị nhiều Tại vị trí-146 cỏ đinh tín hiệu tương ứng vớinucleotide c T vị trí-124 chì có dinh tín hiệu lương ứng với nucleotide c (Hình 3.6) Như mẫu UTG có dột biền -146OT không cỏ đột bién-124C>T Báng 3.3 Kẻt qua xảc định đột biền vùng promoter gen TERT Mà bệnh Vị trí dột biền nhân Dạng Mả bệnh đột nhân Vị trí dột biển Dạng đột biền biến UTG UTG2 Không phát -124OT Dị hợp ƯTG 16 Không phát Dị hợp Dị hợp ƯTG 17 -1240T Dịhựp ƯTG3 Không phát DỊ hợp ƯTG 18 Không phát Dị hợp ƯTG4 Không phát Dị hợp ƯTG 19 Không phát Dị hợp ƯTG5 Không phát DỊ hợp UTG20 Không phát Dị hợp Dị hợp UTG21 -146OT Dị hợp ƯTG6 -124OT ƯTG7 Không phát Di họp ƯTG 22 Không phảt Dị hợp ƯTG8 Không phát Di hợp ƯTG 23 Không phát Dị hợp Di hợp UTG24 Không phát Di hợp Di hợp ƯTG 25 Không phát Dịhựp Di hụp UTG 26 Không phái Dị hựp ƯTG9 UTG 10 ƯTG 11 -124OT Không phát -124OT ƯTG 12 Không phát Dị hợp ƯTG 27 -124OT Dịhựp ƯTG 13 Không phát Dị hợp ƯTG 28 Không phát Dị hợp UTG 14 Không phát Dị hợp UTG 29 Không phát Dị hợp ƯTG 15 Không phát Dị hợp ƯTG 30 Không phát DỊ hợp Ket xác định đột biến vùng promoter cua 30 mầu nghiên cứu tống hợp băng -■c -ÍM CỊỈ ugc V Hl 34 3.3 Dụa trẽn két qua ty lệ đột biến xác định bang 3.4 STT Bang Ti lệ dột biên vùng promoter gen TERT Vị trí dột biến Sổ lượng (mầu) Ti lệ dột biến (%) -124 C>T 20 -146 C>T I 3.33 -124 C>T và-146 C>T 0 Không phát dột biền 23 76.67 Nliộn xét: Kct qua bàng 3.4 cho thấy, ti lộ dột biến vùng promoter gen TERT cùa bộnh nhân HCC lã 23.33% ti lệ không đột biến 76.67% Trong số mầu cớ dột biền 85.71% lã dột biền vị trí -124OT đột biền vị trí - 146C>T chi lả 14.29% Nghiên cửu khơng tim thấy mẫu não có đột biến dồng thời cà vị trí CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Kei qua tách chief DNA Trong nãm gần đây, linh vực sinh học phân tư ngày phát triển dược ứng dụng nhiều ưong chân đoán điều tri bệnh Trong nghiên cứu chủng sư dụng nhùng kỳ Ihuật kinh diên cùa sinh học phàn tư tách chiết DNA khuếch dại gcn giúi tành tự gen bang hộ thống tự động đe có thẻ xác định dược đột biến vũng promoter gen TERT mầu ung thư biêu mô tế bào gan Tách chiết DNA bước dầu tiên có vai trị quan trọng nghiên cửu vi chi mầu DNA tách chiết dược dạt chất lưọng thi' có the thực quy trinh dó PCR giai trinh tự gen Các mầu mò sau dược thu thập sè tách DNA bàng kit -ÍM CỊỈ Qỉ ugc -■c -ÍM ugcVVHl Hl 35 QIAamp® DNA cứa hàng QIAGEN Kết qua tách chiết cho thấy DNA đạt chất lượng tốt độ tinh dam bao lãm khn cho phân ứng khuếch dại gen DNA có thè dược tách chiết từ nhiều loại bệnh phàm như: mầu máu, mẫu mô Tại nghiên cửu tách chict DNA từ mầu mô dược đúc parafin So với mầu mâu ngoại vi thí mầu mơ chứa nhiều tạp chất yểu lổ anh hường đen trinh tách chict DNA ví có mật cùa parìn hay nhùng chất khác q trinh dúc mơ bệnh Tuy nhiên, mầu mơ hỗn tồn dam bao chất lượng dê tách DNA Hom việc báo quan màu mỏ có phần đom gian, dẻ dàng lum thời gian bao quân dài Dê dam bao việc tách chiết DNA không bi anh hương bới parafm kit tách chiết có bước