VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘIN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘII HỌC MỞ HÀ NỘIC MỞ HÀ NỘI HÀ NỘII KHOA CÔNG NGHỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI SINH HỌC MỞ HÀ NỘIC —œ– KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG HỐ CHẤT DIỆT CƠN TRÙNG CỦA LOÀI MUỖI TRUYỀN BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT AEDES AEGYPTI LINNAEUS,1762 TẠI THÀNH PHỐ NHATRANG, TỈNH KHÁNH HOÀ Giáo viên hướng dẫn : TS Phạm Thị Khoa Sinh viên thực : Ngơ Trọng Hịa Lớp : KSCNSH - 0605 Khố : 2006-2010 LỜI CẢM ƠN Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ban giám hiệu Viện Đại Học Mở Hà Nội quý thầy cô khoa Cơng Nghệ Sinh Học nhiệt tình dạy dỗ tạo điều kiện học tập tốt cho suốt năm vừa qua Để hồn thành khố luận này, trước hết xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Phạm Thị Khoa- Trưởng Khoa Hóa Thực Nghiệm, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung Ương người hướng dẫn tận tình tơi suốt q trình thực tập nghiên cứu hoàn thành đề tài Ngoài ra, tơi xin cảm ơn cán phịng Hóa Thực Nghiệm, Viện Sốt rét – Kí sinh trùng – Côn trùng Trung ương giúp đỡ bảo cho Tôi xin cảm ơn Khoa Sinh Học Phân Tử, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung Ương bạn sinh viên nhóm thực tập góp ý giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn gia đình, người thân bạn bè giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày 19 tháng năm 2010 Sinh viên Ngơ Trọng Hịa BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT AchE Acetylcholinesterase ADN(DNA) Acid deoxyribonucleic CDNB Chloro dinitrobenzen DDT Dichloro-diphenyl-trichloroethane dNTP Deoxynucleotide triphotphat EST Esterase GABA γ-aminobutyric acid GST Glutathion-s-transferase Kdr Knockdown resistance: Kháng “ngã gục” IR Insecticide réistance: Kháng hóa chất diệt trùng SD/SXHD Sốt Dengue/Sốt xuất huyết Dengue WHO World Health Organization: Tổ chức Y tế Thế giới MFOs Multi Function Oxidases PCR Polymerase Chain Reaction: Phản ứng khuếch đại gen MỤC LỤC Mở đầu………………………………………………………………………… CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN…………………………………………………… 1.1 TÌNH HÌNH BỆNH SỐT DENGUE/ SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE (SD/SXHD) TRÊN THẾ GIỚI………………………………………… 1.2 TÌNH HÌNH BỆNH SỐT DENGUE / SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE (SD/SXHD) TẠI VIỆT NAM …………………………… 1.3 MUỖI AEDES AEGYPTI VÀ VAI TRÒ TRUYỀN BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT…………………………………………………………8 1.3.1 Đặc điểm phân bố Ae.aegypti Việt Nam………………… 1.3.2 Một số đặc điểm sinh học Ae.aegypti ……………………… 1.3.3 muỗi Ae.aegypti tác động hố chất diệt trùng…… 10 1.4 SỰ KHÁNG HỐ CHẤT DIỆT Ở MUỖI………………………… 14 1.4.1 Các chế kháng hố chất muỗi……………………… 16 1.4.1.1 Kháng chế trao đổi chất……………………………….16 1.4.1.2 Kháng đột biến gen……………………………………… 20 1.4.2 Các phương pháp phát giám sát kháng hoá chất…… 21 1.4.2.1 Phương pháp thử sinh học (Bioassays)…………………… 21 1.4.2.2 Phương pháp thử hoá sinh (Biochemical assays) vá sinh học phân tử…………………………………………………………… 22 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………………………………….26 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU…………………………………… 26 2.2 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 26 2.2.