khư parìn bang cách sừ dụng xylen Tuy nhiên, khơng loại trử kha nảng xylen có thè anh hưởng, ức chế trinh PCR giai tành tự gen nên xylcn loại bo cồn 100° Quy trinh tách chiết dược thực theo khuyến nghị cùa nhả sán xuất lối im cùa phòng xét nghiệm đê thu san phàm DNA đạt liêu chuẩn nồng dộ độ tinh Sau thu dược DNA, cần lien hành kiêm tra chất lượng, dộ tinh cùa DNA vừa tách chiết Các phương pháp có thê sư dụng de kiêm tra dó lả đo mật độ quang học điện di DNA lông số sứ dụng mồi nội chuán Trong nghiên cửu chúng lôi sử dụng phương pháp đo mật độ quang học bang mảy Naiio Drop 2000c bước sóng 260nm 280nm de kiểm tra độ linh nồng dộ cua mẫu DNA Phương pháp có ưu diêm nhanh gọn tiện lọi, clễ thực hiên, lại cho kết định lượng DN/\ mà khơng sư dụng hóa chất độc hại ví ethidium bromide phương phãp điện di, Ngoài chúng tơi cịn liến hành kiểm tra mầu DNA tách chiết phương pháp điện di DNA tông số Phương pháp mang im điếm lả có thê biết kích thước tương dối cua DNA kiêm tra DNA cỏ bị dứt gày hay không Tuy nhiên điện di sè cần nhuộm ethidium bromide chill chất dộc gày ung thư trình chụp bàn gcl bàng tia ƯV gây hại cho da vã mắt Bơi quang diện di mang ưu nhược điểm bù trử cho nên tiến hãnh thực ca hai phương phảp đê kiêm tra chất lượng DNA Mầu DNA dạt tiêu chuẩn có độ tinh -■c -ÍM CỊỈ ugc V Hl 36 li lộ A^SỘ/AỊSỘ phái nằm khoang 1,8-2 có nong dộ 50 - IOOng/pl thích hợp dè thực hiộn PCR Ngoái ycu cầu dam bao VC nồng độ, độ linh DNA thu dược côn cần phai trạng thãi nguyên vẹn tối da hạn chế đứt gày cỏ thê Theo kết dược tòng hợp bang 3.1 cho thầy cãc mẫu DNA tách chiết dược đểu có nồng dụ trẽn 50 ng/ụl tương đổi tinh với OD khoang 1.8 - 2.0 Như trinh tách chiết DNA hỗn tồn dáp ứng cảc yêu cầu chất lưựng dế tiếp tục tiến hành kỳ thuật PCR Ker khuếch đại đoạn gen vùng promoter gen TERT PCR biết tới kỹ thuật chép DNA phòng thi nghiệm, cho phép khuếch đại chọn lọc chuồi DNA đích mã khơng cần su dụng càc sinh vật sống đê thực Kỳ thuật nảv gần có thú khuếch đại bất ki gcn thê người Chì với thin gian ngắn, gen đích khuếch đại lên tới hàng triệu ban với việc tiết kiệm thởi gian, cộng với xác độ đậc hiệu, kỳ thuật ngày dược sir dựng rộng rài nghiên cứu y - síah học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, phát cãc bệnh di truyền, chần đốn bệnh nhiềm trũng, tách dịng gen vã xác định huyết thống Các thảnh phần cua phan ứng PCR gồm có DNA khn, đoạn dặc hiệu, czyme Taq polymerase, dung dịch đệm dNTPs nước, chúng lôi sư dụng GoTaq Hot Start Green master mix dã chứa sần dNTPs enzyme Taq polymerase MgChcó nồng độ thích hợp dung dịch đệm có pl phù hợp để rút ngắn bước chuẩn hóa thành phần cùa phán ứng PCR Một mầu DNA phù hợp de tham gia phan ứng khuếch đại có nồng độ 50 - 100 ng/ul Một mẫu DNA có nồng độ q cao sè gây lâng phí gây ức chế phán ứng, ngược lại đổi với mẫu DNA có nồng độ q thấp thí khơng du đế khuếch dụi Vì nhùng mầu có nồng độ cao q thí phái dược tiến hành pha lồng nồng độ thích hợp 50 - lOOng/Ịul Thêm vào mẫu DNA tách chiết không đirực phép lần tạp chắt ức che tnnh PCR dam bao không lần cãc DNA ngoại lai khác Thành phần doạn mồi dặc hiệu với vùng promoter gen TERT thiết ke trinh tự dựa trinh tự gen TER T chuẩn Gcnbank vã sư dụng chức nàng Primer-BLAST cúa trang NCB1 Sau nhận dược mồi từ nhà sán xuất, liến hành pha loảng mồi tối tru hóa nồng độ mối cách mix phân ứng PCR -ÍM CỊỈ Qỉ ugc -■c -ÍM ugcVVHl Hl 37 với nồng dộ mồi khác (2.5 pmol/pl pmol/pl 10 pmol/pl ) thành phần khác mồi không thay dôi nồng độ Neu nồng dộ cao cỏ thè hình thành nhiều san phẩm phụ không mong muốn, ngược lại với nồng độ mồi thấp sc không đu dê khuếch dại DNA Ngồi chúng tịi có bố sung them DMSO de giám nhiệt dộ bắt cập cua tâng hoạt lính enzyme Taq polymerase tâng lính đặc hiệu cùa phan ứng PCR Tất ca phương pháp PCR có chu trinh nhiệt với giai đoạn giống dó là: giai đoạn biến tính, giai doụn gắn mồi giai đoạn kéo dãi Ĩ giai đoạn biến lính, chuồi xoắn kép DNA bị phã vờ liên kết hydro giừa base lách khoi tạo thảnh hai DNA mạch don nhờ trinh táng nhiệt độ lên lởi 93 - 95°c Tại nghiên cứu chúng tỏi lựa chọn nhiệt độ biến tính lã 93°c Khi DNA trạng thải hai mạch dơn giai đoạn gắn mồi bat đầu Từ 93 - 95°c nhiộl độ phan img giám xuống côn 50 - 65 cc 20 40 giây đế mồi gắn vảo sợi DNA đơn Nhiệt độ gắn phai phủ hợp nhiệt độ thấp, mồi sè khơng gắn q cao mồi có the gần không dặc hiêu Thông thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp - CC so với nhiệt độ nông chay cùa mồi Trong nghiên cứu chúng tòi lựa chọn nhiệt độ gẳn mồi 59°c 30 giày Ngay sau gắn mồi enzym Taq polymerase sè bát đầu giai đoạn kéo dài Taq polymerase có nhiệt độ hoạt động tồi ưu 75 - 80 cC nhiệt độ 72°c thường dược lựa chọn Tại giai đoạn Taq polymerase tơng hợp sợi DNA men bị sung với DNA khuôn bang cách thêm dNTP theo nguyên tấc bõ sung theo chiều 5' đến 3' Phan ứng trùng ngưng xay giừa nhóm 5' - phosphate cua dNTP với nhóm 3' - hydroxyl phía cuối cua sợi DNA vừa dược hình thành Thời gian cua giai doạn kẽo dài phụ thu()C vào Taq polymerase độ dài cua doạn DNA cằn khuếch dại Trong nghiên cứu enzym Taq polymerase dược sứ dụng 72°c 30 giày Sau trai qua ba giai doạn cua PCR, thực kiêm tra chẩt lượng san phẩm PCR phương pháp điện di sư dụng marker 100 bp Trong nghiên cửu kết qua diện di dưực chúng lỏi thê mục 3.2 cho thấy mồi giếng điện di chi cò báng DNA sáng, rị nét khơng có bảng phụ kích thước phù hợp -■c -ÍM CỊỈ ugc V Hl 38 với kích thước lý thuyết cưa đoạn gen TERT cẩn khuếch dại lả 363bp so sánh với thang DNA chuẩn Như chúng lôi dà khuếch dại thành công doạn gen vùng promoter gen TERT 4.2 Kef qua xác định dột bỉến vùng promoter gen TERT Quá trinh khuếch dại vùng promoter gen TERT thảnh công lã bước chuẩn bị cho khâu giai trinh tự vùng gen đích Một kết giai trinh tự gen dạt tiêu chuàn lã tín hiệu đinh phai rỗ ràng, tin hiệu thấp, khơng bị nhiều Săn phàm PCR dóng vai trị DNA khn cua phan ứng PCR giai trinh tự gcn yếu tổ anh hường kin tới kết qua cua quâ trinh giai trinh tự Do