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu………………………………… 26 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu………………………………………… 28 2.2.2.1 Phương pháp thu mẫu……………………………………… 27 2.2.2.2 Phương pháp thử nghiệm sinh học theo WHO/ CDS/ CPS / MAL/ 98.12…………………………………… 27 2.2.2.3 Phương pháp phân tích AND……………………………… 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………… 41 3.1 KẾT QUẢ THỬ NHẠY CẢM CỦA MUỖI AE.AEGYPTI VỚI CÁC HỐ CHẤT DIỆT CƠN TRÙNGTHEO PHƯƠNG PHÁP CỦA WHO/ CDS/CPC/MAL/98.12………………………………………… 41 3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ADN CỦA MUỖI AE.AEGYPTI BẰNG KĨ THUẬT PCR ĐA MỒI ĐẶC HIỆU…………………………………… 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………… 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… 49 Viện Đại Học Mở Hà Nội Luận văn tốt nghiệp Đại Học Mở đầu Muỗi Aedes aegypti véc tơ truyền bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue (SD/SXHD) Mỗi năm giới có khoảng 50-100 triệu người nhiễm virus Dengue [39,45 ] Tại Việt Nam, bệnh lưu hành nhiều thành phố trị trấn, đặc biệt thành phố lớn Hiện bệnh SD/SXHD chưa có vắc xin hiệu để phịng bệnh khơng có thuốc trị đặc hiệu Vì vậy, biện pháp để phòng chống SD/SXHD phịng chống véc tơ [14] Có nhiều biện pháp phịng chống véc tơ Tuy nhiên chưa có biện pháp hiệu biện pháp phun khơng gian hóa chất diệt côn trùng để diệt muỗi trưởng thành nhiễm vi rút ổ dịch [14] Trong năm gần đây, việc sử dụng rộng rãi hóa chất làm cho nhiều lồi muỗi kháng hóa chất kháng có nguy lan rộng khó kiểm sốt Theo WHO, 2006 có 500 lồi chân đốt có ý nghĩa y học kháng với hố chất diệt trùng Trong có gần 50% số lồi muỗi véc tơ sốt rét, sốt xuất huyết dengue, truyền bệnh giun chỉ, có tới 62 lồi muỗi Anopheles Người ta chứng minh có kháng chéo DDT với nhóm Pyrethroid An gambiae Châu Phi kháng với permethrin, deltamethrin, lambda - cyhalothrin An sacharovi kháng với DDT, propoxur, bendiocarb, permethrin lambda - cyhalothrin Thổ Nhĩ Kỳ (WHO, 1996) Loài muỗi truyền giun Culex quinquefasciatus liệt vào danh sách loài muỗi đa kháng Một số bệnh từ cổ xưa quay trở lại mơi trường nhiễm muỗi kháng hóa chất (WHO, 2006) [27] Ở Việt Nam từ năm 1975 người ta phát tính kháng hố chất diệt lồi muỗi truyền giun Culex quinquefasciatus, loài muỗi truyền bệnh sốt xuất huyết dengue Aedes aegypti Loài muỗi truyền bệnh sốt rét ven biển Nam Bộ An epiroticus, loài An sinensis, An vagus, … [7] Ngơ Trọng Hồ – KSCNSH 0605 Viện Đại Học Mở Hà Nội Luận văn tốt nghiệp Đại Học Muỗi số lồi trùng kháng với hóa chất diệt hai kiểu [47] Kiểu kháng thứ thông qua trao đổi chất [50], chế kiểu kháng biểu mức gen mã hóa enzym có chức giải độc cytochrome P450, esterase GST, nên làm giảm đáng kể tác dụng loại hóa chất diệt trùng Kiểu kháng gặp nhiều lồi muỗi An.gambie, An.minimus [48, 51] khơng di truyền Kiểu kháng thứ hai thông qua thay đổi gen, nên di truyền [47] Cơ chế kiểu kháng đột biến vị trí đích gen mã hóa protein liên quan đến chuyển hóa hóa chất, làm cho chất protein bị thay đổi dẫn đến chuyển hóa bị thay đổi theo chiều hướng giảm tác dụng Gen liên quan đến kháng hóa chất nhóm Pyrethroid mã hóa protein điều chỉnh điện cổng kênh Natri xuyên màng tế bào thần kinh muỗi, hay gọi gen kháng ngã gục (knockdown resistance gen – Kdr) Kháng Kdr gây kháng chéo với số hóa chất khác DDT lindan [41] Hiện nay, muốn đạt hiệu phun hoá chất diệt làm giảm mật