dó san phàm PCR phái dặc hiệu khơng dược có san phàm phụ dê dam bao kẽt qua giai trinh tự chỉnh xác không bị nhiễu Các thảnh phân phán ứng PCR dư thừa hay san phàm khơng dậc hiệu có the gày nhiều tín hiệu giãi trình tự Chính ví việc tinh san phàm PCR Là phần quan trọng kỳ thuật giai trinh lự Khác với phương pháp giai trinh tự kinh diên tốn thời gian, tốn nhiều kinh phí kỹ thuật giái trinh tự dtrợc thực hộ thống máy tự dộng Uu diêm mang lại dó đơn gian, dề dàng cộng với độ xác cao tiết kiệm nhiều thời gian, tiền bạc Nhưdột kết qua giai trinh tự vùng promoter gen TERT dãtương trinh bảy nét tín trên, hiệu mầu nen giái thấp, trinh tín lự hiệu thu dược dinh với rị hình ràng anh Qua rõ bang thí cỏ 3.3, lởi có 23.33% thè thay mẫu xuất 30 mẫu đột bệnh biền nhân -124C>T nghiên cứu -146C>T -I46OT chiêm Trong 3,33% dó ti Trong lệ đột biền đột diêm biến -I24OT phát chiếm được, 20% lộ ứng biến 85,71% -124OT 14.29% cao Như tý lộ đột cỏ biến thê thấy -146C>T đột phố biến biến vùng promoter ca Trưởng gen TERT hựp thí dột biển lại -trong 124OT lãtỳ -ÍM CỊỈ Qỉ ugc -■c -ÍM ugcVVHl Hl 39 phát đội biến dồng thời ca vị tri-124 vả -146 xay ứ ưong nghiên cứu khơng có mẫu bệnh nhàn mang dồng thời cá hai dột biền Trong nghiên cứu cua Yang vã cộng năm 2016 276 mầu HCC cách giái trinh tự trực tiếp vùng promoter TERT đà phát dược 85 mầu HCC có dột biển -124C>T -146C>T tương ứng 31% Đột biến - I24OT dược phát 84 màu HCC dột biến -146C>T chi phát l mầu HCC Hai dột biến nậy loại trừ lần dột biến vùng promoter gen TERT bệnh nhàn 1ICC cao đáng kc so với bệnh nhản không mắc HCC ;9 Trong nghiên cứu khác cua Huang cộng (2015) 35 mầu HCC bang phương pháp giai trinh tự gen dã phát 31.4% (11/35) mầu cỏ đột bicn promoter gen TERT, sổ dó 81,81% (9/11) dột biển -124OT 18,19% (2/11) dụt biền -146OT w Đột biển TERT dược tim thấy tốn thương liền ung thư vã ung thư biếu mò tế bào gan giai đoạn dầu 51 Đột biến vũng promoter gen TERT coi lả tác nhãn gây biến đôi ãc tinh quan ưọng dà dược dể xuất dấu ấn sinh học ban đầu cho biến dôi tế bão gan ;s Như qua cãc nghiên cứu cua tác giá ưẽn the giới vã nghiên cứu cua chủng tỏi thấy dược đột biến vũng promoter gen TERT xuất hiộn với ti lộ tương dối cao mô ung thư biêu mõ tể bào gan thường gặp ĩlhât lã dột bicn-124C>T Vì khn khố cua khóa luận tốt nghiệp, chi dưa cờ mầu nghiên cửu 30 bệnh nhân nên chưa thê đánh giả xác ty lệ dột biển bệnh nhân IICC Việt Nam ảnh hường cùa đột biến dối với nguy cư HCC Đe có thê đánh giá xác hon, nghiên cứu can dược thực trài cỡ mẫu bệnh nhân lởn tích hợp đánh giá mói liên quan với yểu tố nguy HCC Xác dịnh sớm dột biến vùng promoter gen TERT sè giúp phát sớm bệnh nhàn mắc IICC vả dưa liệu pháp diêu trị sớm thích hợp cho bệnh nhàn KÉT LUẬN Đề gcn tài: “ứng dụng kỹ tliuật giúi trinh tự gen để phát dột hiên biền mô tế vùng bào promoter gan ”đột đàlà gen áp3.33% TERT dụng kỳ bệnh thuật nhân giai ung trinh thư tự bệnh nhân đê phát ung thư biểu mô biến tế vùng bão gan promoter với tý gcn lộ TERT đột biền 124OT 20% -146OT TÀI LIỆU THAM KHÁO -W -ÍM Qỉ ugc V Hl 40 Torre LA Siegel RL Ward EM et al Global Cancer Incidence and Mortality Rates and Trends An update Cancer Epidemiol Biomarkers Prev Jan 2016:25(1): 16-27 doi:I0.1158/1055-9965.Epi-15-0578 WHO World Globocan 2020 2020 Accessed 18/05/2021 -W -ÍM Qỉ ugc V Hl 41 11 Petruzziello A Epidemiology of Hepatitis B Virus (HBV) and Hepatitis c Virus (HCV) Related Hepatocellular Carcinoma Open Virol J 2018;12:26-32 đoi: 10.2174/1874357901812010026 12 Tarocchi M Polvani s Maironcini G et al Molecular mechanism of hepatitis B virus-induced hepatocarcinogenesis World J Gastroenterol Sep 2014;20(33):l 1630-40 doi:10.3748Avjg.v20.i33.11630 13 Bartosch B Thimme R Blum HE et al Hepatitis c virus-induced hepatocarcinogenesis J Hepatol Oct 2009:51(4):810-20 doi: 10.1016/j.jhep.2009.05.008 14 Xie Y Hepatitis B Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma Adv Exp Med Biol 2017;1018:l 1-21 doi:10.1007/978-981-10-5765-6_2 15 El-Serag HB Rudolph KL Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis Gastroenterology Jun 2007;132(7):2557-76 doi:10.1053/j.gastro.2007.04.061 16 Ogunwobi oo Harricharran T Huaman J et al Mechanisms of hepatocellular carcinoma progression World J Gastroenterol May 21 2019:25(19):22792293.doi:10.374&/\vjg.v25.il9.2279 17 Yang JD Hainaut p Gores GJ et al A global view of hepatocellular carcinoma: trends risk, prevention and management Nat Rex' Gastroenterol Hepatol Oct 2019;16(10):589-604 doi:10.1038/s41575- 019-0186-y Dimitroulis D, c Valsami s et at diagnosis problem to treatment for both ofDamaskos hepatocellular carcinoma: AnFrom epidemic -W -ÍM Qỉ ugc V Hl developed and developing world World J Gastroenterol Aug 2017;23(29): 5282-5294 doi: 10.3 748/wjg.v23.129.5282 18 Kirstein MM, Wirth TC [Multimodal treatment of hepatocellular carcinoma] Internist (Berlf Feb 2020:61(2):164-169 Multimodale Therapie des hepatozelluldren Karãnoms doi:10.1007/s0010S-019- 00722-x 19 Dratwa M Wysoczanska B, Lacina p Cl al TERT-Regulation and Roles in Cancer Formation Front Immunol 2020:11:589929 doi: 10.3389/fimmu.2020.589929 20 Heidenrãch B Kumar R TERT promoter mutations in telomere biology Mutat Res Jan-Mar 2017;771:15-31 doi :10.1016/j.mrrev.20l6.11.002 21 Yuan X, Xu D Telomerase Reverse Transcriptase (TERT) in Action: CrossTalking with Epigenetics Im J Mol Sei Jul 2019;20( 13)doi: 10.3390/ij ms2013333 22 Huang FW Hodis E Xu MJ et al Highly recurrent TERT promoter mutations in human melanoma Science Feb 22 2013;339(6122):957-9 doi: 10.1126/science 1229259 23 Horn s, Figi A Rachakonda PS, et al TERT promoter mutations in familial and sporadic melanoma Science Feb 22 2013:339(6122):959- 61 doi: 10.1126/science 1230062 24 Colebatch AJ Dobrovic A Cooper WA TERT gene: its function and dysregulation in cancer J Clin Pathol Apr 2019:72(4):2Sl-284 doi: 10.113 6zjcl inpath-2018-205653 25 Quaas A Oldopp T, Tharun L et al Frequency of TERT promoter