độ muỗi đốt người vào mùa phát triển đặc biệt dịch bệnh muỗi truyền ngày gia tăng người ta phải tăng liều lượng hoá chất hoăc thay đổi chủng loại hoá chất diệt Việc sử dụng hóa chất tạo áp lực chon lọc quần thể muỗi làm thay đổi cấu trúc di truyền với quần thể Theo dõi, giám sát kháng hố chất lồi muỗi truyền bệnh thử nghiệm sinh học cách hệ thống đồng thời kết hợp nghiên cứu với số phương pháp di truyền kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu, góp phần tìm chế kháng hố chất diệt phục vụ cho chiến lược phịng chống bệnh muỗi truyền, lựa chọn biện pháp thích hợp, tránh lãng phí gây nhiễm mơi sinh nhu cầu cấp thiết [3,27] Ngơ Trọng Hồ – KSCNSH 0605 Viện Đại Học Mở Hà Nội Luận văn tốt nghiệp Đại Học Trong bối cảnh đó, chúng tơi tiến hành đề tài: “Bước đầu nghiên cứu tính kháng hóa chất diệt trùng loài muỗi truyền bệnh SXH Ae.aegypti Linnaeus, 1762 thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa” Với mục tiêu: Xác định mức độ nhạy cảm muỗi Ae.aegypti thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa với số hóa chất diệt trùng phương pháp thử sinh học theo WHO/CDS/CPC/MAL/98.12 Phát điểm đột biến gen mã hóa cho protein xuyên màng kênh vận chuyển ion Natri liên quan đến tính kháng hóa chất nhóm Pyrethroid DDT kĩ thuật PCR đa mồi đặc hiệu muỗi Ae.aegypti Linnaeus, 1762 thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hịa Ngơ Trọng Hoà – KSCNSH 0605 Viện Đại Học Mở Hà Nội Luận văn tốt nghiệp Đại Học CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH BỆNH SỐT DENGUE / SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE ( SD/SXHD ) TRÊN THẾ GIỚI : Biểu nặng bệnh sốt dengue (dengue fever, DF) hay sốt xuất huyết dengue (denguhemorrhagic fever, DHF) hội chứng sốc dengue (dengue shock syndrome, DSS) gây Dengue virus (chi Flavivirus, họ Flaviviridae) Virus có chủng huyết khác DEN-1, DEN-2, DEN-3 DEN-4 Bệnh nhân nhiễm với chủng virus có khả miễn dịch suốt đời với chủng virus Chính mà người sống vùng lưu hành dịch SD/SXHD mắc bệnh sốt xuất huyết nhiều lần đời SD/SXHD chủ yếu bệnh vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Bệnh nhân nhiễm virus dengue có triệu chứng lâm sàng khác tùy người Bệnh biểu hội chứng nhiễm virus không đặc hiệu bệnh lý xuất huyết trầm trọng đưa đến tử vong [32] SD/SXHD bệnh nhiễm virus cấp tính lây truyền muỗi từ người bệnh sang người lành thường gặp người Trong năm gần bệnh trở thành mối quan ngại lớn sức khỏe cộng đồng bình diện quốc tế Tồn giới có khoảng 2.5 tỷ người sống vùng có lưu hành bệnh Sự lan tràn mặt địa lý véc tơ truyền bệnh (muỗi) virus dẫn đến tăng cao tỷ lệ mắc bệnh vòng 25 năm qua, khả xuất dịch nhiều chủng huyết khác đô thị vùng nhiệt đới [34] Ngơ Trọng Hồ – KSCNSH 0605 ... Nội Luận văn tốt nghiệp Đại Học Trong bối cảnh đó, tiến hành đề tài: ? ?Bước đầu nghiên cứu tính kháng hóa chất diệt trùng lồi muỗi truyền bệnh SXH Ae. aegypti Linnaeus, 1762 thành phố Nha Trang, tỉnh. .. sinh học Ae. aegypti ……………………… 1.3.3 muỗi Ae. aegypti tác động hố chất diệt trùng? ??… 10 1.4 SỰ KHÁNG HOÁ CHẤT DIỆT Ở MUỖI………………………… 14 1.4.1 Các chế kháng hố chất muỗi? ??…………………… 16 1.4.1.1 Kháng chế... Nam Ae. aegypti phát triển mạnh vào tháng dến tháng 10 Vai trò truyền bệnh Ae. aegypti: Ở Việt Nam Ae. aegypti véc tơ truyền bệnh sốt xuất huyết Theo WHO (1980), thời gian ủ bệnh muỗi Aedes aegypti