mutations in primary tumors of the liver Virchows Arch Dec 2014;465(6):673-7 doi: 10.1007/S00428-014-1658-7 26 Bell RỊ Rube HT Xavier-Magalhàes A eĩ al Understanding TERT Promoter Mutations: A Common Path to Immortality Mol Cancer Res Apr 2016; 14(4):315-2 doi: 10.115 8/15 41- 7786.Mcr-16-0003 -c -ÍM Qỉ ugc V Hl 27 Hafezi F Peiez BercoffD The Solo Play of TERT Promoter Mutations Cells Mar 19 2020;9(3)doi:10.3390/cells9030749 28 Yang X Guo X Chen Y et al Telomerase reverse transcriptase promoter mutations in hepatitis B \irus-associated hepatocellular carcinoma Oncotarget May 10 2016;7(19):27S38-47 doi: 10.18632/oncotarget 853 29 Huang DS Wang z He XJ et al Recunent TERT promoter mutations identified in a large-scale study of multiple tumour types are associated with increased TERT expression and telomerase activation Eur J Cancer May 2015;51(8):969-76 doi:10.1016/j.ejca.2015.03.010 Lombardo D c Giosa D et and al CTNNB1 Frequency of in somatic mutations patients with inSaina TERT hepatocellular promoter TP53 carcinoma from Southern genes 10.3892/O1.2020.11332 Italy Oncol Lett Mar 2020;19(3):2368-2374 doi: -c -ÍM Qỉ ugc V Hl PHỤ l.ục DANH SÁCH BỆNH NHÂN STT Mà bệnh nhãn Họ tên Tuồi Giới Địa chi ƯTG Bùi Vãn o 55 Nam Hưng Yên ƯTG2 Hoàng Tuấn Đ 40 Nam Hà Nội ƯTG3 Nguyền Vân T 59 Nam Hịa Bình UTG4 Hồng Cao Đ 60 Nam Thanh Hóa UTG Nguyền Vân Q 67 Nam Hưng Yên ƯTG6 Nguyền Vân K 54 Nam Sem La ƯTG7 Hoàng Trọng Q 64 Nam Thanh Hóa ƯTG8 Nguyền Minh T 66 Nam Son La UTG9 Dặng Khắc Đ 55 Nam Bae Giang 10 UTG 10 Là Văn T 54 Nam Nam Định 11 UTG 11 Vù Duy B 68 Nam Thái Binh 12 ƯTO 12 Vù Vãn p 60 Nam Thái Nguyên 13 ƯTG 13 Phạm Ngọc N 53 Nam Phú Thọ 14 ƯTG 14 Trần Đức C 48 Nam Hà Nội 15 UTG 15 Nguyen Vãn D 51 Nam Hà Nội 16 ƯTG 16 Nguyen Văn T 53 Nam Thãi Binh 17 ƯTG 17 Hoàrg Xuân s 67 Nam Hà Tfnh 18 ƯTG 18 Trần Anh D 60 Nam Ninh Bình 19 UTG 19 Nguyền Thị T 60 Nừ Hưng Yên « ■> -■c -ÍM -W ÍM Qỉ Qỉ ugc ugcV V Hl Hl H& 20 ƯTG 20 Nguyền Vàn T 61 Nam Bấc Giang 21 ƯTG21 Phan Hồng p 63 Nam Phú Thụ 22 ƯTG22 Vương Hùng s 63 Nam Hà Nội 23 UTG23 Vương Vãn c 57 Nam Hà Nội Mới 24 ƯTG 24 Lẽ Huy T 67 Nam Thanh Hóa 25 ƯTG 25 Trần Đửc T 51 Nam Tuyên Quang 26 ƯTG26 Phạm Vãn 11 68 Nam Nam Dịnh 27 ƯTG27 Nguyền Trọng K 51 Nam Nghệ An 28 UTG 28 Quàng Vãn T 59 Nam Sơn l.a 29 ƯTG 29 Đỏ Văn T 47 Nam Hịa Binh 30 UTG30 Hồng Van T 53 Nam Hai Phơng -■c -ÍM Qỉ ugc V Hl ... biền mô tế vùng bào promoter gan ? ?đột đàlà gen áp3.33% TERT dụng kỳ bệnh thuật nhân giai ung trinh thư tự bệnh nhân đê phát ung thư biểu mô biến tế vùng bão gan promoter với tý gcn lộ TERT đột. .. biển vùng promoter ” thực gen TERT vói mục bệnh tiêu: nhân ung thư định biêu dược mô đột tế biển bào gan promoter gen TERT ưẽn bệnh CHlTơNG TÔNG QUAN 1.1 Tồng quan ung thir biếu mõ tế bào gan. .. sinh ung thư gen ức chế ung thư tương ứng Ví ung thư biêu mơ tế bào gan thư? ??ng xây bệnh lý gan xơ gan hầu het bệnh nhân đưục chân doán giai đoạn muộn cùa bệnh, nên tiên lượng thư? ??ng kẽms Ưng thư